El propósito de este protocolo es demostrar los principios y técnicas para medir y calcular la tasa de filtración glomerular, la tasa de flujo urinario y la excreción de sodio y potasio en una rata. Esta demostración se puede utilizar para proporcionar a los estudiantes una comprensión conceptual general de cómo medir la función renal.
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Artículo de método
Demostración Laboratorio Fisiología: tasa de filtración glomerular en una rata
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Resumen
Resumen
Las mediciones de la tasa de filtración glomerular (TFG) y la excreción fraccional de sodio (Na) y potasio (K) son fundamentales para evaluar la función renal en la salud y la enfermedad. La TFG se mide como el aclaramiento renal en estado estacionario de inulina que se filtra en el glomérulo, pero no se secreta ni se reabsorbe a lo largo de la nefrona. La excreción fraccional de Na y K puede determinarse a partir de la concentración de Na y K en plasma y orina. El aclaramiento renal de inulina puede demostrarse en un animal anestesiado que tiene catéteres en la arteria femoral, la vena femoral y la vejiga. El equipo y los suministros utilizados para este procedimiento son los comúnmente disponibles en un centro de investigación, lo que hace que este procedimiento sea un medio práctico para medir la función renal. El propósito de este video es demostrar los procedimientos necesarios para realizar una demostración de laboratorio en la que se evalúa la función renal antes y después de un fármaco diurético. La técnica presentada se puede utilizar para evaluar la función renal en modelos de enfermedad renal en ratas.
Introducción
La función más importante del riñón es la regulación homeostática del contenido extracelular de agua y electrolitos. Los riñones regulan estrechamente el agua extracelular, el sodio (Na) y el potasio (K) para mantener los niveles fisiológicos normales. Las alteraciones de la función renal pueden dar lugar a trastornos metabólicos graves que pueden ser mortales. El proceso renal básico ocurre en la nefrona y comienza con la filtración de plasma en el glomérulo y termina con la excreción de orina. Otros procesos que determinan la concentración final de agua, Na y K en la orina son la secreción y la reabsorción dentro de la nefrona. Las mediciones de la tasa de filtración glomerular (TFG) y la excreción fraccional de Na y K son fundamentales para evaluar la función renal en la salud y la enfermedad. Se remite al lector a artículos de revisión y libros de texto publicados anteriormente para una discusión más exhaustiva de la función renal1-4.
GFR puede medirse como el aclaramiento renal en estado estacionario de inulina que se filtra en el glomérulo, pero no se secreta ni se reabsorbe a lo largo de la nefrona5. Si bien esta técnica requiere anestesia, preparación quirúrgica y un experimento terminal, se considera el estándar de oro de la medición de la TFG. Con el uso de inulina marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC), la concentración de inulina FITC-en plasma y orina se puede medir fácilmente en pequeños volúmenes y se puede utilizar para calcular la TFG durante múltiples puntos temporales de un experimento. La excreción fraccional de Na y K puede determinarse a partir de la concentración de Na y K en plasma y orina.
La comprensión conceptual de cómo medir la función renal se puede demostrar fácilmente en un breve laboratorio diseñado para permitir que los estudiantes participen activamente en algunos aspectos del experimento. Este video muestra la preparación previa al laboratorio, la demostración de la función renal y la evaluación de los resultados después del laboratorio. Las técnicas quirúrgicas necesarias para realizar mediciones de FG se demuestran en una rata anestesiada. Además, se muestran ejemplos de cálculos para la TFG y la excreción fraccional de Na y K antes y después de la administración de un fármaco diurético.
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Protocolo
Antes de cualquier procedimiento de animales, el cuidado de los animales y el uso comité institucional (IACUC) debe aprobar el protocolo. Este protocolo fue aprobado por la Universidad Estatal de Michigan IACUC.
1. Preparación Pre-laboratorio de la solución de FITC-inulina
- Caliente 20 ml de solución salina a 70 ° C y agitar lentamente en 100 mg de FITC-inulina (5 mg / ml de FITC-inulina) hasta que se disuelva todo inulina.
- Solución enfriar a ta y añadir 800 mg de albúmina de suero bovino (40 mg / ml de BSA, polvo liofilizado, esencialmente globulina libre, bajo la endotoxina, ≥98% de pureza por electroforesis en gel de agarosa).
- Se filtra la solución de inulina-BSA con papel de filtro (grado 1). Coloque la solución filtrada en una jeringa de 20 ml con un filtro de jeringa de punta (0,2 micras) y cubrir con papel de aluminio para protegerlo de la luz.
2. Anestesia y Cirugía
- Coloque la rata en una cámara de inducción lleno con 5% de isoflurano para inducir la anestesia. Bod Recordpeso y (250-350 g) y coloque la rata en una plataforma quirúrgica calentada diseñado para mantener 37 ° C la temperatura del cuerpo durante todo el experimento. Asegurar suavemente la rata a la plataforma con cinta de laboratorio sobre las patas. Mantener la anestesia con isoflurano al 1-2% con grado médico 100% de O 2 a la tasa de flujo de aire de 0,8 a 1,0 l / min.
- Inserte un catéter cónico (OD punta intravascular, 2.7F) en la arteria femoral de la presión arterial y la frecuencia cardíaca, y toma de muestras de sangre.
- Insertar un catéter (PE-50) en la vena femoral para la infusión de inulina. Asegure el catéter al tejido circundante con sutura quirúrgica trenzada seda 5-O 6.
- Conecte el catéter arterial a un transductor de presión del calibrador de tensión. La presión arterial y la frecuencia cardíaca Record usando software de adquisición de datos y visualización en una pantalla de ordenador en tiempo real. Esta técnica se muestra en detalle en el vídeo 6.
- Exponer la vejiga a través de una incisión suprapúbica. Corte un pequeñoagujero en la punta de la vejiga e insertar una cánula (PE-190) con un calor extremo estallaron dentro de la vejiga para la recolección de orina. Fije la cánula a la vejiga con una sutura en bolsa de tabaco.
3. La orina y extracción de sangre
- Coloque la jeringa de FITC-inulina en una bomba de jeringa con un caudal conjunto de 1 ml / hr por 100 g de peso corporal (3 ml / h para una rata de pesaje 300 g). Conecte la jeringa al catéter de la vena femoral. Iniciar la infusión de inulina y permitir un período de equilibrio 2.1 hr. Mantenga la jeringa cubierto con papel de aluminio para protegerlo de la luz.
- Determinar si la tasa de flujo de orina es estable y adecuado para el análisis de la muestra (20 l / min) por recogida de una muestra de orina en un vial de recogida pesada previamente durante un período de 10 min. Determinar el volumen de orina por gravimetría con una balanza digital. Un volumen de orina adecuada para un periodo de recogida de 10 minutos es de 0,2 ml. Continuar para recoger muestras de orina hasta dos colecciones consecutivos indican una tasa de flujo de orina de 20 l / men o más.
- Muestras Pre-Droga
- Se recoge una muestra de orina durante un período de 20 min. Se recoge una muestra de sangre (0,5 ml) del catéter arterial en el punto medio del período de recolección de orina. Tenga cuidado para borrar por completo el catéter arterial de solución salina antes de recoger una muestra de sangre en un frasco de colección que contiene 1 U de heparina. Utilice viales de colección con las marcas de volumen para facilitar la recogida de 0,5 ml de sangre arterial.
- Enjuague el catéter arterial con heparina-solución salina (20 U / ml) para borrar el catéter de la sangre (aprox. 0,1 ml). La longitud del catéter arterial debe ser tan corto como sea posible para limitar el volumen de solución salina de heparina necesaria para tirar.
Nota: Las muestras de sangre diluidas producen cálculos incorrectos de la TFG y la excreción fraccional de Na y K. - Espere 10 minutos y repetir el cobro de una segunda orina Pre-drogas y muestra de sangre.
- Después de la colección de dos muestras Pre-drogas, administrar un diurético Drug, furosemida (10 mg / kg), a través del catéter arterial. Lave el catéter arterial con solución salina heparinizada para despejar el catéter de la droga. Tenga cuidado para evitar la inyección de aire a través del catéter arterial. Registre el momento de la inyección de furosemida.
- Las muestras post-drogas: En cada uno de los 3 puntos de tiempo abajo, recoger una muestra de orina durante el período de recogida de 10 minutos, y una muestra de sangre (0,5 ml) en el punto medio del período de recolección de orina.
- Para Post-Drogas de la muestra 1 - recoger cinco minutos después de la furosemida.
- Para la muestra post-Drogas 2 - recoger diez minutos después de la furosemida.
- Para la muestra post-Drogas 3 - recoger quince minutos después de la furosemida.
- Después se han recogido todas las muestras, la eutanasia la rata de conformidad con los procedimientos institucionales de la toracotomía y la extracción del corazón. Retire ambos riñones. Decapsulate (quitar la membrana que rodea) y sacudir a los riñones a eliminar el exceso de sangre. Pesar los riñones.
4. Análisis de las muestras
- Mida todos los volúmenes de muestra de orina por gravimetría con una balanza digital y pesos de discos.
- Muestras de sangre entera de centrífuga con una centrífuga de sobremesa (1800 xg) para separar el plasma. Transferir las muestras de plasma a los pequeños viales etiquetados.
- Analizar las concentraciones de Na y K en las muestras de orina y plasma con un analizador de sodio / potasio.
- Medición de FITC-inulina en plasma y orina
- Diluir la orina pre-fármaco (de 1: 200 a 1: 400), y la orina post-fármaco (1:10) con tampón HEPES (500 mM, pH 7,4).
- Añadir 40 l de l estándar o muestra y 60 de tampón HEPES en una placa de 96 pocillos (una muestra por pocillo) y se deja mezclar durante 10 min mientras está cubierto con papel de aluminio.
- Generar una curva estándar para FITC-inulina para las concentraciones de 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 g / ml (Figura 1). Determinar la fluorescencia FITC-inulina en las muestras y estándares utilizando un lector de microplacas con su excitas y emisión de longitudes de onda 485 y 538 nm, respectivamente.
- Ajustar los valores fluorescentes para los estándares de un análisis de regresión la función logística de 4 paramter. Los parámetros de la función de regresión se utilizan para calcular la concentración de FITC-inulina en muestras de plasma y orina (Tabla 1).
Análisis 5. Post-laboratorio de Resultados: Cálculos
- Calcula orina Caudal (UV; ml / min): [volumen de orina recogido (ml)] ÷ [momento de la recolección (min)]
- Calcular tasa de filtración glomerular (TFG; ml / min): [concentración de inulina de orina (mg / ml) x UV (ml / min)] ÷ [inulina concentrado de plasma. (G / ml)]
- Calcular filtrada de sodio de carga (mol / min): concentración plasmática de sodio (mmol / ml) x TFG (ml / min)
- Calcular sodio Excreción Rate (U Na V; mol / min): concentración de sodio en orina (mol / ml) x UV (ml / min)
- Calcula fraccional excreción de sodio (Na FE;%): [U Na V (mol / min)] ÷ [Filtrado de carga de sodio (mmol / min)] x 100
- Calcular carga filtrada de potasio (mol / min): concentración de potasio de plasma (mmol / ml) x TFG (ml / min)
- Calcular potasio Excreción Rate (U K V; mol / min): concentración de potasio en orina (mol / ml) x UV (ml / min)
- Calcula fraccional excreción de potasio (K FE;%): [U K V (mol / min)] ÷ [Cargar potasio filtrada (mol / min)] x 100
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Resultados
El diurético utilizado en la demostración de laboratorio era furosemida que inhibe muy rápidamente la reabsorción de Na y K filtrada por el riñón resulta en aumento de Na, K, y la excreción de agua en cuestión de minutos de la administración del fármaco. Por su mecanismo primario, furosemida debe tener efectos mínimos sobre la tasa de filtración glomerular y de la carga filtrada de Na y K, pero aumentará el flujo de orina y la excreción fraccional de Na y K.
Los resultados representativos en...
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Discusión
Un marcador adecuado para la medición de la TFG debe cumplir con cuatro criterios: se filtra libremente en el glomérulo, sea no unido a las proteínas plasmáticas, y ni ser absorbida ni secreta en la nefrona. La inulina es un polímero de la fructosa que satisface estos criterios. Como resultado, el aclaramiento renal de inulina se considera el estándar de oro para medir la TFG 7. La técnica demostrada representa el enfoque tradicional de la determinación del aclaramiento renal de inulina usando muestras de ori...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia. Las opiniones o afirmaciones contenidas en este documento son las opiniones privadas del autor y no deben ser interpretados como funcionario o como el reflejo de las opiniones del Departamento del Ejército o el Departamento de Defensa.
Agradecimientos
La fuente de financiamiento para la demostración de laboratorio fue subvención NIGMS: GM077119. Agradecemos al Dr. José R. Haywood y el Dr. Peter Cobbett por su apoyo a la corta Couse en Integrativa y sistemas de órganos Farmacología. También agradecemos a la Sra Hannah Garver por su apoyo técnico de la demostración de laboratorio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 5-0 Sutura quirúrgica de seda trenzada | Surgical Specialties Corp | SP1033 | |
| Placa de ensayo, 96 pocillos | Costar | 3922 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma Chemical Co | A2934-25G | |
| Centrífuga | Beckman Coulter | MicroFuge 18, 357160 | |
| Tubos de muestra cónicos | Dot Scientific Inc. | #711-FTG | |
| Aplicadores con punta de algodón | Solon Manufacturing Co | 56200 | |
| Software de adquisición de datos | ADInstruments | LabChart Pro 7.0 | |
| Báscula digital | Denver Instrument | APX-4001 | |
| FITC-Inulina | Sigma Chemical Co | F3272-1G | |
| Esponjas de gasa | Covidien | 2146 | |
| cama quirúrgica calefactada | EZ-Anesthesia | EZ-212 | |
| Heparina | Sagnet | NDC 25021-402-10 | |
| HEPES | Sigma Chemical Co | H3375 | |
| Isoflurano | Abbott Animal Health | IsoFlo, 5260-04-05 | |
| Vaporizador de isoflurano | EZ-Anesthesia | EZ-190F | |
| Pinzas de microdisección | Biomedical Research Instruments Inc. | 70-1020 | |
| Lector de microplacas - Fluoroskan | ThermoScientific | Ascent FL, 5210460 | |
| NOVA 5+ Analizador de sodio/potasio | NOVA BioMedical | 14156 | |
| Olsen-Hegar Portaagujas con tijeras | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| PE-190 (para catéter vesical) | BD Medical | ||
| & nbsp; | Aditivos | MLT1199 | |
| Tubos de cultivo Pyrex | Corning Inc. | 99445-12 | |
| Catéter de arteria cónica femoral de rata | Strategic Applications Inc. | RFA-01 | |
| Salix Furosemida 5% | Intervet | #34-478 | |
| Tijeras de estrabismo | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Tijeras quirúrgicas para estudiantes | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Guantes quirúrgicos | Kimberly-Clark | Sterling Guantes | |
| Bomba de jeringa | Razel Scientific | R99-E | |
| Pinzas de tejido | Fine Science Tools | 91121-12 | |
| Tijeras de tejido | George Tiemann Co | 105-420 | |
5-0 Sutura quirúrgica de seda trenzada Surgical Specialties Corp SP1033 Placa de ensayo, 96 pocillos Costar 3922 Albúmina de suero bovino Sigma Chemical Co A2934-25G Centrífuga Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Tubos de muestra cónicos Dot Scientific Inc. #711-FTG Aplicadores con punta de algodón Solon Manufacturing Co 56200 Software de adquisición de datos ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital Escala Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulina Sigma Chemical Co F3272-1G Esponjas de gasa Covidien 2146 cama quirúrgica calefactada EZ-Anesthesia EZ-212 Heparina Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Isoflurano Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Vaporizador de isoflurano EZ-Anesthesia EZ-190F Pinza de microdisección Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Lector de microplacas - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Analizador de sodio/potasio NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar Portaagujas con tijeras Fine Science Tools 12002-12 PE-190 (para catéter de vejiga) BD Medical 427435 Transductor de presión Instrumentos MLT1199 Tubos de cultivo Pyrex Corning Inc. 99445-12 Catéter de arteria cónica femoral para ratas Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemida 5% Intervet #34-478 Tijeras para estrabismo Herramientas de ciencia fina 14075-11 Tijeras quirúrgicas para estudiantes Herramientas de ciencia fina 91402-12 Guantes quirúrgicos Kimberly-Clark Guantes de nitrilo Sterling Bomba de jeringa Razel Scientific R99-E Pinzas para tejidos Herramientas para ciencias finas 91121-12 Tijeras para tejidos George Tiemann Co 105-420 |
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