Method Article

La correlación de Gene-específica de ADN de metilación cambios con la expresión y actividad transcripcional de astrocíticos KCNJ10 (Kir4.1)

DOI:

10.3791/52406

⸱

September 26th, 2015

 , 
1Department of Cell Developmental and Integrative Biology, University of Alabama at Birmingham

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La metilación del ADN es capaz de mantener niveles estables de expresión génica, así como de permitir cambios dinámicos en la expresión génica en respuesta a una variedad de estímulos. Detallamos técnicas que permiten el estudio de los cambios específicos de genes en la metilación del ADN y el efecto de estos cambios en la expresión génica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La metilación del ADN sirve para regular la expresión génica a través de la unión covalente de un grupo metilo a la posición C5 de una citosina en un dinucleótido de citosina-guanina. Si bien la metilación del ADN proporciona cambios duraderos y estables en la expresión génica, los patrones y niveles de metilación del ADN también están sujetos a cambios en función de una variedad de señales y estímulos. Como tal, la metilación del ADN funciona como un regulador poderoso y dinámico de la expresión génica. El estudio de la neuroepigenética ha revelado una variedad de estados fisiológicos y patológicos que se asocian con cambios globales y específicos de genes en la metilación del ADN. Específicamente, existen correlaciones sorprendentes entre los cambios en la expresión génica y la metilación del ADN en los trastornos neuropsiquiátricos y neurodegenerativos, durante la plasticidad sináptica y después de una lesión del SNC. Sin embargo, a medida que el campo de la neuroepigenética continúa ampliando su comprensión del papel de la metilación del ADN en la fisiología del SNC, es esencial delinear las relaciones causales con respecto a los cambios en la expresión génica y la metilación del ADN. Además, en lo que respecta al campo más amplio de la neurociencia, la presencia de grandes diferencias regionales y específicas de la célula requiere técnicas que aborden estas variaciones al estudiar el transcriptoma, el proteoma y el epigenoma. Aquí describimos la clasificación FACS de los astrocitos corticales que permite el examen posterior de la transcripción del ARN y la metilación del ADN. Además, detallamos una técnica para examinar la metilación del ADN, el análisis de fusión de alta resolución sensible a la metilación (MS-HRMA), así como un ensayo de promotor de luciferasa. Mediante el uso de estas técnicas combinadas, no sólo se pueden explorar los cambios correlativos entre la metilación del ADN y la expresión génica, sino también evaluar directamente si los cambios en el estado de metilación del ADN de una región génica determinada son suficientes para afectar a la actividad transcripcional.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La epigenética es el estudio de las modificaciones químicas que pueden afectar a la actividad transcripcional del genoma. Esencialmente, sin un cambio en la secuencia de ADN, las modificaciones epigenéticas como la metilación del ADN, la acetilación de histonas y la metilación de histonas son suficientes para alterar reversiblemente los patrones de expresión génica. La metilación del ADN, un potente regulador de la expresión génica, es la modificación epigenética mejor caracterizada. La metilación del ADN es la unión covalente de grupos metilo en la posición C5 de una citosina, típicamente la citosina de un dinucleótido de citosina-guanina, también conocido como sitio CpG. Las áreas que contienen una alta densidad de sitios CpG se conocen como islas CpG (CGI). Los CGI se asocian frecuentemente con sitios de inicio transcripcional (TSS) y promotores de genes 1-3. Por lo tanto, mientras que los cambios en la metilación del ADN en los CGI no siempre son concomitantes con cambios en la expresión o función celular, los cambios en la metilación del ADN en los CGI pueden ejercer una poderosa regulación sobre la actividad transcripcional 2.

Históricamente, se observó que la metilación del ADN era esencial en la embriogénesis, la impronta y el desarrollo, con pocos cambios en los niveles de metilación del ADN en las células postmitóticas (con la excepción de alteraciones en los genes relacionados con el cáncer) 4,5. Sin embargo, el campo de la neuroepigenética ha puesto de manifiesto un importante papel no relacionado con el desarrollo para la metilación del ADN. Específicamente, la epigenética cognitiva ha redefinido la metilación del ADN como un mecanismo altamente plástico integral en la mediación tanto de la activación transcripcional como de la represión de genes esenciales para el proceso de aprendizaje y memoria 6. Aparte de la epigenética cognitiva, los estudios que modelan la lesión isquémica y el dolor neuropático caracterizan la metilación del ADN como un mecanismo lábil que responde rápidamente a una variedad de lesiones del SNC 7-9. En lo que respecta a los astrocitos, varias líneas de evidencia sugieren que la metilación del ADN juega un papel importante en la astrogliogénesis. Fan et al., encontraron que la KO condicional de DNMT1 en células progenitoras neurales (NPCs) resultó en un desarrollo precoz de astrocitos concordantes con un estado global de hipometilación 10. Además, Perisic et al., concluyeron que los niveles diferenciales de metilación del ADN del promotor de GLT-1 mediaban niveles diferenciales de expresión del transportador de glutamato en la corteza y el cerebelo, enfatizando un papel en la metilación del ADN en el establecimiento de patrones específicos de la región cerebral de la expresión génica astrocítica 11. En general, numerosos estudios subrayan la naturaleza dinámica y lábil de la metilación del ADN en el SNC, ya que se ha demostrado que el medio ambiente, los fármacos y las lesiones cambian la metilación del ADN y, a menudo, la expresión génica 4,9. En conjunto, estos estudios neuroepigenéticos apuntan a la metilación del ADN como una diana terapéutica factible con el potencial de mitigar una variedad de patologías del SNC.

A medida que el campo de la epigenética amplía su comprensión del papel de la metilación del ADN en el neurodesarrollo y la enfermedad, el desafío de mover la metilación del ADN hacia un objetivo terapéutico es realizar estudios no solo correlativos, sino también causales que definan objetivos y sitios genéticos específicos. Además, el estudio de los cambios en la metilación del ADN específicos de la región del cerebro y el tipo de célula sigue siendo un desafío continuo y oportuno exclusivo del campo de la neuroepigenética. Este protocolo utiliza una variedad de técnicas que incluyen la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de astrocitos, el análisis de fusión de alta resolución sensible a la metilación (MS-HRM) y un ensayo de metilación luciferasa para investigar el estado de metilación del ADN de KCNJ10, un gen que codifica para Kir4.1. Kir4.1 es un canal de potasio específico de la glía que muestra patrones de expresión específicos de la región cerebral y de la célula en el SNC 12-16. La expresión de Kir4.1 aumenta al pasar de las regiones rostral a caudal del SNC, con la mayor expresión en la médula espinal 15. Aunque el canal se expresa en células ependimarias, oligodendrocitos y sus células precursoras, Kir4.1 se expresa predominantemente en astrocitos y se cree que es esencial para mantener los niveles homeostáticos de potasio, así como para apoyar la absorción de glutamato al establecer el potencial de membrana en reposo astrocítico a un -80mV hiperpolarizado 12,16-19. Es importante destacar que la expresión de Kir4.1 no es estática tanto durante el desarrollo como después de múltiples formas de lesión del SNC 20-25. Queríamos examinar la regulación epigenética de este canal, concretamente en los astrocitos durante el desarrollo. Las técnicas utilizadas ofrecen análisis de sitios CpG específicos y dirigidos a genes que proporcionan evidencia causal de un papel de la metilación del ADN en la regulación de la expresión génica KCNJ10. Estas técnicas se pueden aplicar a otros genes.

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Protocol

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Todos los animales fueron tratados de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud. El Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Alabama en Birmingham aprobó el uso de animales.

1. La obtención de ARN y ADN de un Enriquecido astrocíticos Población que utiliza fluorescente clasificación de células activadas (FACS) de astrocitos del tejido cerebral entera

  1. Animales tranquilo con CO 2 durante 1 minuto y luego decapitar rápidamente. Diseccionar cortezas como se describe en Albuquerque et al, 26.; no es necesario para eliminar meninges.
    Nota: Las ratas transgénicas que expresan eGFP bajo la S100β (un marcador de astrocitos) promotor se generaron por Itakura et al 27 y se utilizan para FACS clasificación de los astrocitos..
  2. Preparar homogeneizado de todo el cerebro usando un kit de disociación de papaína bajo condiciones no estériles de acuerdo con el protocolo del fabricante. Calor a activar la papaína a 37 ° C en baño de agua durante 10 minutos. Nota:Solución de papaína es proporcionada por el fabricante y contiene L-cisteína y EDTA (Ver Tabla de Materiales).
    1. Cortar o dremel un agujero en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml para permitir que la tubería que lleva 95% O 2: 5% de CO 2 que se introduce en un tubo cónico de cerrada (figura 1A). Coloque cortezas disecados en 10 mm placa de cultivo que contienen medios de disociación (MEM suplementado con glucosa 20 mM y penicilina / estreptomicina (500 U / ml) y se equilibró a 95% O 2: 5% de CO 2) y el uso de una hoja de afeitar limpia para picar el tejido en 1 x 1 mm 2 piezas.
  3. Tejido de transferencia utilizando 10 ml Pipetman manual de 50 ml tubo cónico que contienen solución de papaína. Permitir que el tejido se asiente a la parte inferior de la pipeta de transferencia antes de la descarga para minimizar la cantidad de medios de disociación prorrogados. Mantenga solución de papaína se equilibró a 95% O 2: 5% de CO 2 a través de la superficie de intercambio de gases durante la duración de la incubación. No burbuja papaína solutien. Incubar el tejido durante 20 minutos en 37 ° C baño de agua.
  4. Después de la incubación en solución de papaína, el tejido triturado 10 veces con una pipeta 10 ml de transferencia a baja velocidad. Centrifugar la suspensión celular nublado en 1000 xg durante 5 min a TA.
    1. Equilibrar solución de inhibidor de ADNasa / albúmina (proporcionado por el fabricante) a través de intercambio de gas de la superficie y volver a suspender las células sedimentadas en 3 ml de solución de inhibidor / albúmina de DNasa. Preparar gradiente comercial de densidad discontinuo, siguiendo las instrucciones del fabricante.
  5. Girar gradiente de densidad discontinua en 1000 xg durante 6 min. Aislar las células disociadas a partir de la parte inferior del tubo por la succión pellet parte inferior usando una pipeta.
  6. Vuelva a suspender las células disociadas en 2-3 ml de DPBS con 0,02% de albúmina de suero bovino y 1 mg / ml de DNasa o HEPES preferidos tamponadas medios de cultivo. Pasar a través de 40 micras filtro antes de FACS (Figura 2A). Mantener las células en hielo hasta la clasificación.
    1. Realizar FACS 28.
    2. Células de pellets de 1,5 ml tubos de centrifugación a 2.000 xg durante 5 min a 4 ° C.
      Nota: los astrocitos sedimentaron se pueden utilizar inmediatamente o mantenerse en -80 ° C hasta la extracción de ADN.
  7. Extracto de ARN y el ADN utilizando el método de aislamiento preferido 29 30. Evaluar ARN y la concentración de ADN y la calidad a través de espectrofotómetro y bioanalizador 31.
    Nota: Utilizar únicamente ARN de alta calidad y de ADN en los pasos siguientes, 260/280 = 2,0 a 2,2 y 1,8 a 1,9, respectivamente. Análisis Bioanalyzer es esencial para evaluar la degradación del ARN o la fragmentación del ADN. ARN o ADN pueden ser utilizados inmediatamente o almacenados en -80 ° C o -20 ° C, respectivamente, para estudios posteriores.

2. La evaluación de metilación del ADN de estado de un gen utilizando Análisis Melt metilación sensible a alta resolución (MS-HRMA)

  1. Introduzca la secuencia del gen de interés en software de mapas de metilación en línea preferido para identificar cualquier islas CpG en el gende interés 32.
    1. Diseño cebadores contra bisulfito convierten secuencia de ADN 33 y amplifican utilizando ADN polimerasa preferida de acuerdo con el protocolo del fabricante. Verificar el tamaño del producto amplificado mediante la ejecución de un gel de agarosa al 1% de ADN a 100 V durante 45 min. Cebadores Tienda en concentración madre de 20 micras de -20 ° C.
  2. Bisulfito convertir 500-1.000 ng de ADN de cada muestra y de ADN metilado normas que van desde 0 hasta 100% de la misma especie animal 34. Eluir las muestras para proporcionar una concentración de 20 ng / l. Verifique concentración de ADN convertida bisulfito mediante espectrofotómetro 31.
  3. Configuración 20 reacciones mu l para la amplificación de MS-GRH usando ADN polimerasa preferido y cebadores a las 5 de la concentración micras, de conformidad con la Tabla 1 y 2. Ejecute todas las muestras, incluyendo ADN y metilados normas FACS, por triplicado.
  4. Dependiendo de software de análisis, ajuste antes y después de iniciar y detener parámetrosalrededor de las transiciones de la curva de fusión. Set de inicio pre-fusión y los parámetros de parada antes de la fusión en lo que la diferencia entre los dos es desde 0,2 hasta 0,5 ° C. Establecer inicio posterior a la fusión y posterior a la fusión detener de manera similar. Extraer datos de diferencia de temperatura máxima para cada muestra.
  5. El uso de estándares ciento metilados (y-valor) y sus correspondientes diferencias de temperatura pico promedio (x-valor) generar una ecuación de regresión lineal (Figura 3A-B, Tabla 3.4). Utilice esta ecuación de regresión lineal para estimar el estado de metilación de muestras desconocidas 35.

3. Evaluar-metilado Hyper Promotor Actividad través Uso de ensayo de luciferasa

  1. Identificar las islas CpG de gen diana (Paso 2.1). Amplificar por PCR las regiones de interés 36 y el clon aguas arriba del gen informador de la luciferasa de la luciérnaga luc2 para producir plásmidos CpG-island-luc2 37.
  2. Linealizar 30 g de plásmido CpG isla luc2 través de la restriccióndigestión con enzimas de 38. Verificar los sitios de digestión de restricción y evitar cortes dobles utilizando el software de corte preferido 38. Heat-inactivar enzimas a temperatura y duración adecuada digestión siguientes de acuerdo con el protocolo del fabricante. Pérdida mínima de ADN se produce durante el paso de linealización.
  3. Metilato plásmidos linealizadas utilizando CpG metilasa (M.Sssl) O / N a 30 ° C o dejar sin tratar fabricante de protocolo siguiente a excepción de los siguientes ajustes.
  4. Realizar 50 reacciones mL.
  5. Utilice 5 unidades de CpG metilasa para metilar 700 ng de plásmido linealizado.
  6. Ejecute reacciones O / N de 13 a 19 h.
  7. Después de la reacción metilasa de CpG, realice la limpieza de ADN utilizando estándar, comercialmente membrana de gel de sílice disponibles limpiar kit de acuerdo con el protocolo del fabricante. Pérdidas significativas de ADN ocurren siguiente reacción metilasa de CpG, la pérdida de 30 a 60%.
  8. Verificar la metilación de los plásmidos a través de una digestión de restricción Hpa II.
  9. Tome 1 g de ADN metilado o no metilado y digestión de restricción con Hpa II durante 1 hora a 37 ° C. Utilice 5-10 unidades de Hpa II para cada g de ADN. Después de la digestión Hpa II, realice la limpieza de ADN utilizando preferido membrana disponible comercialmente de gel de sílice limpiar kit. Ejecutar ambos plásmidos metiladas y no metiladas CpG DNA en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE o TBE a 100 V durante 45 min para la visualización (Figura 4B).
  10. Asunto tanto metilado y no metilado plásmidos a doble digestión con enzimas de restricción apropiadas para liberar de larga duración luc 2 (vector) y la isla CpG (inserto) fragmentos 38. Realice doble digestión O / N a la temperatura adecuada y enzimas que inactivan calor después de la digestión de acuerdo con el protocolo del fabricante. Mínima pérdida de la concentración de ADN se produce durante la restricción doble digestión.
  11. Ejecutar plásmidos digeridos doble sobre 1% gel de agarosa de ADN a 100 V durante 1 h para permitir la separación of vector e inserte (Figura 4C). Precaución. El uso de protección UV protector de cara, coloque gel de ADN en una luz negro mesa para visualizar las bandas. Basado en el tamaño, el consumo de inserción metilado y no metilado y no metilado vector utilizando una cuchilla quirúrgica limpia.
  12. Gel de ADN usando extracto de fenol saturado, pH 6,6. En pocas palabras, pesar gel de ADN que contiene vector o inserto. Utilice 100 l de fenol por 0,1 gramos de gel de ADN. Homogeneizar gel de ADN en fenol utilizando homogeneizador Dounce vidrio.
  13. Añadir cloroformo (usando un quinto del volumen de fenol) y agitar muestras durante 20 s. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 2-3 min. Centrifugar durante 15 minutos a velocidad máxima (16,1 x 1000 x g) a 4 ° C.
  14. Retire la solución acuosa y añadir volumen 0,1X de 3 M de acetato de sodio y el volumen 2,5X de etanol. Incubar las muestras durante 1 hora a -80 ° C. Después de la incubación, retirar el etanol y resuspender el ADN en 30 l de tampón preferido. Pérdida significativa de ADN se produce después del aislamiento de insertos y vectores, el 30-50% loss.
  15. Re-ligar las inserciones metilados y no metilados a vector no metilado utilizando ADN ligasa de T4 38. Utilice una proporción de 1: 4 de vector para insertar para reacciones de ligación. Reacción de instalación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Use un volumen total de 50 l para las reacciones e incubar O / N a -20 ° C o en hielo con tapa sobre el cubo de hielo.
  16. Después de la ligación, realice la limpieza de ADN utilizando preferido membrana disponible comercialmente de gel de sílice limpiar kit. Pérdida significativa de ADN ocurrir después de reacción de ligación, un aproximado de la pérdida de 30 a 50% de ADN. Verificar re-ligación mediante la ejecución en 1% de gel de agarosa de ADN a 100 V durante 45 min y evaluar la concentración de plásmidos re-ligado (Figura 4D).
  17. Transfectar plásmidos metiladas o no metiladas en células D54 usando un reactivo de transfección comercial según el protocolo del fabricante. Células D54 semilla sobre la placa de 12 pocillos en un 0.14 x 10 6 células / pocillo.
  18. Después de 24 horas, las células transfectar wiconcentraciones iguales th de cualquiera de (1) plásmido no methyated CpG-luc2 + Renilla luciferasa u otro vector de control o (2) metilado CpG-plásmido luc2 + Renilla luciferasa u otro vector de control.
  19. Permitir a las células para transfectar durante 24 horas antes de realizar el ensayo de luciferasa dual. Realizar ensayo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Realizar lecturas utilizando un luminómetro. Lea cada pocillo por triplicado.
  20. Calcular la relación de la actividad luciferasa de la luciérnaga de Renilla u otra actividad luciferasa control. Normalizar metilado Firefly: actividad luciferasa control para Firefly no metilado: actividad de la luciferasa de control al dividir la actividad luciferasa metilado por la actividad de la luciferasa no metilado

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Results

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Una población enriquecida de astrocitos fue adquirida a través de FACS clasificación de eGFP-S100β animales transgénicos 27. Debido a la disminución de la calidad de las células y moléculas moleculares aisladas de animales mayores de postnatal día 50 (p50), animales p0-p40 edades son óptimas para este tipo de experimentos. Tejido cortical se utilizó para estos experimentos. Cortezas de dos a seis animales se agruparon juntos. FACS se realizó en las instalaciones de la UAB Integral de Citometría de Flujo. Orde...

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Discussion

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Este protocolo describe el aislamiento de una población enriquecida de astrocitos a través de FACS, así como una variedad de técnicas que permiten estudios correlativos y causales entre la metilación del ADN y la expresión génica. Estas técnicas, utilizadas de forma aislada o en combinación, son particularmente útiles para laboratorios que trabajan con tejidos de alta heterogeneidad celular o están interesados en el estado de metilación del ADN de un gen o región de genes en particular frente a los cambios globales de me...

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Disclosures

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Los autores no tienen divulgaciones.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por R01NS075062-01A1. Clasificación FACS realizada en las instalaciones del Núcleo Integral de Citometría de Flujo de la UAB (P30 AR048311, P30 A1027767). El Dr. Scott Philips, del Centro de Neurobiología de la UAB, y la Dra. Susan Nozell, del CDIB de la UAB, ayudaron con los aspectos técnicos del ensayo de luciferasa.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sistema de disociación de papaínaWorthington Biochemical CorporationLK003150
AllPrep Mini kit de ADN/ARNQiagen80204
Methyl Primeren líneade Applied Biosystemspara localizar islas CpG
Kit de metilación de ADN EZZymo ResearchD5001
Estándar de calibración premezclado para ratasEpiGenDx80-8060R-Premezcla
CpG Metilasa (M.Sssl)Zymo ResearchE2010
QIAquick Gel Extraction QIagen28704Se utiliza para la extracción de gel y la limpieza del ADN
Enzimas de restricciónNew England BioLabs
Cortador NEBNew England BioLabsen líneaverificar sitios de digestión de restricción
Sistema de ensayo indicador de luciferasa dual PromegaE1910
Luc2 vector, pGL4.10PromegaE6651
vector renilla, pGL4.74PromegaE2241
TD-20/20 LuminómetroDesigns
Lipofectamine LTX y Plus ReactivoLife TechnologiesA12621
Fenol, pH saturado 6.6/6.9Fisher ScientificBP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c EspectroftómetroThermoScientific
MeltDoctor Master Mixdede
v2.0Software4397808
Life Technologies AB SDS v2.3Life Technologiesen línea
High Resolution Melting Life Technologiesen línea
AB 7900HT Sistema rápido en tiempo realLife Technologies
Software Turner Software fusión alta resolución (HRM) 4415440 Life Technologies Guía de inicio de AB

References

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