Caracterización funcional de Na + / H + Intercambiadores de compartimentos intracelular usando selección Protón-matanza para expresarlos a la membrana plasmática

Resumen

La primera parte de este artículo muestra cómo seleccionar líneas celulares mutantes que expresan intercambiadores vesiculares de Na⁺/H⁺ en su membrana plasmática. La segunda parte proporciona protocolos basados en mediciones de pH intracelular y absorción rápida de iones, que se utilizan para determinar la selectividad de iones y los parámetros cinéticos de estos intercambiadores.

Resumen

La acidificación endosomal es crítica para una amplia gama de procesos, como el reciclaje de proteínas y la degradación, la desensibilización del receptor y neurotransmisor de carga en las vesículas sinápticas. Esta acidificación se describe estar mediado por ATPasas de protones, junto a los transportadores de cloruro ClC. Altamente conservadas protones electroneutral transportadores, la Na ⁺ / H ⁺ (NHE) intercambiadores de 6, 7 y 9 también se expresan en estos compartimentos. Las mutaciones en sus genes se han relacionado con enfermedades cognitivas y neurodegenerativas humanas. Paradójicamente, su papel sigue siendo difícil, ya que su localización intracelular ha impedido caracterización funcional detallada. Este manuscrito muestra un método para resolver este problema. Esta consiste en la selección de líneas celulares mutantes, capaces de sobrevivir a la acidificación citosólica aguda mediante la retención de NHEs intracelulares a la membrana plasmática. A continuación, representa dos protocolos complementarios para medir la selectividad y actividad de los ionesde estos intercambiadores de: (i) uno en base a mediciones de pH intracelulares mediante microscopía de fluorescencia de vídeo, y (ii) uno basado en la cinética rápida de la absorción de litio. Estos protocolos pueden ser extrapolados a medir otros transportistas no electrógenos. Además, el procedimiento de selección que aquí se presenta genera células con un fenotipo defectuoso retención intracelular. Por lo tanto estas células también expresar otras proteínas de membrana vesicular en la membrana plasmática. Por consiguiente, la estrategia experimental representado aquí puede constituir una herramienta potencialmente potente para estudiar otras proteínas intracelulares que se expresan a continuación en la membrana plasmática junto con el vesicular Na ⁺ / H ⁺ intercambiadores utilizados para la selección.

Introducción

La mayoría de los compartimentos intracelulares muestran un pH luminal ácida, que es un parámetro clave para la maduración, el tráfico, el reciclaje de las proteínas u hormonas y neurotransmisores de carga. Se ha demostrado que el gradiente de pH entre el citosol y vesicular contenido es generado por vacuolar H ⁺ ATPasas ^1, acoplado a los transportadores vesiculares de cloruro ClC ^2. Tanto en ratones knock-out (KO) y los pacientes humanos, la importancia de estos transportadores ha sido destacada por los fenotipos pesados ​​causadas por mutaciones en sus genes ^3-6.

Los miembros de la familia SLC9A intercambiadores de sodio-hidrógeno, también denominado NHEs de Na ⁺ / H ⁺ intercambiadores, han mostrado ser efectores clave en el pH intracelular y la regulación del volumen celular, así como en el transporte vectorial de equivalentes de ácido-base través de los epitelios . Además de los NHEs de la membrana plasmática, tres altamente conservadas Na ⁺ / H ⁺ intercambiadores, NHE 6, 7y 9 se expresan en la red trans-Golgi y en los endosomas tempranos ^7. Las mutaciones en sus genes se han relacionado con Angelman similar o Christianson Síndromes ^8-9, basado en la familia autismo ¹⁰ y Déficit de Atención e Hiperactividad ^11-12. Estos intercambiadores también han estado involucrados en problemas neurodegenerativos como el Alzheimer y la susceptibilidad a la enfermedad ¹³ genes contiguos retraso mental ligado al cromosoma X síndromes ^14. En conjunto, estos estudios ponen de relieve la importancia de estos NHEs intracelulares en el desarrollo y / o la función cerebral.

La localización intracelular de estos intercambiadores impide mediciones precisas de su selectividad de iones, dirección de transporte, parámetros cinéticos, y la regulación. Como es el caso para todos los transportadores expresados ​​en compartimentos intracelulares, es extremadamente difícil de evaluar sus actividades bioquímicas y por lo tanto para comprender plenamente sus funciones fisiológicas y la mechanismos subyacente sus implicaciones patológicas. En base a la alta concentración citosólica K ^+, la hipótesis más comúnmente aceptada era que estaban trabajando como K ^+, junto transportadores de salida de protones. La existencia de una fuga de protones tales había planteado la hipótesis, ya que puede contrarrestar de bombeo de protones por las V-ATPasas con el fin de mantener un pH constante vesicular estado. El objetivo de este artículo es visual (i) para demostrar un método que permite la selección genética de líneas celulares que expresan tales transportadores vesiculares en su membrana plasmática, y (ii) para mostrar dos enfoques independientes para medir las funciones de estos transportadores.

Hace tres décadas, Pouysségur y Franchi han sido pioneros en un enfoque genético que permitió la clonación molecular y caracterización de los miembros de la familia NHE ^15. Esto se basó en la toxicidad de protones intracelulares como un método de cribado. El primer paso fue obtener líneas celulares deficientesen cualquier / H ⁺ intercambio Na ⁺ expresado en la membrana plasmática, utilizando la reversibilidad de este transportador. Los fibroblastos (línea de células CCL39) se precargados con Na ⁺ o Li ⁺ y luego se colocan en un medio extracelular ácido (pH 6,5) durante 2 horas. Esto condujo a la muerte de las células que expresan un funcional Na ⁺ / H ⁺ de cambio y para la selección de células-antiporter deficiente (línea celular PS120) ^16. Cuando se cultiva en un medio libre de bicarbonato, estas células son muy sensibles a la acidificación intracelular aguda. En consecuencia, se seleccionará positivamente la expresión de cualquier mecanismo de eflujo de protones funcional en la membrana plasmática (véase ^17), si dichas células se someten a acidificación intracelular agudas. Tales técnicas de acidificación pueden ser utilizados para aislar líneas celulares con el tráfico de defectos que permiten la expresión forzada de NHEs intracelulares WT en la membrana plasmática.

Como eucariota Na ⁺ / H⁺ Intercambiadores son electroneutral, que no son mensurables por los métodos electrofisiológicos que se han utilizado con gran éxito para medir canales. Por tanto, este manuscrito demuestra cómo medir la actividad de este intercambiador por mediciones de pH intracelular y cinética rápida de la absorción de litio. Como los conceptos subyacentes son los mismos, es interesante notar que muchos de los procesos desarrollados para la sección de selección también se utilizan directamente para las mediciones funcionales.

Curiosamente, hemos observado que el defecto tráfico presente en las líneas celulares seleccionadas usando el enfoque descrito en este manuscrito conduce a una mayor expresión de otras proteínas vesiculares en la membrana plasmática, tales como el canal de potasio vesicular TWIK1 ^18. Esto señala hacia la selección de un mecanismo general defecto de retención para proteínas transmembrana vesiculares. Por lo tanto este procedimiento de selección y las células que genera mayoconstituyen una herramienta prometedora para la comunidad científica que trabaja en las proteínas de la membrana de los compartimentos intracelulares. Además de las técnicas de medición presentados aquí podrían ser aplicables para el estudio de otros transportistas no electrógenos.

Protocolo

1. H ⁺ Selección Matar

1. Líneas celulares
   1. Transfectar células establemente NHE-deficientes (por ejemplo, la línea celular PS120 CCL39 derivado ¹⁶⁾ utilizando cualquier combinación de vector de expresión de mamífero y el método de transfección que produzca rendimientos de transfección eficientes y selección en una línea celular de fibroblastos.
      NOTA: Durante muchos años, Fosfato de Calcio precipitación ¹⁹ se utilizó con buenos rendimientos de transfección. Esto ha sido reemplazado más recientemente por reactivos comerciales tales como Lipofectamine2000, las transfecciones se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Soluciones
   1. Prepare tres soluciones estériles se describen a continuación. Esterilizar estas soluciones por filtración (0,22 micras).
      1. Preparar una solución de NH ₄ ⁺ Loading (pH 7,4) compuesto por 50 mM NH ₄ Cl, 70 mM de cloruro de colina, 5 mM KCl, 1 mM de MgCl _2, 2 mM CaCl _2, 5 mM glucose y 15 mM MOPS a pH 7,4.
      2. Preparar una solución de enjuague (pH 7,0) compuesta de 120 mM de cloruro de colina, 5 mM KCl, 1 mM de MgCl _2, 2 mM CaCl _2, glucosa 5 mM y 15 mM de HEPES a pH 7,0.
      3. Preparar una solución de recuperación (pH 7,4) compuesto por NaCl 120 mM, 5 mM KCl, 1 mM de MgCl _2, 2 mM CaCl _2, glucosa 5 mM y 15 mM de HEPES a pH 7,4.
3. Antes de comenzar la selección, obtener una incubadora de cultivo celular que puede ser utilizado a 37 ° C sin CO adicional ₂ del tanque externo (denominado CO ₂ - incubadora "libre"), tal como 5% de CO ₂ resultará en búfer que pueden poner en peligro el acidificación. Amplificar la línea celular que expresa el NHE de interés hasta aproximadamente 2 x 10 ⁸ células (típicamente alrededor de 20 confluentes 100 placas mm).
4. H ⁺ procedimiento matar:
   1. Se incuban las células que expresan el NHE intracelular de interés durante 1 hora en la carga de soluciones, en 37 ° C en el incubador de _CO2 exento.
   2. Aspirar la solución de carga y luego enjuague dos veces en la solución descrita aclarado anteriormente. Realice este paso de manera eficiente para eliminar el residual extracelular NH ₄ Cl que puedan afectar a la creación de un gradiente de NH ₄ ⁺ empinada que va a generar la acidificación.
   3. Eliminar el medio de enjuague por aspiración y se incuban las células durante una hora en una solución de recuperación de nuevo a 37 ° C en la incubadora de CO ₂ libre.
   4. Reemplazar el medio de recuperación con medio de cultivo regular (típicamente DMEM con 7,5% de FCS) y crecer las células en condiciones de cultivo estándar (37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de _CO2 y 95% de aire).
5. Repita este ciclo de selección dos veces por semana hasta que los clones estables surgen.
   NOTA: Tenga especial cuidado en relación con el cultivo celular y las condiciones de selección. Meses de trabajo puede ser arruinado por la contaminación que es más propenso a oCCur después de un largo periodo de la cultura y las manipulaciones celulares repetidas.
   1. Aquí, elija si desea amplificar los clones y caracterizar de forma individual se describe con más detalle en las secciones 3.2 o agruparse entre sí para generar una población celular antes de la caracterización.
6. Aplicar selección ocasional (aproximadamente una vez cada dos semanas) para retener las células resistentes a la acidificación por el contador-seleccionar aquellos que puedan haber revertido al fenotipo sensible a los ácidos de los padres (Figura 1B).

2. Las mediciones de pH intracelular

2.1) Imaging pH Fluorescencia

1. Utilice la radiométrica sensible al pH colorante fluorescente BCECF / AM, que es sensible al pH cuando se excita a 490 nm y posee un punto isosbéstico nm 445, siguiendo los protocolos del fabricante.
   1. También puede utilizar otras sondas sensibles al pH, siguiendo los protocolos del fabricante.
2. Utilice una estafa de imágenes setconsistente de un microscopio invertido acoplado a una cámara de vídeo de alta sensibilidad. Equipar este conjunto con 450 nm y 490 filtros de interferencia de banda estrecha nm emparejados con los filtros de densidad neutra cuarzo apropiada para la excitación.
   1. Si es posible, utilice el conjunto adecuado de los filtros y las condiciones de iluminación para configurar los valores de fluorescencia comparables para λ1 y λ2 manera que la relación se aproxima a 1. Evite también los valores de fluorescencia basal que se establecen ya sea saturar o demasiado baja, tanto para λ1 y / o λ2. Esto puede producir artefactos importantes como entonces la relación no puede sido detectable aunque pH intracelular está cambiando.
      NOTA: Este sistema debe permitir la perfusión rápida, la excitación de lapso de tiempo en las dos longitudes de onda antes mencionados y la adquisición en la longitud de onda de emisión adecuada (535 nm para BCECF). Dotar al sistema de software que permite la adquisición automática de datos y almacenamiento.

2.2) Medición de NHE Forward Actividad (Extrusión deLos protones desde el citosol)

1. Se acidifica células mediante una incubación de 1 hora en la solución de NH ₄ ⁺ Carga (véase el paso 1.4) en ausencia de CO _2.
2. Añadir BCECF-AM (concentración final 5 mM) a la solución para los últimos cinco minutos y luego enjuague con NH ₄ ⁺ solución de carga para eliminar la sonda extracelular.
3. Montar las células en el microscopio y tomar varias imágenes para grabar una línea de base estable. Perfundir la solución de lavado (véase más arriba). Esto se traduce en una caída de la fluorescencia correspondiente a la acidificación.
4. Después de la estabilización del pH, perfundir cualquiera de las soluciones dadas a continuación para medir las tasas de recuperación de pH mediadas por Li ⁺ / H ^+, Na ⁺ / H ⁺ o K ⁺ / H ⁺ de cambio. Cada solución contiene un catión de potencial de acoplamiento a ensayar para H ⁺ de cambio. Si uno de ellos es transportado, esto se traducirá en un aumento de fluorescencia a 495 nm que correspond a un aumento en el pH intracelular:
   120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM de MgCl _2, 2 mM CaCl _2, glucosa 5 mM y 15 mM de HEPES a pH 7,4
   NaCl 120 mM, 5 mM KCl, 1 mM de MgCl _2, 2 mM CaCl _2, glucosa 5 mM y 15 mM de HEPES a pH 7,4
   125 mM KCl, 1 mM de MgCl _2, 2 mM CaCl _2, glucosa 5 mM y 15 mM de HEPES a pH 7,4

2.3) Medición de NHE Actividad Inversa

NOTA: El principio aquí es invertir los gradientes iónicos transmembrana.

1. Antes de la medición, cargar las células con el catión intracelular de interés (véase más adelante).
2. Incubar durante 5 min con BCECF / AM (véase el paso 2.2.2); enjuagarlos, montarlos en el microscopio de vídeo.
3. Perfundir la solución de carga y tome varias imágenes a grabar una línea de base estable.
4. Después de la estabilización de la línea de base, la imagen de las variaciones de pH cuando las células se perfunden con un medio ácido extracelular que contiene 120 mM de cloruro de colina, 5 mM KCl, 1 mM de MgCl _2, 2 mM CaCl _2, 5 mM de glucosa y MES 15 mM a pH 6,5.
5. Para LiCl carga, incubar las células durante 2 horas en una solución compuesta de 120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM de MgCl _2, 2 mM CaCl _2, glucosa 5 mM y 15 mM de HEPES a pH 7,4. De litio intracelular medido por espectroscopia de absorción atómica produce un valor de alrededor de 60 mM.
6. Para Na ⁺ carga, incubar las células durante dos horas en una solución compuesta por NaCl 120 mM, 5 mM KCl, 1 mM de MgCl _2, 2 mM CaCl _2, glucosa 5 mM y 15 mM de HEPES a pH 7,4 en presencia de ouabaína 1 mM para bloquear la Na / K ATPasa. En estas condiciones, la concentración intracelular de Na ⁺ es en el intervalo de 40 mM.
   NOTA: K ⁺ carga no es necesario ya que K ⁺ citosólico concentración está en el rango de 140 mm y un gradiente de K + hacia el entorno es por lo tanto fácil de lograr.

2.4) Tratamiento y calibración de datos:

NOTA: Este paso se aplica tanto a las mediciones de avance y retroceso.

1. Al final de cada experimento, las células perfundir con una solución de 140 mM KCl, 20 mM HEPES y 5 mM nigericin ajustado a valores de pH entre 6,5 y 7,4.
2. Recopilar datos como medidas de fluorescencia de las imágenes (niveles de gris que representan los niveles de intensidad) y la exportación bajo el formato de texto y tratar como se explica a continuación utilizando un programa de hoja de cálculo.
3. Calcular los valores de pH intracelulares para cada celda o región de interés utilizando la siguiente ecuación individual:
   pH = pKa + (Log (R-Rmin) / (R _max -R)) x F _{min (λ2)} / F _{max (λ2)}
4. Utilice el F _{min (λ2)} / F _{ma x (λ2)} Relación de si hay blanqueo sonda o fugas, lo que resulta en una disminución en la fluorescencia de 450 nm a lo largo de los experimentos. Esto sin embargo es muy raramente observada en las condiciones utilizadas en el desexperimentos crito.
5. Como los datos de calibración están presentes al final de cada medición de pH, comprobar si los correspondientes valores calculados difieren de los valores de pH utilizados para la calibración. Si es el caso, entonces ajustar todos los valores de pH determinados experimentalmente a la calibración mediante el siguiente procedimiento:
   1. Calcula el siguiente cociente (Q, la diferencia entre el medido valores / Diferencia entre los valores de calibración). Multiplique el conjunto de datos por Q. Haga el ajuste final de la adición o sustracción de manera que los valores calculados serán iguales a los valores de calibración correspondientes.

3. Las mediciones de los precios iniciales de NHE7 por Fast Li ⁺ Captación

1. Sembrar las células en placas de pocillos múltiples (de 6 a 24 pocillos) y se acidifica usando ya sea la técnica de carga ⁺ NH ₄ descrito anteriormente, o alternativamente el / albúmina de suero bovino (BSA) descrito en la acidificación nigericin ^20.
2. placas Enjuague dos veces rápidamente utilizando la solución de lavado antes descrito y luego se incuban las células en soluciones de absorción que contienen litio 1-10 mM (ligeramente por debajo de los valores de Km) y las concentraciones deseadas de los cationes y / o inhibidores de interés para la cantidad deseada de tiempo.
3. Mantener duraciones cortas de captación y consistentes (típicamente un minuto, o más adelante) para asegurar que el transporte opera en condiciones iniciales tasas. También asegúrese de que todas las soluciones utilizadas para la captación son isotónicas.
4. Al final del tiempo de absorción, eliminar cuidadosamente el medio absorción y lavar las células cuatro veces con solución salina de fosfato enfriado con hielo tamponada (PBS). Realizar estos lavados tan rápido como sea posible (menos de 10 seg para los cuatro de ellos es ideal) para evitar que el eflujo de litio.
5. Lisar las células en ácido nítrico 25%. Aplicar 250 l por pocillo de ácido nítrico al 25% y dejar que repose durante al menos 1 hora, después desechar cada pocillo con el final de la punta de la pipeta y transferir toda la suspensión bien en un nuevo mitubo crocentrifuge.
6. Transferir el lisado en 1,5 ml tubos de microcentrífuga, centrifugar durante 5 minutos a 15.000 xg (temperatura ambiente) para eliminar los restos celulares.
7. Mida el contenido de litio de los sobrenadantes mediante espectroscopía de absorción atómica ^21.
   NOTA: Diferentes empresas ofrecen los espectrómetros de absorción atómica, que tienen que estar equipados con una lámpara de cátodo hueco de litio. Siga las instrucciones del fabricante ya que estas máquinas son muy precisos pero también bastante delicada.

Resultados

Selección:

La selección ⁺ matando H se basa en la difusión de la base débil de amonio, tal como se representa en la Figura 1A. El efecto de las bases débiles y ácidos difusión sobre el pH intracelular ha sido promovida por Walter Boro y colaboradores ^22. El elegante idea de utilizar este fenómeno para producir una acidificación letal para la selección genética positiva luego fue desarrollada por Jacques Pouysségur ^17. En virtud de un protocol...

Discusión

Este protocolo describe cómo seleccionar las células que expresan intracelular de Na ⁺ / H ⁺ intercambiadores en la membrana plasmática sin alterar su secuencia primaria por mutagénesis dirigida al sitio. Estos intercambiadores de ahora se pueden caracterizar.

Este método se basa en la toxicidad celular de protones intracelulares para seleccionar líneas celulares que expresarán vesicular Na ⁺ / H ⁺ intercambiadores en la membrana plasmática. Podría...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
		cultivo celular estándar	Se utiliza para la selección de eliminación de H+ compuesto por muchos dispositivos con diferentes números de catálogo
Incubadora con CO2	Sanyo	MCO15A
Incubadora sin CO2	Heraeus instrumento	BB6220
Campana de flujo laminar PSM1200NF	Fisher
DMEM medio	sigma	D5796
FBS oro	GE Healthcare	A15-151
Penicilina/estreptomicina	PAA	P11-010
Tripsina 10x	PAA	L11-003
Espectrómetro de absorción atómica con sistema de horno Zeeman	Thermo Scientific	ICE 3500 GFZ
LiCl	sigma	L4408
Ácido nítrico	sigma	438073
Fluorescencia equipo de videomicroscopía	Leica		Compuesto por muchos dispositivos con diferentes números de catálogo
Microscopio automatizado invertido		Leica
	Leica	11888906
		11888911
		11888377
fluorescencia incidente	11888901
		11504166
		11522106 11521505
Luz de transmisión LED	Placa motorizada Leica	8097321
		8102034
		11521580
		11522068 11531172
		11521734
		11521719
		11888423
			Salida de
cámara	11888424 Leica	11888373
		11507807
		11888259
		11888258
		11541510
software de adquisición/análisis de imágenes	Leica	11888375
óptica	leica	11506507
		11506243 11506203
fluorescencia Lámpara de xenón	Leica	DMI6000
cámara	Hamamatsu	8100601
metafluor/Mmfluor software		11640905
sonda sensible al pH, BCECF-AM	life technologies	B1170
Nigericina	Sigma	N7143