Los huevos de gallina fértiles se utilizan ampliamente para producir grandes cantidades del virus de la influenza A humana, ya que proporcionan un sistema conveniente y rentable para demostrar altos rendimientos de virus.
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Artículo de método
Propagación del virus de la influenza en embrionados de pollo Huevos
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Resumen
Resumen
La infección por influenza se asocia con alrededor de 36,000 muertes y más de 200,000 hospitalizaciones cada año en los Estados Unidos. La aparición continua de nuevas cepas de virus de la gripe debido a la mutación y re-surtido complica el control del virus y requiere el desarrollo permanente de nuevos fármacos y vacunas. El estudio de laboratorio de influenza requiere de un método fiable y rentable para la propagación del virus. Aquí, se proporciona un protocolo completo para la gripe A la propagación de virus en huevos de pollo fértiles, que produce consistentemente stocks virales de alto título. En resumen, (SPF) huevos de gallina fertilizados libres de patógenos de suero se incuban a 37 ° C y 55-60% de humedad durante 10 - 11 días. Durante este período, el desarrollo del embrión se puede controlar fácilmente con un candler huevo. La inoculación del virus se lleva a cabo mediante la inyección de stock de virus en la cavidad alantoidea usando una aguja. Después de 2 días de incubación a 37 ° C, los huevos sonrefrigerada durante al menos 4 horas a 4 ° C. La cáscara de huevo por encima de la bolsa de aire y la membrana corioalantoidea continuación, se abrió cuidadosamente, y el fluido alantoideo que contiene el virus se recoge. El líquido se elimina de los desechos por centrifugación, se dividió en alícuotas y se transfiere a -80 ° C para almacenamiento a largo plazo. La gran cantidad (5-10 ml de virus que contiene fluido por huevo) y de alto título de virus que se consigue normalmente con este protocolo ha hecho que el uso de huevos para la preparación de virus nuestro método favorable, en particular para los estudios in vitro que requieren grandes cantidades de virus en los que se necesitan altas dosis de la misma stock de virus.
Introducción
La gripe A sigue siendo una amenaza importante para la salud humana. Es una enfermedad respiratoria potencialmente devastadora con una gran carga mundial que causa más de 500.000 muertes en el mundo cada año 1. Los virus de influenza son de la familia Orthomyxoviridae y llevan 8 de sentido negativo de ARN de cadena sencilla en su genoma 1,2. La alta mutabilidad (es decir, "deriva" antigénica) del genoma viral impide inmunidad a largo plazo. Por otra parte, la gripe es cada vez más resistente a los medicamentos antivirales 3.
La pandemia de gripe H1N1 2009 ponía de relieve todas las cuestiones difí....
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Protocolo
NOTA: Observaciones generales: Llevar a cabo todos los procedimientos que implican la manipulación del huevo en condiciones estériles, y una técnica estéril debería utilizarse en consecuencia. Pre-limpie todo el equipo con etanol al 70% antes de su uso. En general, la inoculación del virus de la influenza y la cosecha deben llevarse a cabo en un laboratorio BSL-2. Sin embargo, si este protocolo se utiliza para propagar mucho más patógeno virus de la gripe (por ejemplo, las cepas pandémicas y prepandémicas, cepas que representan un peligro para las aves de corral y el ganado, las cepas de influenza aviar altamente patógena, la cepa H1N1 1918), los niveles de ....
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Resultados
Múltiples métodos se han desarrollado para el título del virus de la influenza. Una consideración al momento de elegir un método apropiado es que algunos determinar partículas totales, independientemente de la viabilidad (por ejemplo, ensayo de hemaglutinina), mientras que otros se basan en la infectividad, que evaluará viriones viables (por ejemplo, la placa de ensayo) 6. Aquí, el título viral de fluido alantoideo recogido a partir de huevos de pollo inoculados con un virus de la gripe adap.......
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Discusión
La gripe causa una gran carga mundial de la enfermedad, y se sigue trabajando en la comprensión de la patogénesis de la lesión pulmonar 7. Para la investigación facilitado en esta enfermedad mortal, varios se han desarrollado métodos para propagar el virus de la gripe 6. Aquí se describe una técnica para producir virus de la gripe en huevos de gallina. La ventaja de este método es que es altamente reproducible y resulta en grandes cantidades de reservas de virus de la gripe de alta titulación, que .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El presente estudio fue apoyado por las subvenciones de los NIH HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.) y la Asociación Americana del Corazón Grant-in-Aid (P.C.)
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| Huevos de gallina fertilizados sin patógenos (SPF) con suero | VALO BioMedia | ||
| FARM iNNOVATORS | Modelo 2100 | ||
| volteador automático de huevos | FARM iNNOVATORS | Modelo 3200 | |
| candler de huevos | FARM iNNOVATORS | Modelo 3300 | |
| Jeringa de 1 ml | BD Bioscience | 309659 | |
| aguja 18G | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G aguja | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Etanol>99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluido al 70% con |
| pistola de pegamento al agua "Ad tech Hi Temp Proyecto Pro" | Tecnología publicitaria, Adhesive Technologies, Inc. | Pegamento modelo 1105 | |
| "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| Células MDCK ATCC | CRL-2935 | ||
| Glóbulos rojos de pavo agrupados lavados, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
Referencias
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y.
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Reimpresiones y permisos
