La visualización directa de la murino Dorsal coclear Núcleo de optogenética La estimulación de la vía auditiva

Resumen

El objetivo de este protocolo es esbozar un enfoque quirúrgico para proporcionar acceso directo al núcleo coclear dorsal en un modelo murino.

Resumen

Investigación sobre el uso de la transferencia génica mediada por virus para detener o revertir la pérdida de la audición en gran medida ha sido relegado al sistema auditivo periférico. Pocos estudios han examinado la transferencia de genes al sistema auditivo central. El núcleo coclear dorsal (DCN) del tronco cerebral, que contiene las neuronas de segundo orden de la vía auditiva, es un sitio potencial para la transferencia de genes. En este protocolo, una técnica para la exposición directa y máxima de la murino DCN a través de un enfoque de la fosa posterior se demuestra. Este enfoque permite ya sea la cirugía aguda o supervivencia. Después de la visualización directa de la DCN, una serie de experimentos son posibles, incluyendo la inyección de opsinas en el núcleo coclear y la estimulación posterior por una fibra óptica acoplada a un láser de luz azul. Otros experimentos neurofisiología, como la estimulación eléctrica y trazados inyectores neuronales también son factibles. El nivel de Visualización y la duración de la estimulación alcanzable hacen de este enfoque aplicable a una amplia gama de experimentos.

Introducción

La transferencia de genes mediada por virus para revertir la pérdida auditiva se ha centrado en gran medida en el sistema auditivo periférico. ¹ Con respecto a la cóclea, los investigadores han examinado una serie de vías de administración, como la infusión 2 con minibomba osmótica, la espuma de gel®² empapada en complejo de vectores transgenes o la esponja de gelatina³, la microinyección directa⁴; numerosos vectores de transferencia de genes, incluidos los vectores virales adenoasociados^5,6, los vectores lentivirales⁷ y los liposomas catiónicos²; y la diseminación de vectores de transferencia génica más allá del tejido diana². Más recientemente, el virus adenoasociado (AAV)-1 se ha introducido en la cóclea para tratar la sordera en ratones debido a la pérdida del transportador vesicular de glutamato-3. ⁸ Además, recientemente se ha descrito la aplicación de la optogenética en el sistema auditivo periférico. ⁹

Pocos estudios, sin embargo, han examinado la transferencia de genes al sistema auditivo central. El núcleo coclear dorsal (DCN) del tronco encefálico contiene neuronas de segundo orden de la vía auditiva. Si bien las técnicas de transferencia de genes en el núcleo coclear (CN) se pueden utilizar para una gran cantidad de investigaciones, la transferencia de genes de opsinas, proteínas sensibles a la luz, a la DCN también se puede utilizar para permitir técnicas experimentales basadas en la optogenética. Después de la entrega de una opsina por transferencia de genes mediada por virus, como la canalrodopsina-2 (ChR2), las neuronas de la DCN se vuelven sensibles a los estímulos luminosos. La transferencia de genes optogenéticos se ha intentado previamente en varias regiones del tronco encefálico, incluido el núcleo retrotrapezoide de rata, el locus coeruleus de ratón, el colículo superior de mono y el área tegmental ventral de ratón. ^{De 10 a 14}

años

Recientemente, los investigadores han examinado el uso de la optogenética en la DCN. ^15,16 El DCN es el lugar de colocación de los implantes auditivos de tronco encefálico en humanos, lo que lo convierte en una parte atractiva del sistema auditivo para estudiar estudios traslacionales sobre neuroprótesis auditivas. Sin embargo, dada la ubicación de la DCN, la exposición quirúrgica es un desafío. La técnica descrita en este documento proporciona un protocolo para la exposición máxima de la DCN a través del abordaje de la fosa posterior para permitir la transferencia de genes de vectores virales y experimentos basados en optogenética en un modelo murino. Estudios previos utilizaron microinyección estereotáctica en la DCN con canalrodopsina-2. ¹⁶ Las inyecciones estereotáxicas, sin embargo, son potencialmente menos precisas que las inyecciones realizadas por visualización directa, especialmente en un núcleo tan pequeño y profundo a lo largo del tronco encefálico como la DCN. Los ratones transgénicos que expresan proteínas específicas de tejidos en el CN también son una opción atractiva y evitarían la necesidad de transferencia de genes. Nuestro protocolo para la exposición a la DCN también funcionaría en ratones transgénicos, ya que la DCN tendría que exponerse directamente para la estimulación óptica. Esta técnica para la exposición quirúrgica de la DCN es una adaptación de los protocolos anteriores que incluyen registros del nervio auditivo y el núcleo coclear en modelos de ratones y ratas. ^15,17-20

El objetivo general del protocolo es proporcionar una exposición directa al CN para permitir técnicas de transferencia de genes. Más concretamente, el abordaje es compatible tanto con la cirugía aguda como con la de supervivencia, y la preparación puede repetirse en el mismo animal para posteriores pruebas neurofisiológicas. La exposición directa del protocolo DCN tiene implicaciones para la experimentación basada en la transferencia de genes mediada por optogenética y virus en otros núcleos del tronco encefálico.

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos experimentales se realizan de acuerdo con el Comité de Cuidado de Animales y el empleo de la Massachusetts Eye and Ear Infirmary y la Escuela Médica de Harvard, que siguen las directrices nacionales de cuidado de animales, incluyendo la Política Pública de Salud Servicio de Cuidado Humano y Uso de Animales de laboratorio, la Guía ILAR, y la Ley de Protección de los Animales. Los procedimientos experimentales indican a continuación la exposición detallada de la DCN izquierda. Utilice instrumentos estériles mientras se realiza la cirugía de supervivencia.

1. Craneotomía Primaria y Dorsal coclear Núcleo exposición

1. Anestesia
   1. Anestesiar a un ratón, a la edad de 8-12 semanas, con un peso de 18-24 g, con xilazina 20 mg / kg de ketamina y 100 mg / kg a través de una administración intraperitoneal. Confirmar la anestesia adecuada por la tasa de monitorización cardiaca, frecuencia respiratoria, así como reflejo de retirada pizca dedo del pie. Lugar veterinario ungüento en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Una vez adecuadamente bajo anestesia, el pelo afeitado recubre tque el cuero cabelludo para proporcionar un acceso sin obstrucciones a la zona quirúrgica.
2. Posicionamiento quirúrgico
   1. Coloca el ratón de forma segura en un pequeño titular estereotáxica animal, sujeto por una abrazadera hocico.
   2. Asegúrese de que la abrazadera hocico es lo suficientemente floja para permitir la respiración adecuada, pero lo suficientemente apretado para inmovilizar por completo la cabeza del ratón. Si la cabeza del ratón está suelto, el animal es probable que caiga fuera del soporte de cabeza durante la parte craneotomía de procedimiento.
   3. Coloque los electrodos del implante auditivo de tronco cerebral en forma estándar, lo que permite la monitorización de la frecuencia cardíaca. La frecuencia respiratoria debe ser supervisada por la visualización. Tenga en cuenta que la frecuencia cardíaca normal y la frecuencia respiratoria variarán dependiendo de la edad del ratón.
   4. Un termómetro se coloca y euthermia está asegurada a través de la colocación de una manta de calefacción homeotérmico.
3. Incisión de la piel y la exposición de los huesos interparietales y occipital del cráneo
   1. Bajo un Microscopa, hacer una incisión vertical a través de la piel a partir de la línea media, directamente entre el pabellón de la oreja, y se extiende hasta la porción caudal del occipucio. Después de incisión en la piel en la línea media, desplazar lateralmente la piel. Visualizar los músculos que cubren la izquierda de la cara posterior del cráneo.
   2. Retire el músculo que recubre el parietal izquierdo, interparietal, y los huesos occipitales del cráneo por la desarticulación de las inserciones musculares a sus respectivos huesos con un bisturí o tijera iris. Observar un pequeño grado de sangrado a lo largo de los bordes musculares corte. Minimizar esta por presión suave con un aplicador con punta de algodón para 10-15 seg.
4. Suprayacente craneotomía coclear Núcleo
   1. Identificar las líneas de sutura pertinentes, incluidas las líneas de suturas sagital y lambda (Figura 1, panel izquierdo).
   2. Usando unas pinzas, hacer una craneotomía sobre el hueso interparietal, izquierda de la línea media, ~ 2 mm caudal a la línea de sutura lambda. Esta región se superpone a la DCN.
   3. Following craneotomía, observar una fina capa de duramadre que recubre el cerebelo. Usando una hoja de bisturí, retire la duramadre. (Figura 1, el panel medio).
      NOTA: La eliminación de la duramadre puede causar un pequeño grado de sangrado. Este proceso de usar la hoja de bisturí para eliminar la duramadre está destinado a reducir la cantidad de pérdida de sangre durante la aspiración cerebelo, que será común en la superficie del tronco cerebral y la identificación oscura de la DCN. El volumen de sangre total de ratón es ~ 1,5 ml no deben exceder> al 15%. Si el sangrado es superior a esta cantidad, el ratón debe estar provista con suplementos de fluido.
   4. Retire la sangre coagulada superponer el cerebelo con el aplicador con punta de algodón. Opcionalmente, escurrir suavemente salina utilizando una punta dental en el cerebelo para limpiar la sangre fuera sangre.
5. Cerebelosa Aspiración
   1. Usando una succión Francés 5, aspirar la porción lateral más del cerebelo izquierdo que recubre el DCN hasta que el DCN es visual (Figura 1, panel derecho). Retire aproximadamente 1/4 a 1/3 del cerebelo izquierdo. El hito principal adyacente a la DCN es la ampolla del canal semicircular superior.
      NOTA: La aspiración del cerebelo es el paso clave del protocolo. Dirigida aspiración del cerebelo se lleva a cabo con mayor éxito si se produce en un solo intento y no con varias pasadas de la succión, ya que esto causar sangrado. Para ayudar en la aspiración, definir el plano focal del microscopio a la profundidad prevista de la NC, que será ligeramente distal a la superficie del cerebelo. Ajuste del plano focal a la CN mejorará la visualización y asegurar una imagen nítida.
   2. Se espera que después de la aspiración, más sangrado, el líquido cefalorraquídeo (LCR) la acumulación y el desplazamiento cerebelo en la DCN. Inculcar 0,5 cc de solución salina estéril rápidamente en la craneotomía para prevenir la coagulación de la sangre. Una combinación de dabbing suave con un punto dental y la succión puede ser entoncesutilizado para despejar un camino para la visualización directa de la DCN. No entre en contacto directo con la superficie de la DCN.

2. La microinyección de presión para la transferencia génica mediada por virus y la recuperación quirúrgica

1. Después de la DCN es libre de sangre suprayacente y CSF y es claramente visible, hacer microinyecciones de presión en el DCN utilizando una jeringa Hamilton de 10 l durante un período de 2 min.
2. Introducir la aguja con un micromanipulador hasta que la punta ya no es visible bajo la superficie de la DCN.
3. Para un rendimiento óptimo, utilice una aguja de calibre 33 o 34 (utilizar una jeringa estanca a los gases con la aguja de calibre 34) con un bisel de poca profundidad, tales como 45 °, para reducir al mínimo el traumatismo cerrado y localizar el volumen de inyección dentro de la DCN, que es un delgado y estructura del tronco cerebral profunda (<300 micras de espesor).
   NOTA: Otros instrumentos de microinyección pueden basarse utilizado. Idealmente, el instrumento de inyección debe ser flexible para permitir una ligera bend, si es necesario apuntar directamente a la DCN. Además, como el ratón se mueve ligeramente durante todo el procedimiento debido a la respiración, el instrumento debe ser lo suficientemente robusta como para soportar pequeñas cantidades de movimiento.

3. Recuperación Quirúrgica

1. Inmediatamente después de la inyección, vuelva a la aproximación de la piel y permitir el ratón para recuperar por procedimiento de recuperación estándar. Restante cerebelo y tejido cicatrizal se llenará en la cavidad causada por la aspiración del cerebelo. Constantemente observar a los animales hasta que la conciencia suficiente se recuperó para mantener decúbito esternal. Monitorear la frecuencia cardiaca, la frecuencia respiratoria, así como la capacidad para alimentarse.
   NOTA: No animal que ha sido sometido a cirugía es devuelto a una jaula con otros animales hasta que se recupere totalmente.
2. Si un ratón comienza a caminar en círculos después de la intervención (<5% de los casos), típicamente 2-4 horas después del cierre de la incisión de la piel, sacrificar inmediatamente el ratón, ya que probablemente tendría una alimentación momento difícil. Tsu efecto secundario es probable debido a la aspiración del cerebelo. El animal debe ser supervisada para el dolor después de la operación, y los narcóticos también se debe prestar para asegurar el confort de los animales sobre la base de las normas institucionales. Los antibióticos pueden ser necesarios, si la evidencia de infección.

4. Secundaria exposición craneotomía y coclear Núcleo

1. Después de 2-4 semanas de curación y el gen de incubación transferencia mediada por virus, volver a anestesiar un ratón y repita el paso 1.1 a 1.5 tiempo de incubación óptimo previamente inyectado varía con el tipo de gen transferido.
2. Quitar el tejido de la cicatriz sobre el sitio de la craneotomía por una combinación de pinzas, bisturí, y rongeurs.
3. Después de visualizar la craneotomía, identificar una combinación de permanecer cerebelo y tejido cicatrizal que recubre la DCN. Utilice una succión Francés 5 para aspirar cerebelo suprayacente / tejido de la cicatriz (similar a la aspiración cerebelar anterior).
4. Después de la aspiración, le espera un sangrado posterior, CSF build-up, y el resto de bits de cerebelo. Introducir rápidamente salina en la craneotomía para evitar la coagulación de la sangre. Use una combinación de suave dabbing punto dental y de succión para despejar el camino para la visualización directa de la DCN.
5. Observar la superficie de la DCN. Realizar experimentos de fisiología con sede en la optogenética como DCN es ahora accesible. Introducir un estímulo de luz, por ejemplo, con una fibra óptica (Figura 2), para conducir un experimento basado en la optogenética.

5. Histología

1. Tras la conclusión de los experimentos, sacrificar al ratón con una sobredosis de ketamina. Perfundir el ratón con solución salina normal seguido de paraformaldehído al 4%.
2. Extraer el tronco cerebral del cráneo y post-fix durante 2 horas. Cryoprotect el tronco cerebral en el 30% de sacarosa durante 24 a 48 horas. Sección del tronco cerebral usando un criostato estándar con 60 micras secciones.

Resultados

Parcial cerebelosa Aspiración demuestre tener acceso a la coclear Núcleo

Después de la piel y el músculo que recubre el cráneo se retiran, superficie cráneo puntos de referencia, tales como las líneas de sutura coronal y Lamda, demostrar la localización aproximada de la craneotomía. Siguiendo craneotomía con gubia, el cerebelo se visualiza. La aspiración cuidadosa de la pequeña porción del cerebelo demuestra la visualización de la CN, que luego se puede inyectar (Figura 1).<...

Discusión

En este trabajo se describe la técnica de la visualización directa de la DCN en el modelo murino para la manipulación del sistema auditivo central. El enfoque esbozado de visualización directa ofrece ventajas significativas sobre la principal alternativa, que son enfoques estereotáxica. Principalmente, la visualización directa de la DCN permite confirmación inmediata del sitio del tronco cerebral, mientras que los enfoques estereotáxicas no proporcionan visualización directa. En experimentos que requieren prolongados pe...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Soporte estereotáxico	Stoelting	51500
Manta homeotérmica	Harvard	507214
Hoja de bisturí #11	Herramientas quirúrgicas finas	10011-00
Tijera de iris	Herramientas quirúrgicas finas	14084-08
5 Succión francesa	Simetría Puntos quirúrgicos	2777914
dentales	Henry Schein	100-8170
Bone rongeur	Herramientas quirúrgicas finas	16020-14
10 µ l Jeringa Hamilton	Hamilton	7633-01
Calibre 34, aguja	Hamilton
Rongeurs	Herramientas quirúrgicas finas	16021-14