Este bioensayo emplea un pez depredador modelo para evaluar la presencia de metabolitos de alimentación-disuasión a partir de extractos orgánicos de los tejidos de organismos marinos naturales en concentraciones utilizando una matriz de comida comparable nutricionalmente.
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Artículo de método
Un pez de amamantar Laboratorio Bioensayo para evaluar la actividad antidepredación de metabolitos secundarios de los tejidos de organismos marinos
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Resumen
Resumen
La ecología química marina es una disciplina joven, que surgió de la colaboración de químicos de productos naturales y ecólogos marinos en la década de 1980 con el objetivo de examinar las funciones ecológicas de los metabolitos secundarios de los tejidos de los organismos marinos. El resultado ha sido una progresión de protocolos que han refinado cada vez más la relevancia ecológica del enfoque experimental. Aquí presentamos la versión más actualizada de un bioensayo de laboratorio de alimentación de peces que permite a los investigadores evaluar la actividad antidepredadora de metabolitos secundarios de los tejidos de organismos marinos. Los metabolitos orgánicos de todas las polaridades se extraen exhaustivamente del tejido del organismo objetivo y se reconstituyen en concentraciones naturales en una matriz alimentaria nutricionalmente adecuada. Los gránulos de alimento experimentales se presentan a un depredador generalista en ensayos de alimentación de laboratorio para evaluar la actividad antidepredadora del extracto. El procedimiento descrito en este documento utiliza el cabeza azul, Thalassoma bifasciatum, para probar la palatabilidad de los invertebrados marinos del Caribe; Sin embargo, el diseño puede adaptarse fácilmente a otros sistemas. Los resultados obtenidos con este ensayo de laboratorio son un preludio importante para los experimentos de campo que se basan en las respuestas alimentarias de un complemento completo de depredadores potenciales. Además, este bioensayo se puede utilizar para dirigir el aislamiento de metabolitos disuasorios de la alimentación a través del fraccionamiento guiado por bioensayo. Este bioensayo de alimentación ha avanzado en nuestra comprensión de los factores que controlan la distribución y abundancia de invertebrados marinos en los arrecifes de coral del Caribe y puede informar investigaciones en diversos campos de investigación, incluyendo farmacología, biotecnología y ecología evolutiva.
Introducción
Ecología Química desarrolla a través de la colaboración de los químicos y los ecologistas. Mientras que la especialidad de la ecología química terrestre ha estado alrededor por algún tiempo, el de la ecología química marina es sólo unas pocas décadas, pero ha aportado importantes conocimientos sobre la estructura de la ecología y la comunidad evolutiva de los organismos marinos 1-8. Aprovechando las tecnologías emergentes de buceo y la espectroscopia de RMN, los químicos orgánicos generados rápidamente un gran número de publicaciones que describen nuevos metabolitos de invertebrados y algas marinas bentónicas en los años 1970 y 1980 9. Suponiendo que los metabolitos secundarios deben servir algún propósito, muchas de estas publicaciones atribuidas ecológicamente propiedades importantes a nuevos compuestos sin evidencia empírica. Casi al mismo tiempo, los ecologistas también se están aprovechando de la llegada de buceo y la descripción de la distribución y abundancia de animales bentónicos y plantas conocidas previamente froestoy métodos de muestreo relativamente ineficaces como el dragado. La asunción de estos investigadores era que nada sésiles y de cuerpo blando deben ser defendidos químicamente para evitar el consumo por los depredadores 10. En un esfuerzo por introducir el empirismo a lo que era el trabajo de otra manera descriptiva sobre la abundancia de especies, algunos ecologistas comenzaron extrapolando defensas químicas a partir de ensayos de toxicidad 11. La mayoría de los ensayos de toxicidad implicaron la exposición del pescado entero u otros organismos a las suspensiones acuosas de extractos orgánicos crudos de tejidos de invertebrados, con la posterior determinación de las concentraciones en masa seca de los extractos responsables de matar a la mitad de los organismos de ensayo. Sin embargo, los ensayos de toxicidad no emulan la manera en que los depredadores potenciales perciben presa en condiciones naturales, y estudios posteriores no han encontrado relación entre la toxicidad y la palatabilidad 12-13. Es sorprendente que las publicaciones en revistas de prestigio utilizan técnicas que tienen poca o ninguna ecological relevancia 14-15 y que estos estudios son aún ampliamente citados hoy. Es aún más alarmante observar que los estudios basados en datos de toxicidad se siguen publicando 16-18. El método de bioensayo descrito en este documento se elaboró a finales de 1980 para proporcionar un enfoque ecológicamente relevante para los ecologistas químicos marinos para evaluar las defensas químicas antidepredación. El método requiere un modelo depredador para muestrear un extracto orgánico crudo desde el organismo diana a una concentración natural en una matriz alimentaria nutricionalmente comparable, proporcionando datos palatabilidad que son ecológicamente más significativa que los datos de toxicidad.
El enfoque general a la evaluación de la actividad antidepredación de los tejidos de organismos marinos incluye cuatro criterios importantes: (1) un depredador generalista apropiado debe ser utilizado en ensayos de alimentación, (2) los metabolitos orgánicos de todas las polaridades deben ser exhaustiva extraído del tejido de la orientar organismo, (3) los metabolitos deben be mezclado en un alimento experimental nutricionalmente adecuada a la misma concentración volumétrica tal como se encuentra en el organismo a partir del cual fueron extraídos, y (4) el diseño experimental y enfoque estadístico deben proporcionar una métrica significativa para indicar mal sabor relativa.
El procedimiento descrito a continuación está diseñado específicamente para evaluar las defensas químicas antidepredación en los invertebrados marinos del Caribe. Empleamos el pez cabeza azul, Thalassoma bifasciatum, como un pez depredador modelo porque esta especie es común en los arrecifes de coral del Caribe y se sabe que degustar una amplia variedad de invertebrados bentónicos 19. Tejido del organismo diana se extrae primero, a continuación, se combina con una mezcla de alimentos, y, finalmente, se ofreció a los grupos de T. bifasciatum para observar si rechazan los alimentos tratados con extracto. Los datos de ensayo que utilizan este método han aportado importantes conocimientos sobre la química defensiva de los organismos marinos 12,20-21, lhistoria ife compensaciones 22-24 y ecología de comunidades 25-26.
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Protocolo
NOTA: El paso 3 de este protocolo implica sujetos animales vertebrados. El procedimiento ha sido diseñado para que los animales reciben el tratamiento más humana posible y ha sido aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de Carolina del Norte en Wilmington.
1) La extracción de tejidos
- Utilice tejido que se encuentra en su estado natural de hidratación y no exprimido, reseca o demasiado húmedo ya que esto alterará la concentración volumétrica de metabolitos secundarios. Cortar o cortar tejido para piezas o rodajas que se pueden insertar en un tubo de centrífuga de 50 ml. Nota: El tejido fresco se pueden utilizar en algunos casos, pero a menudo es mejor cortar o picar el tejido congelado, que no está sujeto a la compresión cuando se corta.
- Añadir piezas de tejido a 30 ml de una mezcla 1: 1 de diclorometano (DCM) y metanol (MeOH) en un tubo de centrífuga graduado hasta un volumen final de 40 ml se alcanza. Asegúrese de llevar a cabo todas las medidas que impliquen la transferencia dedisolvente en una campana de humos con ventilación adecuada.
- Tapar el tubo e invierta varias veces, luego agitar repetidamente durante un período de extracción de 4 horas. Nota: Durante este período, el agua se combina con el MeOH y el MeOH resultante: fase de agua se separa de la fase de DCM. El tejido se alternativamente expuesto a DCM y MeOH: agua como una emulsión como los tubos se agitan.
- Transferir el extracto de DCM a un matraz de fondo redondo y se evapora a sequedad en un evaporador rotatorio usando calor bajo (<40 ° C). Utilizando disolvente mínima, transferir el extracto seco a un vial de centelleo de 20 ml. Colocar el vial con un adaptador evaporador rotatorio y otra vez evaporar a sequedad en un evaporador rotatorio usando calor bajo (<40 ° C).
Nota: El siguiente paso requiere el uso de un instrumento de compresión hecha en casa que puede ser montado atornillando los siguientes elementos en orden secuencial en el extremo de una varilla roscada: (1) tuerca, (2) la arandela, y (3) la tuerca ciega. La arandela o bien debe ser perforada oequipado de modo que sea menor que el diámetro interno de un tubo de centrífuga de 50 ml. - Volviendo al tubo de centrífuga graduado que contiene el tejido y MeOH: extracto de agua, apriete el medio de extracción de tejido a través de la compresión. Transferir el MeOH: extracto de agua, al mismo matraz de fondo redondo y almacenar refrigerada (<10 ° C).
- Añadir MeOH al tubo de centrífuga graduado hasta que el tejido se sumerge ahora deshidratados para una segunda extracción de 2 a 6 hr duración, a continuación, transferir la nueva MeOH extraer al matraz de fondo redondo refrigerado que contiene el MeOH: extracto de agua. Si hay alguna preocupación de que el tejido no ha sido completamente extraída, repetir la extracción MeOH 2 a 6 hr.
- Seque el MeOH en un evaporador rotatorio usando calor bajo (<40 ° C). Transferir el extracto acuoso restante del matraz de fondo redondo al vial de centelleo que contiene el extracto no polar seco, usando un volumen mínimo de MeOH para enjuagar el matraz de fondo redondo.
- Evaporate el extracto acuoso a sequedad usando calor bajo (<40 ° C) en un concentrador de vacío. El vial de centelleo ahora contiene el extracto orgánico seco total bruta de 10 ml de tejido. Evacuar el espacio superior del vial con gas N2 para evitar la oxidación, sellar herméticamente y almacenar congelado (-20 ° C).
2) Preparación de Alimentos
- Preparar calamar polvo manto liofilizado.
Nota: manto de jibia proporciona una fuente de nutrición que es comparable a la de otros invertebrados bénticos, y será usada como un ingrediente en las subetapas de 2,2.- Anillos Descongele del manto de jibia en desionizada caliente (DI), entonces ellos hacen puré en una licuadora de alta velocidad.
- Vierta una fina capa de manto de jibia en puré en una bandeja de horno poco profunda y la congelación (-20 ° C), luego romper la hoja de puré de calamar congelado en trozos pequeños a liofilizar.
- Liofilizar el puré de manto de jibia congelada siguiendo los procedimientos operativos de la freeze de pelo.
- Pulverizar las piezas liofilizadas de puré de manto de jibia en un mezclador de alta velocidad para formar un polvo.
- En una campana de extracción, vierta el manto de jibia en polvo en un tamiz de harina rotativo y tamizar para separar grandes trozos de tejido del polvo fino.
- Transferir el fino manto de jibia en polvo a un recipiente hermético. Evacuar el espacio superior del recipiente con gas N2 para evitar la oxidación y almacenar congelado (-20 ° C).
- Preparar la mezcla de alimentos.
Nota: cuando se ejecutan múltiples ensayos consecutivos, es práctico para preparar ~ 100 ml de mezcla de comida, sin embargo esta receta puede hacerse a escala en volúmenes más pequeños si es necesario.- Combinar una mezcla de 3 g de ácido algínico y 5 g de polvo liofilizado manto de jibia con 100 ml de agua DI en un vaso de precipitados de 150 ml. Se agita vigorosamente con una microespátula durante unos minutos hasta que el polvo está completamente hidratado y la mezcla es homogénea.
Nota: Si lo desea, colorante de alimentos se puede añadir en este ptep: es más fácil añadir colorante a la mezcla de la comida que va a generar ambas mezclas tratados y de control (enmascarar el pigmento natural del extracto en la mezcla de extracto de tratados) en lugar de tratar de hacer coincidir el color de la mezcla de extracto de tratados mediante la adición teñir a la mezcla de control. Un color verdoso o pardusco alimentos es a menudo deseable para enmascarar cualquier pigmentos en el extracto crudo. - Cargar exactamente 10 ml de mezcla de alimentos en una jeringa graduada. Tenga cuidado para evitar la inclusión de burbujas de aire durante este proceso.
- Retire el vial de centelleo de 20 ml con extracto orgánico crudo seco del congelador. Añadir una o dos gotas de MeOH, luego añada el extracto en una mezcla homogénea con un microespátula.
- Expulsar el cargado de la jeringa 10 ml de la matriz de los alimentos en el vial de centelleo de 20 ml y se agita con una microespátula para homogeneizar la mezcla de alimentos tratados con el extracto.
Nota: Puede ser útil para expulsar la jeringa en incrementos más pequeños (es decir, expulsar 2 ml y homogeneizar, entonces r.EPEAT hasta que todos los 10 ml se han homogeneizado).
- Combinar una mezcla de 3 g de ácido algínico y 5 g de polvo liofilizado manto de jibia con 100 ml de agua DI en un vaso de precipitados de 150 ml. Se agita vigorosamente con una microespátula durante unos minutos hasta que el polvo está completamente hidratado y la mezcla es homogénea.
- Preparar las pastillas de ensayo.
- Cargar un volumen muy pequeño de la mezcla de extracto (~ 1 ml) en una jeringa, y sumergir la punta de la jeringa en una solución de 0,25 M de CaCl2. Expulsar el contenido de la jeringa para formar una hebra de espagueti largo.
- Después de unos minutos, retire el hilo endurecido, cortar en 4 mm gránulos largos en una tabla para cortar vidrio con una hoja de afeitar, luego enjuague con agua de mar.
- Repita los pasos 2.3.1 y 2.3.2 sin incluir extracto de tejido para hacer bolitas de control. Asegúrese de tratar bolitas de control con un volumen equivalente de disolvente (ver adición de MeOH a la mezcla tratada en la etapa 2.2.3) para el control de la adición de disolvente. Si se desea un control negativo para confirmar que los peces ensayo puede ser disuadido de alimentación, añadir benzoato de denatonio a una concentración de 2 mg ml -1 a la mezcla de alimentos crudos 27.
3) La palatabilidadLos bioensayos
- Realizar ensayos de alimentación con el pez cabeza azul silvestre amarilla fase, Thalassoma bifasciatum, mantenidos en grupos de tres en compartimentos opacos lados de acuarios de laboratorio.
- Entregar bolitas de comida de un vaso de agua de mar con una pipeta de vidrio con una pera de goma. Nota: Puede tomar algunos días para entrenar a los peces a recibir alimentos de esta manera. Un estímulo acondicionado (por ejemplo, un par de toques de la pipeta sobre el cristal del acuario) que precede a la entrega de los alimentos puede ser útil para entrenar a los peces a esperar la adición de bolitas de comida.
- La puntuación pellets. Considere un pellet aceptada si se consume fácilmente por los peces. Considere un pellet rechazada si no se consumen después de un mínimo de tres intentos de uno o más peces para tomar en su cavidad bucal, o si el sedimento se acercó e hizo caso omiso después de uno de esos intentos.
- Muestras de puntuación. Nota: El procedimiento de ensayo es representado como un diagrama de flujo en la Figura 1 Grupos de peces que se niegan a comer.Bolitas de control en cualquier paso en el protocolo no se consideran aún más. Hay dos posibles resultados de una única prueba de la prueba: la muestra se acepta o se rechaza.
- Comienza con una bolita de control para confirmar que el grupo de peces es cooperativa. Ofrecer un pellet tratada. Si los peces aceptan la pastilla tratada, la puntuación de la muestra aceptada. Si los peces rechazan el sedimento tratado, ofrecer una pastilla de control posterior para determinar si los peces han dejado de alimentación. Si los peces aceptan la pastilla de control posterior, la puntuación de la muestra ha sido rechazada.
- Replicación. Repita el procedimiento de ensayo con diez grupos independientes de pescado para cada extracto.
4) Importancia Evaluación
- Evaluar la importancia de las diferencias en el consumo de control frente gránulos tratados con una versión modificada de la prueba exacta de Fisher 26. Modificar la prueba por lo que los totales marginales para el control y pellets tratados son fijos, Tratándolos ambas muestras aleatorias. Nota: Esto proporciona p = 0,057 cuando se comen 7 pelotillas; por lo tanto, cualquier extracto se considera elemento de disuasión si se consumen 6 o menos bolitas, y agradable al paladar si se comen 7 o más pastillas.
- Para comparar la palatabilidad relativa entre grupos de extractos, calcular una media del número de gránulos comidos dentro de cada grupo. Mantenga el umbral en 6 gránulos así que un grupo de extractos replicados se entienden disuasorio si el número medio de gránulos comido + error estándar (SE) ≤6. NOTA: En los resultados representativos, la asignación de grupo es la especie, por lo que replican extractos provienen de individuos distintos y la palatabilidad relativa se pueden comparar entre las especies.
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Resultados
Aquí mostramos los resultados de este bioensayo para seis especies de esponjas del Caribe comunes (Figura 2). Estos datos fueron publicados inicialmente en 1995 por Pawlik et al. 12 y demuestran el poder de este enfoque para estudiar las diferencias en las estrategias de defensa química entre concurrentes taxones. Los resultados se presentaron como una media del número de bolitas de comida comido + error estándar (SE) para cada especie. Casi no hay sedimentos se comen en ensayos con ...
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Discusión
El procedimiento descrito en este documento proporciona un protocolo relativamente simple, de laboratorio ecológicamente relevante para la evaluación de las defensas químicas antidepredación en los organismos marinos. En este artículo revisamos los criterios importantes que son satisfechas por este conjunto de métodos:
(1) predador apropiado. Este ensayo de alimentación emplea el pez cabeza azul, Thalassoma bifasciatum, uno de los peces más abundantes en los arrecifes de co...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Agradecemos a James Maeda y Aaron Cooke por su ayuda en la filmación y edición de este video. La financiación fue proporcionada por la Fundación Nacional de Ciencias (OCE-0550468, 1029515).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Diclorometano | Fisher Scientific | D37-20 | |
| Metanol | Fisher Scientific | A41220 | |
| Cloruro de calcio anhidro | Fisher Scientific | C614-500 | |
| Cryocool Fluido de transferencia de calor | Fisher Scientific | 20-548-146 | Para concentrador de vacío |
| Ácido algínico Sal de sodio MP de alta viscosidad | |||
| Anillos de manto de calamar | N/A | N/A | Se puede comprar en la tienda de comestibles |
| Benzoato de denatonio | Aldrich | D5765 | |
| Tubo de centrífuga graduado de 50 ml | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Frasco de centelleo de 20 ml | Fisher Scientific | 03-337-7 | |
| Pipetas Pasteur desechables | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Bombillas de goma para pipetas Pasteur | Fisher Scientific | 03-448-24 | |
| Bombillas rojas para la entrega de pellets | Fisher Scientific | 03-448-27 | |
| Matraz de fondo redondo de 250 ml | Fisher Scientific | 10-067E | |
| Adaptador de vial de centelleo para rotavap | Fisher Scientific | K747130-1324 | |
| Weightboats | Fisher Scientific | 02-202B | |
| Microespátula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Jeringa graduada de 5 ml | Fisher Scientific | 14-817-53 | |
| Jeringa graduada de 10 ml | Fisher Scientific | 14-817-54 | |
| Hoja de afeitar | Fisher Scientific | S17302 |
Referencias
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