El código de barras genético con proteínas fluorescentes para aplicaciones multiplexados

Summary

Desde el descubrimiento del gen de la proteína fluorescente verde, las proteínas fluorescentes han impactado en la biología celular molecular. Este protocolo describe cómo se utiliza la expresión de distintas proteínas fluorescentes a través de la ingeniería genética para codificar células individuales. El procedimiento permite el seguimiento de distintas poblaciones en una mezcla de células, lo que es ideal para aplicaciones multiplexadas.

Abstract

Las proteínas fluorescentes, los colorantes fluorescentes y los fluoróforos en general han revolucionado el campo de la biología celular molecular. En particular, el descubrimiento de las proteínas fluorescentes y sus genes ha permitido la ingeniería de fusiones de proteínas para la localización, el análisis de la activación transcripcional y la traducción de proteínas de interés, o el seguimiento general de células individuales y poblaciones celulares. El uso de genes de proteínas fluorescentes en combinación con la tecnología retroviral ha permitido aún más la expresión de estas proteínas en células de mamíferos de manera estable y fiable. Aquí se muestra cómo se pueden utilizar estos genes para dar a las células dentro de una población de células su propia biofirma. Como la biofirma se logra con la tecnología retroviral, las células tienen un código de barras "indefinido". Como tales, se pueden rastrear individualmente dentro de una mezcla de celdas con códigos de barras y utilizar en aplicaciones biológicas más complejas. El seguimiento de distintas poblaciones en una mezcla de células es ideal para aplicaciones multiplexadas, como el descubrimiento de fármacos frente a multitud de dianas o el perfil de activación de diferentes promotores. El protocolo describe cómo desarrollar y amplificar elegantemente células de mamíferos con códigos de barras con distintos marcadores genéticos fluorescentes, y cómo usar varios marcadores a la vez o un marcador a diferentes intensidades. Por último, el protocolo describe cómo se pueden utilizar las células en combinación con ensayos basados en células para aumentar la potencia de análisis a través de la multiplexación.

Introduction

Tecnologías como la espectroscopia de fluorescencia, microscopía de fluorescencia y citometría de flujo, todos se basan en la fluorescencia, una propiedad ampliamente explotado en aplicaciones bioquímicas, biomédicas y químicas. Fluorescencia, ya sea intrínseco o mediante el etiquetado, se ha explotado para el análisis de patrones de expresión de la proteína y perfiles, el destino celular, interacciones de proteínas y funciones biológicas ^1-9, y por medio de la fluorescencia / Förster de transferencia de energía de resonancia para la detección de interacciones de biomoléculas y los cambios conformacionales ^10-13. Desde el aislamiento de la prote....

Protocol

1. Preparación de células de mamíferos, la producción viral y Transducción de códigos de barras genético

1. Placa de 2,5 x 10 ⁶ células adherentes en una placa de 10 cm (o alrededor de 50-60% de confluencia) un día antes de la transfección en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero de ternera fetal (FCS). Para retroviral uso de producción de envases línea celular de elección, como Phoenix-GP (una especie de regalo de Gary Nolan, la Universidad de Stanford).
   NOTA: La línea celular de empaquetamiento expresa de forma estable las proteínas Gag y Pol para la formación de partículas retrovirales en trans. Hacer que las....

Results

Multiplexing fluorescente barcoded genéticamente células con el propósito de aplicaciones biológicas sólo puede lograrse una vez que se han generado poblaciones clonales individuales. Multiplexación es más efectiva cuando las poblaciones con códigos de barras tienen características fluorescentes distintas claras con solapamiento espectral mínima. El ejemplo mostrado en la Figura 1 con poblaciones clonales de células de mamíferos SupT1 ilustra que las células con códigos de barras con mCherry y proteína .......

Discussion

Aquí dos procedimientos bien establecidos se han combinado; la ingeniería genética a través de la tecnología retroviral y la detección de proteínas fluorescentes utilizando citometría de flujo. Los códigos de barras genético basado en una proteína fluorescente para la producción de líneas celulares únicos proporciona una manera simple y robusta para aplicaciones multiplexados. La generación de células con código de barras de ingeniería genética a través de la tecnología retroviral, es un principio de un largo proceso, p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Jeringas de 10 ml	BD 309604		utiliza para filtrar el virus
0.45 µ m ployfiltro de tetrafluoroetileno	Pall Corporation	4219	utilizado para filtrar el virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	45000-304 medios de	crecimiento celular para células HEK 293T
PEI (polietilenimina)	poly sciences	23966-2	2 mg/ml utilizada
Centrífuga de cubeta colgante (refrigerada)	Eppendorf	5805 000.017	utilizada para
Corning		21-040-CV	Se utiliza para el lavado de células
Polibreno (bromuro de hexadimetriena)	Sigma-Aldrich	107689	Se utiliza para aumentar la eficacia de la infección viral. Utilizado en un 5 µ concentración de g/ml.
FACSAria	BD Biosciences		Instrumento utilizado para la clasificación de poblaciones celulares
FACSCanto	BD Biosciences		instrumento utilizado para el análisis celular
Phoenix-GP	Gift de Gary Nolan		línea celular utilizada para producir partículas retrovirales
Suero fetal de ternero	Mediatech		MT35015CV utilizado para el crecimiento celular y la clasificación de
células SupT1	ATCC	CRL-1942	Linfoblastos T humanos
Células HEK 293T	ATCC	CRL-11268	Células de riñón embrionario humano que también contienen el antígeno T grande SV40
RPMI 1640	Corning	10-040-CV	medio de crecimiento celular para células SupT1