Se proporciona un protocolo para utilizar un Laberinto de Campo Abierto para acceder a la actividad locomotora general, la ansiedad y la emocionalidad en un modelo de ratón de laboratorio.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
El uso del campo Maze abierto para medir el comportamiento locomotor y la ansiedad-como en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
Los modelos animales han demostrado ser invaluables para los investigadores que intentan responder preguntas sobre los mecanismos del comportamiento. El Laberinto de Campo Abierto es una de las plataformas más utilizadas para medir comportamientos en modelos animales. Es una prueba rápida y relativamente fácil que proporciona una variedad de información conductual que va desde la capacidad ambulatoria general hasta datos sobre la emocionalidad del animal sujeto. En lo que se refiere a los modelos de roedores, el procedimiento permite el estudio de diferentes cepas de ratones o ratas, tanto criados en laboratorio como capturados en la naturaleza. La técnica también se presta fácilmente a la investigación de diferentes compuestos farmacológicos para efectos ansiolíticos o ansiogénicos. Aquí, se detalla un protocolo para el uso del laberinto de campo abierto para describir los comportamientos de los ratones y se realiza un análisis simple de la capacidad locomotora general y los comportamientos emocionales relacionados con la ansiedad entre dos cepas de ratones C57BL/6. Brevemente, utilizando el protocolo descrito, mostramos que los ratones de tipo salvaje exhibieron significativamente menos comportamientos relacionados con la ansiedad que los ratones Knock Out de la misma edad, mientras que ambas cepas exhibieron una capacidad ambulatoria similar.
Introducción
El Laberinto de Campo Abierto (OFM) se desarrolló inicialmente en 1934 como una prueba para medir la emocionalidad en roedores1. Ha alcanzado el estatus de ser una de las medidas de comportamiento más utilizadas en psicología animal2. Proporciona una evaluación fácil y bastante rápida de comportamientos bien definidos que no requiere capacitación para el sujeto de prueba y poca o ninguna capacitación especializada para el ser humano que administra la prueba. Estos atributos han llevado a un uso generalizado del laberinto de campo abierto en investigaciones extendidas a otras especies animales como terneros, cerdos, conejos, primates, abejas melíferas y langostas3. Parte de su popularidad se debe al hecho de que los conceptos psicológicos y fisiológicos que subyacen a las pruebas son generalmente sencillos y bien entendidos. Por ejemplo, se ha postulado que las fuerzas evolutivas han seleccionado una respuesta común en los animales, de modo que la mayoría de las especies muestran respuestas de miedo o huida mediadas por ansiedad a estímulos específicos. Los roedores, por ejemplo, muestran claras aversiones a los entornos grandes, brillantemente iluminados, abiertos y desconocidos4. Podemos suponer que han sido condicionados filogenéticamente para ver este tipo de entornos como peligrosos. Todas estas características se incorporan en el laberinto de campo abierto y forman la base de su uso en las pruebas de paradigma conductual.
Un laberinto de campo abierto consiste en un área cerrada con una pared que tiene la altura suficiente para evitar que el sujeto escape. Las formas típicas de los laberintos son circulares o cuadradas con un área lo suficientemente grande, según el tamaño del sujeto examinado, para provocar una sensación de apertura en el centro del laberinto. Se pueden puntuar varias variables en el laberinto de campo abierto, con la mayoría de los parámetros que involucran diferentes tipos de actividad motora2. La deambulación es el comportamiento más común estudiado, pero también se pueden medir otros como la latencia o la crianza. La mayoría de las veces, el comportamiento de los roedores se analiza en un laberinto desnudo. Sin embargo, la adición de objetos, ya sea uno o muchos al suelo del laberinto, añade la capacidad de ver cómo el sujeto interactúa con nuevosestímulos adicionales. Los parámetros relevantes cuando se presentan objetos suelen ser el número de acercamientos a un objeto o, en algunos casos, la preferencia o aversión por un objeto sobre otro.
Muchas pruebas conductuales de ansiedad se basan en la actividad corporal y la locomoción del animal sujeto5. La interpretación de las pruebas conductuales para la emocionalidad al tiempo que se separan los factores de confusión no emocionales, como la actividad motora, ha sido objeto de un intenso debate6,7. Tal y como se describió originalmente la OFM, se pueden deducir dos medidas de emocionalidad, la actividad locomotora y los depósitos de boli fecal o defecación1. Sin embargo, en algunos estudios se ha demostrado que estas dos medidas no están relacionadas, lo que apoya la conclusión de que la emocionalidad en roedores es multidimensional5. En cualquier caso, las discrepancias en la literatura con respecto a estas medidas y la emocionalidad o ansiedad en modelos de ratón pueden atribuirse a diferencias en los criterios de análisis o diferencias en los procedimientos de prueba. Los estudios han vinculado de manera concluyente los resultados del análisis OFM con otras medidas de ansiedad al comparar modelos de ratón8.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
NOTA: Todos los procedimientos realizados aquí fueron presentados y aprobados por IACUC (Oficina de Cumplimiento de Investigación) y se llevaron a cabo siguiendo las directrices del NIH. Los ratones utilizados en el paradigma de las pruebas de comportamiento eran ingenuos y no se utiliza para otras pruebas. La C57BL / 6 de tipo salvaje y ratones knock out utilizado en este protocolo se han descrito anteriormente 9 y los datos presentados aquí son de ese manuscrito.
1. Preparación de la sala de pruebas y Aparato campo abierto
- Utilice un laberinto campo abierto unidad múltiple (OFM) que consta de cuatro cámaras de actividad se utilizó para este análisis (Figura 1). Cada cámara de medida 50 cm (longitud) x 50 cm (ancho) x 38 cm (altura) y se hizo desde el blanco de alta densidad y de plástico no poroso.
- Textura Las plantas del laberinto para la tracción durante la deambulación mientras que las paredes del laberinto eran lisas. Cuadrantes Maze eran completamente vacía para el propósito de esta prueba. En consideración a el resto de este protocol, un único cuadrante del laberinto se ha descrito anteriormente se utilizará para demostrar la OFM.
- Limpiar la cámara con un 95% de etanol antes de su uso y antes de las pruebas posteriores para eliminar cualquier olor pistas dejadas por el sujeto ratón anterior.
- Deje que el etanol se evapore completamente antes de probar los ratones. Esto puede tomar 5-10 minutos entre cada sesión de evaluación.
- Para este análisis, utilice el software SMART Seguimiento por vídeo de Aparato PanLab / Harvard para registrar y evaluar el movimiento del ratón.
NOTA: Cualquier cámara de seguimiento de vídeo comercial y el software se pueden utilizar para realizar un seguimiento del sujeto de prueba y evaluar los resultados del laberinto campo abierto. Es muy importante para el usuario final para comprender cómo calibrar y ejecutar el software utilizado para cada análisis individual. Independientemente de la cámara de vídeo y software de seguimiento utilizado, se obtienen mejores resultados cuando la cámara y el software están calibrados correctamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. - Realice la prueba inorma na sala capaz de contener el aparato laberinto y el equipo necesario para ejecutar el software iluminado. Suspender la cámara de vídeo por encima del laberinto bien asociándolo al techo o utilizando cualquier sistema de soporte elevada que permite el lente de la cámara para ver toda la zona de laberinto (Figura 2).
- Como administrador humano de la prueba, asegúrese de tener suficiente espacio en la sala de estar completamente inobservable por los sujetos de prueba en el laberinto para no influir en el comportamiento de los ratones.
2. Preparar el software para medir la actividad
- Abra el software de seguimiento de vídeo.
- Una vez que el software se abre, mover el cursor a la opción "seguimiento de un solo sujeto" que se encuentra bajo la pestaña de "Adquisición de datos" y solo clic para abrir esta opción.
- Elija la opción "fondo estático", ubicado en la parte inferior de la pantalla.
- Después de elegir "fondo estático" es elegidon, es necesario utilizar el software para tomar una imagen del laberinto antes de la adición de los sujetos de prueba. Para ello, mueva el cursor en el botón "Foto", ubicado en la parte inferior de la pantalla y solo clic.
NOTA: El software tomará una foto del escenario sin el sujeto de prueba que se restará de la imagen tomada durante el proceso de seguimiento. Esto resulta en sólo el movimiento del sujeto que se analiza por el software. - Confirme que la imagen de fondo tomada anteriormente se extrae completamente el software de seguimiento al mover el cursor en el botón "Test" situado en la parte inferior de la pantalla y haciendo clic una vez. Un campo sólido blanco se mostrará si la imagen de fondo se elimina completamente de la imagen de seguimiento. Si las condiciones de iluminación cambian o el laberinto es accidentalmente movido, podrás ver "sombras" negros en este campo que indica las dos imágenes no coinciden perfectamente. Para remediar esta situación, simplemente repita step 2.4 anteriormente.
- Después de confirmar la configuración del fondo, utilice la opción de sincronización para configurar el modo de tiempo se controla durante la adquisición. Para ello, mueva el cursor a la pestaña "Configuración" y haga clic una vez en el título "Tiempos". Utilice la nueva ventana abierta para entrar en parámetros experimentales.
- Para este protocolo, eligió la opción "Tiempo programado" como el período de seguimiento de 10 min. Ajuste el "período de latencia" a 5 segundos para dar tiempo al usuario colocar el ratón en el centro del laberinto y alejarse antes de iniciar el seguimiento. Introduzca el "Tiempo de adquisición" de 10 min para la duración de la prueba. Ajuste la "Llave de Paso" en "Cuando el tiempo programado (10 min) ha terminado", que se apagará automáticamente la cámara y la función de seguimiento del software.
- Mueva el cursor sobre el botón "Cerrar" después de todos los tiempos se han establecido para cerrar la ventana. Ahora está listo para iniciar la pruebaing procedimiento.
3. Administración de la prueba de campo abierto
NOTA: El paquete de software utilizado en este protocolo permite el seguimiento de hasta 16 ratones individuales al mismo tiempo. Para facilidad de realización y como se mencionó anteriormente, el protocolo descrito aquí es para un solo ratón utilizando un único cuadrante de la OFM. Para el equipo utilizado para este protocolo, un máximo de 4 ratones individuales podría ser rastreado utilizando cada cuadrante del laberinto. Si la utilización de un laberinto de múltiples recinto, después de realizar el primer tema del ratón en su cuadrante definido, coloque los ratones restantes en su respectivo cuadrante laberinto para el seguimiento de análisis. A los fines de este protocolo, más instrucción será específico para un solo cuadrante del laberinto.
- Llevar los ratones en sus jaulas de su habitación vivienda en la sala de pruebas. Permita que los ratones se aclimate a la sala de procedimientos por un mínimo de 30 minutos antes de comenzar la prueba.
- Quitar una sola mOuse desde la jaula de alojamiento agarrando suavemente su cola y colocar el ratón en el centro del laberinto campo abierto, mientras que al mismo tiempo activar el software SMART con un simple clic en el botón Inicio para comenzar a rastrear el movimiento del ratón. Es normal que el ratón para desplazarse inmediatamente a las paredes de la periferia del laberinto y el momento de la liberación y el seguimiento de la captura del ratón debe coincidir para registrar este movimiento.
- Permitir el movimiento libre e ininterrumpido del ratón asignatura a lo largo del respectivo cuadrante del laberinto para un único período de 10 minutos durante los cuales, el software de seguimiento registrará movimiento (Figura 3).
- Al final del período de prueba, recoge el tema del ratón suavemente, de sacarlo del laberinto y devolverlo a su jaula.
- Antes de limpiar el laberinto, contar visualmente los pellets boli fecales presentes en el laberinto y anote los números para su posterior análisis manualmente.
- Quite todos los sedimentos fecales y limpie todos los puntos de la micción. Rocíe el piso y las paredes del cuadrante laberinto con etanol al 95% y limpie con una toalla de papel limpia. Deje que la solución de etanol que se seque completamente antes de probar otros ratones.
- Repetir el procedimiento con el siguiente ratón.
4. Medición y Análisis de Comportamiento Durante el Procedimiento de Pruebas
NOTA: Para la medición, tres aspectos de la conducta campo abierto se caracterizan fácilmente utilizando este protocolo (véase el debate). Una breve instrucción sobre cómo acceder a estas medidas en el software de seguimiento de vídeo sigue.
- Desde la pantalla principal del software SMART, mover el cursor a la ficha y solo clic "zonas" "Definición" para abrir el Editor de Zona.
- Siga las instrucciones detalladas en el Manual del usuario del software SMART no definir zonas o rejillas de la superposición en los caminos de seguimiento. Aquí, el software se utiliza para definir una cuadrícula de 10 cm cuadrados que cubren el suelo del laberinto 5 x 5 ( Figura 4). Asegúrese de guardar el archivo de zona creada antes de cerrar el Editor de Zona.
- Desde la pantalla principal del software SMART, mover el cursor a la pestaña "Análisis" y solo clic para abrir la ventana de Análisis de Datos.
- Mueva el cursor a la ficha "Archivo" y abra el archivo Zona creado anteriormente.
- Mueva el cursor a la pestaña "Configuración" y abra la opción "Análisis de pista". Esto abrirá la ventana "Configuración de análisis de un solo sujeto".
- Mueva el cursor a la pestaña "Standard" y mueva el parámetro "distancia recorrida" en el cuadro Parámetros Disponible (lado izquierdo) a la caja de parámetros incluidos (lado derecho).
- Mueva el cursor a la pestaña "Zonas Transiciones" y mover todos los parámetros adecuados para el cuadro Parámetros Incluido como anteriormente.
- Asegúrese de que la casilla de "Full Track" está marcada en la parte inferior de la ventana.
- Move el cursor al botón OK y cierre la ventana de configuración de análisis de una sola materia.
NOTA: En función del análisis que desea realizar, muchas otras opciones se pueden elegir en esta ventana para extraer datos de los análisis. Lea el manual del usuario detallado de su programa específico para determinar qué parámetros son los más importantes para el análisis de sus datos.
- En la ficha Archivo en la parte superior izquierda de la ventana del programa, abra la ventana sola pista tema y colocar una marca de verificación junto a todas las pistas están analizando. Mueva el cursor hasta el botón Marca de Verificación en la parte superior de la ventana y haga clic en para cerrar la ventana Track Explorer.
- Mueva el cursor sobre el botón "Go" en la ventana de Análisis de Datos y solo clic para iniciar el análisis de los datos de la pista.
- Análisis de datos se pueden enviar ya sea como archivos de texto ASCII o puede ser exportado directamente en una hoja de cálculo Excel. Utilice las herramientas de salida del programa de software que está utilizando para dar salida al data para su propio uso.
NOTA: la distancia total recorrida y el tiempo empleado en las zonas indicadas se emitirá siguiendo los pasos de análisis de datos antes mencionados. Una vez más, se hace hincapié en que los pasos para llegar a estas mediciones representadas aquí será diferente dependiendo del software de usuario utilizado. Pero los propios datos y la interpretación de los resultados deben ser independientes similar del programa de software utilizado. También vale la pena señalar que el sesgo de administrador de la prueba se elimina de este protocolo ya que todos los datos recogidos se cuantifica datos medidos por el software y no el administrador. Por lo tanto no hay ningún elemento calificable de los datos recogidos tal como se describe.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El número promedio de individuos por cepa de ratones ensayados en la mayoría de los casos es de aproximadamente 20 para generar suficiente relevancia estadística. Sin embargo, este número puede estar en el intervalo de 8-30 dependiendo de la disponibilidad del ratón. Dependiendo de la medición o comparaciones requeridas, también es favorable para utilizar los sujetos de la misma edad.
La primera y posiblemente más importante parámetro específico de medir en el campo Maze Open es la distancia...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El Open Field Maze es una de las plataformas más utilizadas en los estudios de comportamiento animal. Una serie de importantes parámetros convencionales y etológicas 2,4 puede ser recogida y analizada durante la realización de la OFM. Estos datos permiten al investigador para medir los comportamientos que van desde la actividad general de la locomotora a comportamientos emocionales relacionados con la ansiedad 8. Sin embargo, el uso de OFM no está exenta de defectos. Un problema confuso es la ampli...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud (NIH-2RO1NS033661) y por la Estación Experimental Agrícola de Alabama (HATCH ALA021-1-09017).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Prueba de campo abierto de unidades múltiples | San Diego Instruments, Inc. | Blanco 7001-0354 | Se puede utilizar cualquier laberinto de campo abierto de una o varias unidades |
| SMART DT Software de seguimiento | PanLab/Harvard Apparatus | 76-0695 | Cualquier software de seguimiento se puede utilizar con este protocolo |
| Grabadora de cámara de video Sony 990x | Sony | CCD-TRV328 | Cualquier cámara de video adecuada se puede conectar a la computadora para grabar perfiles de seguimiento. |
Referencias
- Hall, C. S. Emotional behavior in the rat: defecation and urination as measures of individual differences in emotionality. J. Comp. Psychol. 18, 385-403 (1934).
- Walsh, R. N., Cummins, R. A. The open field test: a critical review. Psychol. Bull. 83, 482-504 (1976).
- Prut, L., Belzung, C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: a review. Eur. J. of Pharm. 463, 3-33 (2003).
- Choleris, E., Thomas, A. W., Kavaliers, M., Prato, F. S. A detailed ethological analysis of the mouse open field test: effects of diazepam, chlordiazpoxide and an extremely low frequency pulsed magnetic field. Neurosci. Biobehav. Rev. 25, 235-260 (2001).
- Ramos, A. Animal Models of anxiety: do I need multiple tests. TIPS. 29, 493-498 (2008).
- Archer, J. Tests for emotionality in rats and mice: a review. Anim. Behav. 21, 205-235 (1973).
- Gray, J. A. Emotionality in male and female rodents: a reply to Archer. Brit. J. Psych. 70, 425-440 (1979).
- Carola, V., D’Olimpio, F., Brunamonti, E., Mangia, F., Renzi, P. Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behavior in inbred mice. Behav. Brain Res. 134, 49-57 (2002).
- Ramesh Babu, J., Seibenhener, M. L., Peng, J., Strom, A. L., Kemppainen, R., Cox, N., Zhu, H., Wooten, M. C., Diaz-Meco, M. T., Moscat, J., Wooten, M. W. Genetic inactivation of p62 leads to accumulation of hyperphosphorylated tau and neurodegeneration. J. Neurochem. 106, 107-120 (2008).
- Simon, P., Dupuis, R., Costentin, J. Thigmotaxis as an index of anxiety in mice: influence of dopaminergic transmissions. Behav. Brain Res. 61, 59-64 (1994).
- Denenberg, V. H. Open-field behavior in the rat: what does it mean. Ann. N.Y. Acad. Sci. 159, 852-859 (1969).
- Stanford, S. C. The open field test: reinventing the wheel. J. Psychopharm. 21, 134-135 (2007).
- Ennaceur, A. Tests of unconditional anxiety – pitfalls and disappointments. J. Phys. Behav. 135, 55-71 (2014).
- Borta, A., Schwarting, R. K. Inhibitory avoidance, pain reactivity, and plus-maze behavior in Wistar rats with high versus low rearing activity. J. Phys. Behav. 84, 387-396 (2005).
- Costall, B., Jones, B. J., Kelly, M. E., Naylor, R. J., Tomkins, D. M. Exploration of mice in a black and white test box: validation as a model of anxiety. Pharmacol. Biochem. Behav. 32, 777-785 (1989).
- Bouwknecht, J. A., Paylor, R. Pitfalls in the interpretation of genetic and pharmacological effects on anxiety-like behavior in rodents. Behav. Pharm. 19, 385-402 (2008).
- Webster, D. G., Baumgardner, D. J., Dewsbury, D. A. Open field behavior in eight taxa of muriod rodents. Bull. Psychonom. Soc. 13, 90-92 (1979).
- Wilson, R. C., Vacek, T., Lanier, D. L., Dewsbury, D. A. Open field behavior in muroid rodents. Behav. Biol. 17, 495-506 (1976).
- Crawley, J. N. Behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice: experimental designs and evaluation of general health, sensory functions, motor abilities and specific behavioral tests. Brain Res. 835, 18-26 (1999).
- Simon, P., Dupuis, R., Costentin, J. Thigmotaxis as an index of anxiety in mice. influence of dopaminergic transmissions. Behav. Brain Res. 61, 59-64 (1994).
- Miller, B. H., Schultz, L. E., Gulati, A., Su, A. I., Pletcher, M. T. Phenotypic characterization of a genetically diverse panel of mice for behavioral despair and anxiety. PLoS One. 5, e14458(2010).
- Tannenbaum, B., Anisman, H. Impact of chronic intermittent challenges in stressor-susceptible and resilient strains of mice. Biol. Psych. 53, 292-303 (2003).
- Lister, R. G. Ethologically-based animal models of anxiety disorders. Pharmacol. Ther. 46, 321-340 (1990).
- Kulesskaya, N., Voikar, V. Assessment of mouse anxiety-like behavior in the light-dark box and open-field arena: role of equipment and procedure. Phys. Behav. 133, 30-38 (2014).
- Han, H., Du, W., Zhou, B., Zhang, W., Xu, G., Niu, R., Sun, Z. Effects of chronic fluoride exposure on object recognition memory and mRNA expression of SNARE complex in hippocampus of male mice. Biol. Trace Elem. Res. 158, 58-64 (2014).
- Barrow, P., Leconte, I. The influence of body weight on open field and swimming maze performance during the post-weaning period in the rat. Lab. Animals. 30, 22-27 (1996).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
