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Artículo de método

Técnica quirúrgica para la implantación de la ingeniería tisular injertos vasculares y posterior

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DOI:

10.3791/52354

⸱

3 de abril de 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology & Bio-Physics, State University of New York Buffalo School of Medicine, 2Department of Pediatrics, State University of New York Buffalo School of Medicine, 3Department of Chemical and Biological Engineering, State University of New York Buffalo School of Engineering

En este artículo

Resumen

Un protocolo de paso a paso para la colocación inter-posicional de ingeniería tisular buques (TEV) en la arteria carótida de una oveja mediante anastomosis de extremo a extremo y la evaluación digital en tiempo real en vivo hasta el sacrificio de animales.

Resumen

El desarrollo de la ingeniería de tejidos vasculares (TEV) es avanzado por la capacidad de VETs implantes rutinaria y eficaz (4-5 mm de diámetro) en un modelo animal de gran tamaño. Un protocolo paso a paso para la colocación de inter-posicional de la evaluación digital de TEV y en tiempo real de la TEV y las arterias carótidas nativas se describe aquí. En vivo monitoreo es posible gracias a la implantación de sondas de flujo, catéteres y cristales ultrasónicos (capaz de registro de los cambios dinámicos de diámetro de TEVs implantados y arterias carótidas nativos) en el momento de la cirugía. Una vez implantados, los investigadores pueden calcular los patrones de flujo sanguíneo arterial, presión arterial invasiva y diámetro de la arteria produciendo parámetros como la velocidad de la onda de pulso, índice de aumento, las presiones de pulso y el cumplimiento. La adquisición de datos se lleva a cabo utilizando un único programa de ordenador para el análisis de toda la duración del experimento. Tales datos invaluable da una idea de remodelación de la matriz TEV, su resemblance / a controles simulados nativos y el rendimiento general del TEV en vivo.

Introducción

El enfoque principal para el desarrollo de TEV ha sido la de proporcionar un sustituto para el reemplazo de injerto autólogo cuando los vasos autólogos no están disponibles y limitar los donantes vista morbilidad. Por ejemplo, el número de cirugías de revascularización coronaria por año ha superado los 350.000 en los EE.UU., y la fuente ideal de injertos adecuados sigue siendo la arteria mamaria interna izquierda, arteria descendente anterior coronaria y la vena safena 1. Dado que muchas personas que sufren de enfermedades vasculares pueden no tener las arterias y venas adecuadas para la sustitución de injerto autólogo, el desarrollo de TEVs por lo tanto se ha convertido en un intenso campo de la investigación durante décadas 1-6. Mientras que la ingeniería y optimización de nuevos VETs han sufrido muchos avances, informes sobre las técnicas quirúrgicas empleadas para implantar las VETs mismos no ha sido un tema de tanta discusión intensa. Más bien, los protocolos relativos a la implantación de TEVs en modelos animales se dejaron en gran partehasta investigar los investigadores.

La siguiente manuscrito muestra cómo implantar TEVs mediante la utilización de un enfoque anastomosis de extremo a extremo. Este procedimiento se ha optimizado mediante el uso de un patrón de sutura de la anastomosis específica, la estabilización de técnica de sutura, la optimización de la tensión longitudinal y la adición de la instrumentación de monitoreo in vivo. Este método se contrasta con algunas de las muchas variaciones que se han utilizado previamente. Además, este procedimiento se describe cómo adquirir parámetros tales como la presión arterial, la TEV diámetro / cumplimiento y el caudal a través de la TEV después de la cirugía hasta la explantación. Esta recogida de datos proporciona un análisis indispensable de la TEV mientras está en el proceso de remodelación.

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Protocolo

NOTA: Este protocolo ha sido aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Nueva York en Buffalo.

Preparación 1. Pre-quirúrgico

  1. Utilice ovejas (cross Dorset, hembra, de aproximadamente 1-3 años de edad con un peso de 40-60 kg) para el siguiente estudio. Administrar ciclosporina A (200 mg / día), aspirina (975 mg / día), y Coumadin (20-30 mg / día) por vía oral, comenzando 3 días antes de la cirugía y continuar durante la duración de todos los estudios.
  2. Asegúrese de que la oveja ha ayunado 12 h antes de la cirugía (alimento normal = 1,8 kg y 0,4 kg de heno de granos).
  3. Esterilizar todos los suministros quirúrgicos utilizando un autoclave de vapor a 121 ° C y 15 psi durante 30 min.
  4. Coloque los siguientes elementos en una hora desecador paraformaldehído 48 antes de la cirugía: sondas de 4 mm de flujo Doppler, 1 mm cristales ultrasónicos, permanentes catéteres arteriales, tubos de extensión y 42 "Tygon Tubería.
    NOTA: Una tabla de equipo médico pertinente necesaria para lacirugía y para la esterilización se enumeran en la Tabla 1. Pre-colocación de la instrumentación en el tubo Tygon en este paso le ayudará a ahorrar tiempo durante la cirugía.
    1. Etiquete cada extremo de las sondas, catéteres y cristales como la izquierda y la derecha, en su caso.

2. Operación Quirúrgica

  1. Inducir ovejas para la anestesia con diazepam (0,5 mg / kg) y ketamina (4 mg / kg) por vía intravenosa (IV). Alternativamente, utilizar Telazol (4 mg / kg) IV.
    1. Realizar intubación orotraqueal con un tubo endotraqueal diámetro 8,5-10,0 mm interno esposado 7.
    2. Administrar anestesia inhalatoria a través de un circuito de reinhalación con un ventilador de las mareas volumen (7-10 ml / kg) o un ventilador de presión regulada (15-20 cm H 2 O). Use un vaporizador de precisión para administrar isoflurano o sevoflurano en una cantidad apropiada (3% -4% inicialmente) para llegar a un medio a lo profundo del escenario anestésico quirúrgico. La concentración alveolar mínima paraovejas es de 1,4% o 1,9%, respectivamente 8.
    3. Evaluar la profundidad anestésica mediante la observación de la respuesta motora a los estímulos, reflejo palpebral, posición de los ojos, y la frecuencia cardíaca. De la saturación de oxígeno en la sangre (95% -100%) utilizando la oximetría de pulso, concentración de CO 2 (45-55 mmHg) en los gases espiratorios utilizando capnografía y mantener la temperatura corporal durante el procedimiento (38,5-39,5 ° C) usando una manta de calentamiento auto regulado.
  2. Afeitado lana de todo el cuello de la oveja, y más de un vena cefálica, utilizando una cuchilla # 40 en máquinas de cortar estándar. Preparar la piel de ambos sitios para la cirugía utilizando un 70% de alcohol isopropílico y 7,5% matorrales betadine gasa saturada. Comienza con una gasa alcohol para facilitar la extracción de aceites de la piel. Alternar entre gasas betadine y alcohol gasa tres veces.
  3. Coloque ovejas en la mesa de operaciones en decúbito dorsal en la parte superior de una manta térmica. Pasar una sonda orogástrica de tamaño medio para permitir la expulsión pasiva de los contenidos estomacales. Extender elcuello y de oveja utilizar amortiguación de apoyo, según sea necesario para mantener la colocación.
    1. Realice una limpieza aséptica final utilizando 7,5% betadine gasa embebida y deje reposar durante 5 minutos antes de la cirugía.
  4. Administrar líquidos por vía intravenosa (solución de lactato de Ringer o solución salina 0,9%) a 10 ml / kg / hora a través de un angiocath colocado en la vena cefálica. Administrar antibióticos intraoperatorios y analgesia: Penicilina G procaína 6.600 U / kg por vía intramuscular (IM), gentamicina 1,6 mg / kg IM, y buprenorfina 0,005-0,01 mg IV o IM.
  5. Hacer una incisión cm ~ 12 longitudinalmente sobre el cuello de la línea media ventral usando electro cauterio. Aislar arterias carótidas izquierda y derecha (~ 6 cm) mediante la eliminación de tejido conectivo usando una técnica de disección roma. Ate y cauterizar microvasos de ramificación de las arterias carótidas para minimizar la hemorragia.
  6. Mantener la esterilidad mediante la utilización (a no estéril) enfermera quirúrgica para ayudar con la madriguera todos (sonda de flujo cableado y tubos, alambres de cristal ultrasónicosy el tubo de catéter) en la capa subcutánea de la piel. Use un trocar romo, que sale a través de la incisión preparada quirúrgicamente en el cuello dorsolateral.
    1. Alcanzar bajo el paño estéril y gire la cabeza de las ovejas para que el lado del cuello puede ser visualizado bajo la sábana.
    2. Utilice una pinza hemostática curva 8 cm de túnel a través del espacio subcutáneo entre la incisión en el cuello en la línea media ventral y el lado del cuello. Abra y cierre la pinza hemostática para diseccionar sin rodeos un espacio para la tubería ~ 1.5 cm de ancho. Las puntas de la pinza hemostática deben residir a medio camino entre la cabeza y los hombros, a unos 10 cm caudal a la oreja derecha o izquierda. Gire la pinza hemostática para que las puntas están apuntando hacia la piel superficial.
    3. Alcance bajo el paño estéril y hacer una incisión de 1,5 cm a través de la piel, sobre las puntas de la pinza hemostática con una cuchilla # 11 estéril. Visualice la punta de la pinza hemostática para confirmar una salida clara a través de la piel.
    4. Pase el tubo de Tygon que contiene unall cableado y la tubería a través del túnel subcutáneo. Mantenga los cables y los tubos por encima del campo estéril.
    5. Llegar debajo de la cortina para retirar el tubo de Tygon exterior del cuello, exponiendo el cableado implantado, ya que deja el cuello de la oveja. Tire de las líneas individuales para minimizar la holgura en el espacio subcutáneo. Deje suficiente distancia para fijar correctamente la instrumentación de la arteria.
  7. Coloque 4 mm sondas de flujo Doppler en ambas arterias carótidas y alcanzar una lectura inicial (Figura 1). Administrar 100 U / kg de heparina IV 30 min antes de la sujeción de la arteria.
  8. Continuar la administración de heparina a 100 U / kg / hr hasta el final de la cirugía. Sujete la arteria carótida utilizando no trituración pinzas vasculares y extirpar una porción (aproximadamente 4 cm de longitud). La velocidad de flujo de la carótida contralateral aumentará 50% -100% para mantener el flujo de sangre al cerebro.
    NOTA: Es posible limitar el estiramiento longitudinal por retroceso del vaso nativo mediante la eliminaciónsegmentos más cortos que están sustituyendo y / o estirar la arteria nativa con vascular abrazaderas para acortar brecha hasta que se complete el procedimiento de anastomosis completo. Esto ayudará a limitar la tensión en las suturas de retención individuales y el injerto implantado.
  9. Suturar la TEV en su lugar con puntos interrumpidos simples con 7-0 prolina ETHALLOY doble sutura monofilamento armado. Si es necesario, aplique relajantes musculares lisas vasculares como la papaverina (15 mg / ml) o nicardipina (1,25 mg / ml) por vía tópica a la vasculatura nativa con el fin de evitar la vasoconstricción lo que dificultaría la sutura de la anastomosis.
    NOTA: Comience colocando suturas con aproximadamente 1 mm de distancia. Esto puede variar mucho de un caso a otro. La composición y el espesor de TEV afectarán a la distancia efectiva entre las suturas. A medida que el espesor del tejido nativo o TEV disminuye, puede ser necesario colocar las suturas más juntos.
    1. Primero ancla cuatro puntos de la TEV a la arteria nativa mediante la colocación de dos s opuestastitches en ambos extremos proximal y distal (Figura 2 -Di). Mantenga cada ancla enseñado usando pinzas hemostáticas.
      NOTA: descripciones proximal y distal están en referencia a la dirección del flujo de sangre a través del papel.
    2. Añadir 5-6 suturas más en el lado superficial de ambos los extremos proximal y distal para comenzar la anastomosis. (Figura 2 -Pr). Simultáneamente gire el vascular abrazaderas 180 grados.
    3. Vuelva a establecer la tensión en las suturas de anclaje. Añadir adicional (5 a 6) suturas interrumpidas a extremos proximal y distal en el lado girada de la TEV.
  10. Una vez que el TEV se sutura firmemente en su lugar, gire de nuevo a la posición original y retire el vascular abrazaderas de uno a la vez, pinza distal primero. Un ligero sangrado en los sitios de anastomosis es común. Esto puede resolver de forma natural después de varios minutos de liberación de la abrazadera y reclamping o exigir la colocación de suturas adicionales. Coloque la sonda de flujo Doppler (Figura 3-FL) De nuevo en proximal de la arteria nativa de flujo de sangre que entra en el TEV y la velocidad de flujo del monitor.
    NOTA: Espere que los caudales de la carótida izquierda y la derecha se equilibren después de aproximadamente 15 min. Si la velocidad de flujo en la arteria carótida con implantado TEV cae de manera constante, es posible que el TEV es la coagulación. Otras anormalidades posibles respecto al flujo pueden ser atribuidos a la constricción de la proximal arterias nativas o distal a la TEV. Si esto ocurre, el uso de relajante del músculo liso vascular adicional puede ser aplicado, y el vaso nativo debería volver a un tono basal después de 30-60 min tras el cierre de tejido sobre el sitio del injerto.
    1. Si lo desea, extirpar la arteria carótida contralateral y se sutura en su lugar como un control "Sham". Esto es más clínicamente relevante que dejando la arteria carótida derecha sola y única fijación de la sonda de flujo, cristales ultrasónicos, y el catéter. Si se quiere un simulacro de control, realice esto antes de ir al paso 2.11.
  11. Sutura 1 mm cristales ultrasónicos (Figura 3 -CR1 CR2) a los lados de la VET oponerse utilizando 7-0 Proline. Hilo de sutura a través de la cabeza de cristal ultrasónico y cosa sólo a la capa superficial de la TEV.
  12. Cateterización de la arteria mediante un modificado 18 G catéter con un bolsito de teflón tejido (Figura 3- Ca y Figura 4A). Coloque el catéter distal a la TEV en tejido arterial nativo.
    1. Suturar la tapeta de la pared arterial con 5/0 Ethibond para controlar el sangrado. Utilice ciclohexanona para adherir el tubo capilar al catéter que ha sido purgado con solución salina. Utilice la tubería como una línea de extensión.
    2. Utilice un adaptador Stub 20 G Luer con un tapón de inyección SurFlo para sellar el extremo exteriorizado de tubo (Figura 4B). Para mantener la permeabilidad del catéter, obtener el volumen de cebado de la línea y lavarlo con 10 ml de solución salina y luego 5.000 U / ml de la inyección de heparina sódica cada 2-3 días.
  13. Registre la distancia entre la sonda de flujo y los cristales ultrasónicos, así como la distancia entre la sonda de flujo y el catéter. Esto permitirá a la velocidad de la onda de pulso que se calcula en relación con el software. Si no se necesitan estos cálculos, no implante de un catéter.
  14. Obtener una lectura intraoperatoria si se desea asegurar todo el material implantado es funcional (véase la sección 3).
  15. Asegure las líneas y cables implantados a la cercana musculatura utilizando 2/0 seda y una aguja cónica (Figura 3).
    1. Coloque la sonda de flujo vascular cable paralelo al buque, con el caudal de la sonda y el cable que se extiende cranealmente y, a continuación, hacer una "U-Turn" hacia la musculatura lateral. Fije el cable a la musculatura adyacente, usando seda 2-0 en una aguja cónica en dos lugares, de manera que la sonda de alambre o de flujo no es capaz de colocar cualquier cepa en el buque. Asegúrese suturas estén ajustadas, pero no apriete demasiado y estrangular musculatura (Figura 3).
    2. Suturar la línea de cables de cristal y arterial catéter a la musculatura lateral, lo que permite ~ 1,5 cm de holgura, similar a los pasos anteriores para asegurar sonda de flujo (Figura 3).
    3. Grupo todos los cables y líneas juntas y anclarlos a la musculatura justo antes de salir a través de túnel subcutáneo, similar a los pasos anteriores.
  16. Cierre la zona quirúrgica con una sutura de Vicryl 2-0 en capas utilizando un patrón de sutura que se ejecuta en el salpicadero y subdérmico, corriendo colchón puntadas en la piel (salpicadero, la aguja no cortante, la piel, el corte de la aguja). Cerrar la incisión 1,5 cm en el cuello dorsal alrededor de los cables y líneas exteriorizados usando Vicryl 2/0 y una aguja de corte.
  17. Coloque los cables de sonda de flujo, líneas de catéteres y alambres de cristal de ultrasonidos en una bolsa (10 cm x 10 cm) que se sutura firmemente a la piel de las ovejas (Figura 5 - después de la recuperación).
  18. Poco a poco dejar de depender de las ovejas de la anestesiay el ventilador volumen corriente y luego retirar la intubación a las ovejas cuando se reanuda la respiración espontánea. Retire la angiocath inserta en la vena cefálica y el vendaje de ser necesario.
  19. Vendar el cuello usando un ungüento antibiótico triple en las incisiones, una almohadilla Telfa, gasa rodillo tensor y Elasticon.
  20. Administrar analgesia postoperatoria: flunixina meglumina 2,2 mg / kg IM una vez durante la recuperación, luego 1.1 mg / kg IM una vez al día durante dos días, buprenorfina 0,005-0,01 mg IV o IM dos veces al día durante un día.

3. En Monitoreo Vivo

  1. Coloque las ovejas en el carro móvil para garantizar la seguridad adecuada. Esto permite a las ovejas para mantener la calma y consciente, sin comprometer el hardware. Es posible que necesite para aclimatarse ovejas para la compra 2 o 3 veces durante 30 minutos antes de obtener grabaciones de instrumentación.
  2. Retire todos los cables y las líneas de la bolsa y conectarse a los dispositivos de vigilancia. Conecte la sonda de flujo a un medidor de flujo, los cristales de 1 mm de ultrasonidos conectado a TRBCaja -USB y catéteres líneas a transductores de presión. Un diagrama de flujo de esta configuración se proporciona (Figura 6).
  3. Calibrar sondas de flujo y transductores de presión antes de la adquisición de datos.
    NOTA: Debido a la variabilidad potencial entre las versiones de software y las diferencias en los equipos utilizados, calibraciones y ajustes variarán de un caso a otro.
  4. Utilizar un osciloscopio para afinar la medición de cristal Sonometrics, de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  5. Registrar los datos utilizando software informático (Figura 7). Rastros en la mitad superior de la figura 7 en el color blanco corresponde a la TEV implantado, mientras trazas en la mitad inferior de color rojo corresponde al Sham / nativos. Tanto para el TEV y Sham la velocidad de flujo (ml / min), la presión arterial de la sangre (mm Hg) y el diámetro (mm) se registran en vivo.
  6. Registro durante al menos 1 min sin perturbaciones. Exportar estos datos para un análisis más detallado. Después de la grabación, DISCONNect todos los cables y lugar de nuevo en la bolsa se sutura en el cuello de la oveja.

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Resultados

Más de 30 ovejas han sido sometidos a la técnica quirúrgica se describe en este informe para la implantación de TEV (en prensa) 9. Una tabla que resume las más recientes operaciones de ovejas después de optimización de protocolos se muestran en la Tabla 2. Todas las ovejas recuperados después de la implantación TEV sin complicaciones potencialmente mortales. En algunos animales, la fibrosis se observó en la arteria nativa cerca de la punta del catéter arterial. No se ha observado un aumento s...

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Discusión

El propósito de este informe es proporcionar un procedimiento fiable y reproducible para VETs implantes de interés en la arteria carótida ovina. Las arterias carótidas nativas de los animales utilizados en este modelo fueron 0,5-0,75 mm de espesor y 4.5-5 mm de diámetro exterior. La técnica quirúrgica descrita aquí ha sido un éxito para la implantación VETs de geometrías variables que miden 0,25 a 1 mm de espesor, de 4-5 mm de diámetro exterior y 4 cm de longitud, con gran éxito la prueba efectiva de hasta 3 meses de du...

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Divulgaciones

No hay divulgaciones que informar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Corazón y Pulmón (R01 HL086582) y el Fondo de Células Madre de Ciencias de Nueva York (NYSTEM, Contrato #   C024316) a STA y DDS ilustraciones utilizadas en vídeo JoVe fueron completados por Juan Nyquist; Ilustrador médico de la Universidad Estatal de Nueva York en Buffalo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Transductor de presiónBecton DickinsonP23XL-1Cantidad: 1+ (1 para cada arteria).
Utilizado con cúpulas de diafragma llenas de agua.
Caja de amplificadores y transductoresGould5900 Acondicionador de señal Cantidad de jaula: 1.
Se deben incluir dos transductores y amplificadores en la jaula. Si bien esta unidad específica puede ser descontinuada, otros transductores de presión disponibles comercialmente con una salida BNC/analógica se comunicarán con el equipo Sonometrics.
Consola T403 con módulo de caudalímetro perivascular TS420 (x2)Transonic Systemsy TS420 (x2)Cantidad: 1.
Las sondas de flujo que miden el flujo a través de cada una de las arterias carótidas se conectarán a cada una de las unidades TS420.
unidad de medición ultrasónica digitalSonometricsTR-USBCantidad: 1
Sonda de flujo Precision S-Series 4  mmSistemas Transónicos Inc.MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GACantidad: 2
1  mm Sonometrics CrystalsSonometrics Systems1R-38S-20-NC-SHCantidad: 2-4 (2 para cada arteria)
Catéter para implanteBD (Becton Dickinson)  381447Cantidad: 1+ (1 para cada arteria).
El catéter se corta y se asegura al tubo de microperforación, se utiliza un estilete para la inserción.
Tubo de microperforaciónTygon Norton Performance Plastics(AAQ04127) Formulación S-54-HLCortado a medida para un juego de extensión
Luer Stub AdapterBD (Becton Dickinson)427564 (calibre 20)Cantidad: 1+ (1 por cada catéter arterial)
Surflo Injection PlugTerumoSR-IP2Cantidad: 1+ (1 por cada catéter arterial)
MeadoxPTFE (Teflón) Fieltro19306Corte a medida.
El fieltro de PTFE utilizado en nuestros estudios fue descontinuado. Sin embargo, empresas comparables como " malla quirúrgica" ofrecer productos que sean equivalentes.
Módulo T403 de

Referencias

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