Examen de Rapid dopamina Dinámica con Fast Scan voltametría cíclica Durante intraoral Administración saborizante en ratas Awake

Resumen

Las rápidas fluctuaciones en la dopamina extracelular (DA) median tanto el procesamiento de la recompensa como el comportamiento motivado en los mamíferos. Este manuscrito describe el uso combinado de voltamperometría cíclica de barrido rápido (FSCV) y la administración intraoral de saborizantes para determinar cómo los saborizantes alteran la liberación rápida de dopamina en ratas despiertas que se mueven libremente.

Resumen

La liberación rápida y fásica de dopamina (DA) en el cerebro de los mamíferos desempeña un papel fundamental en el procesamiento de recompensas, el aprendizaje por refuerzo y el control motivacional. La voltamperometría cíclica de barrido rápido (FSCV) es una técnica electroquímica con alta resolución espacial y temporal (sub-segundo) que se ha utilizado para examinar la liberación fásica de DA en varios tipos de preparaciones. Se han utilizado experimentos in vitro en células individuales y cortes de cerebro, y experimentos in vivo en roedores anestesiados para identificar los mecanismos que median la liberación y absorción de dopamina en condiciones normales y en modelos de enfermedad. En los últimos 20 años, los experimentos in vivo con FSCV en roedores despiertos que se mueven libremente también han proporcionado información sobre los mecanismos dopaminérgicos en el procesamiento de la recompensa y el aprendizaje de la recompensa. Una de las principales ventajas de la preparación despierta y que se mueve libremente es la capacidad de examinar las fluctuaciones rápidas de DA que están bloqueadas en el tiempo por eventos conductuales específicos o para recompensar o indicar la presentación. Sin embargo, una limitación de los experimentos combinados de comportamiento y voltamperometría es la dificultad de disociar los efectos del DA que son específicos de los estímulos primarios gratificantes o aversivos de las fluctuaciones concurrentes del DA que median las conductas motoras dirigidas a la recompensa u otras conductas motoras. Aquí, describimos un método combinado que utiliza FSCV in vivo e infusión intraoral en una rata despierta para investigar directamente las respuestas de DA a los sabores orales. En estos experimentos, los saborizantes orales se infunden directamente en el paladar de la rata, evitando el comportamiento dirigido a la recompensa y el comportamiento voluntario de bebida, lo que permite un examen directo de las respuestas de DA a los estímulos gustativos.

Introducción

La liberación de DA fásico juega un papel importante en la mediación del comportamiento dirigido a la recompensa ^[1-3]. Sin embargo, aislar y estudiar cómo una recompensa primaria altera la liberación fásica de DA a menudo se complica por procesos conductuales o cognitivos concurrentes que también son capaces de alterar la liberación fásica de DA, como los procesos de toma de decisiones o el comportamiento motor dirigido a la recompensa para adquirir la recompensa. En el trabajo actual, aislamos las respuestas fásicas de DA a los tasantes mediante el uso de voltamperometría cíclica de barrido rápido (FSCV) in vivo combinada con la administración de catantes a través de cánulas intraorales. Esta técnica evita la elección y la acción y nos permite examinar la liberación extracelular de DA durante la infusión directa de un sabor en el paladar de una rata.

FSCV es una técnica electroquímica con alta resolución temporal y espacial, que permite mediciones de la liberación de DA en un área local discreta (aproximadamente 100 μm) en una escala de menos de un segundo (resolución de 10 Hz). La combinación de la administración intraoral y FSCV proporciona la ventaja de observar respuestas rápidas y "en tiempo real" de DA a un catante, que no se puede examinar con los métodos convencionales de microdiálisis. Además, la liberación fásica de DA en respuesta a las recompensas o a las señales asociadas a la recompensa se produce a concentraciones entre 20-100 nM, que está por encima del umbral de detección de 10-20 nM para FSCV ^[4]. La alta resolución espacial de FSCV también permite el registro de subregiones de pequeñas áreas cerebrales, como el núcleo accumbens (NAc). Por lo tanto, FSCV combinado con infusiones intraorales de saborizantes es un modelo ideal para estudiar cómo los saborizantes u otros estímulos alteran la liberación fásica de DA en animales despiertos que se comportan. De hecho, estas técnicas han permitido experimentos que investigan cómo los sabores gratificantes y aversivos alteran la liberación de DA extracelular ^[5].

Durante la última década, los análisis de FSCV se han combinado con éxito con los paradigmas de administración intravenosa de fármacos ^[6] y de autoadministración en ratas ^{[7, 8]} para identificar el papel de los mecanismos de DA fásica en modelos de adicción a las drogas. Además, la administración intraoral combinada con FSCV se ha utilizado para examinar cómo las señales de sabor junto con la disponibilidad de cocaína modulan la liberación fásica de DA y las respuestas conductuales que reflejan el afecto emocional ^[3]. Esta metodología combinada intraoral y FSCV también se puede utilizar poderosamente para examinar las respuestas fásicas de DA a saborizantes, como el mentol y los edulcorantes orales, que se agregan a los cigarrillos y productos de tabaco solubles ^[9-11]. Aunque muchos de los saborizantes añadidos a los productos de tabaco son apetitivos ^[9-11], se desconoce si estos saborizantes aumentan la liberación fásica de DA de una manera consistente con una valencia hedónica gratificante. De hecho, los aromatizantes añadidos a los cigarrillos y a los productos de tabaco solubles pueden tener efectos directos en el sistema de recompensa de DA y pueden actuar a través de mecanismos dopaminérgicos para influir en la valencia gratificante de los cigarrillos y otros productos de tabaco. Por lo tanto, la administración intraoral combinada con FSCV puede proporcionar nuevos conocimientos sobre cómo los saborizantes modulan la liberación rápida de DA. El uso de la metodología combinada de FSCV intraoral e in vivo, y los datos obtenidos de dichos estudios, también pueden facilitar futuros estudios para determinar cómo interactúan los saborizantes y la nicotina para alterar la señalización de DA y modular potencialmente el refuerzo de nicotina. Además, los datos obtenidos de dichos estudios se pueden utilizar para informar las decisiones regulatorias sobre los saborizantes de productos de tabaco.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el animal de Atención Institucional y el empleo Comisión de la Universidad de Yale (IACUC).

Preparativos 1) Pre-quirúrgicos

1. Preparación de la solución oral
   1. Crear soluciones de 10% de sacarosa y 0,005% de L-mentol en agua desionizada (pH 7,4). Guarde estas soluciones en envases cerrados, a temperatura ambiente, y rehacer cada 2 semanas, para evitar la degradación.
2. Soluciones de calibración del electrodo
   1. Hacer tampón Tris (pH 7,4) en cualquier momento antes de la calibración. La solución consiste en 12,0 mM Tris-HCl, NaCl 140 mM, 3,25 mM KCl, 1,20 mM de CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1,20 mM de MgCl _2, y 2,00 mM Na ₂ SO _4.
   2. Crear una solución madre de 10 mM de dopamina (DA; clorhidrato de dopamina) en ácido perclórico 0,1 M. El ácido perclórico ayuda a prevenir la oxidación de la dopaminae. Guarde esta solución madre a -20 ° C y utilizar durante un máximo de 6 meses. Haga varias alícuotas de la solución madre DA para el almacenamiento de usar cada alícuota sólo una vez.
   3. De la población de 10 mM DA, soluciones diluidas en tampón Tris a concentraciones de 1 M, 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62,5 nM, y 31,25 nM.
   4. Para la calibración de pH, se preparan soluciones de tampón Tris con el pH de 7,2, 7,3, 7,5, y 7,6. Esto proporcionará soluciones que imitan los cambios de pH que pueden ocurrir durante el experimento in vivo.
3. La fabricación de electrodos
   1. Por succión al vacío, aspirar una fibra de carbono T-650 (7 m de diámetro) en un capilar de vidrio de borosilicato (longitud 10 mm, de diámetro exterior de 0,6 mm, 0,4 mm de diámetro interior).
   2. Coloque capilar de vidrio lleno de fibra de carbono en un extractor de electrodos vertical. Para los parámetros iniciales, establezca el calentador a 55,0 y apague el imán. Sin embargo, una optimización adicional puede ser necesario ya que tanto el calentador y los ajustes magnéticos varían frlaboratorio om al laboratorio.
      Nota: El electrodo debe ser al menos 5,5 cm de largo (incluyendo conicidad) de manera que puede encajar fácilmente en el micromanipulador y ser insertado al menos 6,9 mm por debajo de la duramadre en el cerebro de rata. Si el electrodo es demasiado corto, las grabaciones de la porción ventral del núcleo accumbens no serán alcanzables. Por otro lado, la longitud total del electrodo no debe exceder de 6,5 cm de lo contrario será demasiado largo para encajar en el micromanipulador.
   3. El uso de un microscopio de luz, cortar la fibra de carbono expuesta de modo que se extiende 75-100 micras más allá del final de la copa. Verificar que el electrodo tiene un muy estrecho, apenas discernible, sello entre el electrodo de vidrio y fibra de carbono, que producirá un mínimo de ruido durante la grabación posterior. Deseche el electrodo si hay grietas visibles en el vidrio o si el sello está floja, lo cual es indicativo de un sello pobre. Para obtener instrucciones más detalladas, consulte [12] y [13].
4. Montaje del electrodo en el micrófonoromanipulator
   1. Obtener un 3 en, alambre 30G que está aislado a lo largo de la mitad de la longitud del alambre y utilizar un pequeño cepillo para aplicar una fina capa de pintura de plata directamente al cable. Inmediatamente después de aplicar la pintura de plata, insertar el cable en el orificio en la parte superior del electrodo para proporcionar una conexión física y eléctrica a la fibra de carbono. Bajo el microscopio, asegúrese de que el hilo de plata entra en contacto con la fibra de carbono.
   2. Asegure el alambre de plata y el electrodo a la micromanipulador usando encogimiento del calor.
   3. Coloque el electrodo de fibra de carbono preparado en alcohol isopropílico purificado (IPA) durante al menos 10 min para limpiar la superficie del electrodo y para aumentar la posterior sensibilidad a la dopamina. Después de remojar en IPA, enjuagar la fibra de carbono con el agua del grifo para eliminar el IPA.
5. Referencia fabricación de electrodos
   1. Tome un alambre de 13 mm de plata que contiene una malla de aproximadamente 6 mm de Ag / Ag Cl (alambre de plata 7 mm solos, malla de 6 mm, 0.4 mm de diámetro),cortar la parte de plata hasta aproximadamente la mitad de su longitud original y soldar la porción de plata del alambre a un alfiler de oro.
   2. Aplicar epoxi sobre la soldadura en el pasador.
   3. Sumergir el Ag / Ag Cl malla extremo en un copolímero de 5% politetrafluoroetileno y perfluoro-3,6-dioxa-4-metil-7octene-sulfónico ácido 5 veces, con periodos de secado al aire 30 min entre cada inmersión.
   4. Deje que el recubierto de Ag / Ag Cl malla se seque al aire O / N.
   5. Curar en el horno a 120 ºC durante 1 hora.

2) Cirugía Combinada intraoral y Cirugía intracraneal Canulación (aproximadamente 75 min)

1. Fabricación Oral catéter
   1. Hacer que el catéter oral, y esterilizar por esterilización con óxido de etileno, al menos 10 días antes de la cirugía.
   2. Cortar PE 100 tubo en 6 cm segmentos largos.
   3. El uso de un soldador, fundir un extremo de la tubería de PE e inmediatamente presionar contra una superficie sólida para enfriar el tubo de PE. El resultado debe crearun disco pequeño, plano en un extremo de la tubería de PE y no debe ser embridado. Use una aguja (18 G) o contacto del empuje para crear un agujero en el centro de este disco.
   4. En el otro extremo de la tubería de PE, perfectamente insertar el extremo romo de una aguja G 18 en el tubo.
   5. Usando una perforadora de papel estándar, perforar varias piezas circulares de una hoja de politetrafluoroetileno (3,18 mm de espesor, 6 mm de diámetro) para crear arandelas politetrafluoroetileno.
   6. Crear un agujero en el centro de la lavadora. Tome la aguja unida a la tubería de PE y empujarla completamente a través de la lavadora. Una vez que la aguja es a través de, deslice la lavadora a la parte inferior de la tubería de PE de modo que quede al ras contra la arandela.
2. Cirugía Oral
   1. Después de la esterilización de la herramientas quirúrgicas, cánula (recortado a 2,5 mm por debajo del pedestal antes de la esterilización), y el electrodo de referencia, anestesiar la rata con una inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg).
      1. After 5 min, se aplica una prueba de estímulo nocivo (pie o pellizcar la cola) para evaluar el nivel de la anestesia. Si el sujeto muestra ninguna reacción física a la prueba de estímulo nocivo (estremecerse respuesta, aumento en la frecuencia respiratoria o del corazón), administrar un impulso ketamina de 10% a 15% de la dosis original y repetir el protocolo de estímulo nocivo anteriormente.
   2. Después de la rata es totalmente anestesiado y no muestra ninguna reacción a la prueba de estímulo nocivo, utilice cortar el pelo de animales para afeitar la piel de la rata de los ojos de unos 2 mm detrás de las orejas. A continuación, coloque la rata en una recirculación de agua almohadilla eléctrica delgada para mantener la temperatura corporal durante la cirugía. Aplicar lubricante ocular. Administrar el fármaco no esteroide anti-inflamatorio (NSAID), carprofeno (5 mg / kg), por inyección intraperitoneal antes de realizar ninguna incisión y antes de la inserción de cánulas intraorales. Utilice una técnica aséptica en todo momento.
   3. Aplicar betadine seguido por etanol al 70% para limpiar la piel. Repita 3 veces.
   4. Place la rata en su parte posterior, y abra la boca con un hisopo de algodón estéril. Encuentra el primer molar superior.
   5. Inserte la aguja en el tejido entre la mejilla y el primer molar superior hasta que la aguja sale justo detrás y medial a los oídos.
   6. Pierce la aguja a través de la piel hasta que el tubo PE sale de la piel y es accesible.
   7. Tire hacia arriba de la cánula (agarre por la propia cánula y no la aguja) y asegure la arandela politetrafluoroetileno en los molares para que el catéter permanece en su lugar.
      Nota: Cortar la lavadora en una forma trapezoidal y asegurar contra los molares con el lado plano hacia la mejilla hace que este paso sea más fácil.
   8. Tome otra arandela de politetrafluoroetileno y deslícela sobre la aguja expuesta, abajo el tubo de plástico, y se apoyan contra la incisión.
   9. Para asegurar la arandela de politetrafluoroetileno, utilice cinta esterilizada para crear una "bandera" triangular de manera que la lavadora no se desliza hacia arriba. Asegure el lavadoer contra la piel de la rata y la cinta esterilizada.
   10. Cortar el catéter expuesto para permitir 2-4 cm de tubo que se expone sobre la cabeza de la rata.
   11. Repita los pasos 2.2.1 a 2.2.10 para el otro lado de la boca.
3. Cirugía intracraneal por voltamperometría
   1. Coloque la rata en el marco estereotáxico y limpiar el cuero cabelludo del animal usando un exfoliante dos etapas (un exfoliante betadine seguido por un lavado de etanol al 70%, lleve a cabo con una repetición 3 ciclo).
   2. Utilice unas pinzas esterilizadas de punta fina y tijeras quirúrgicas para cortar una sección de 15 x 15 mm de tejido del cuero cabelludo.
   3. Limpie suavemente la superficie del cráneo usando aplicadores con punta de algodón esterilizados. Además limpiar el cráneo mediante la aplicación de 2 a 3 gotas de peróxido de hidrógeno al 3%.
   4. Use un taladro estereotáxica para hacer 3 pequeños (1 mm de diámetro) agujeros en el cráneo para la posterior inserción de tornillos, 1 orificio para la cánula guía, 1 orificio para el electrodo de estimulación y 1 orificio para los elegidos de referenciamontó.
   5. Para grabaciones en el núcleo NAC, coloque la cánula guía en 1,2 mm anterior y 1,4 mm lateral al bregma. Baje el aparato cánula hasta que la base de plástico esté al nivel del cráneo.
   6. Coloque el electrodo de referencia esterilizada en el hemisferio contralateral a la cánula guía. Baje la referencia aproximadamente 2 mm por debajo de la duramadre.
   7. Coloque el electrodo de estimulación en 5,2 mm posterior y 1,0 mm lateral al bregma y bajado 8,0 mm por debajo de la duramadre para dirigir el área tegmental ventral (VTA).
   8. Use un destornillador pequeño quirúrgico esterilizado para asegurar los tornillos en el cráneo. Luego, inserte el electrodo de referencia, estimulando el electrodo, y guiar la cánula. Por último, asegurar que todos los componentes utilizando cemento Cranioplastic.
   9. Durante las primeras 48 horas de cuidado post-operatorio, para administrar el fármaco no esteroide anti-inflamatorio (NSAID) Carprofeno por inyección subcutánea (5 mg / kg). Deje por lo menos 1 semana para la recuperación quirúrgica completa antes de realizar voltamgrabación metría.
      1. Durante la atención post-operatoria, catéteres orales ras diaria con agua. Proporcionar alimentos saturado en agua durante 2 días para ayudar al animal en la masticación y de comer. Proporcionar un seguimiento diario en busca de signos de estrés potenciales de dolor (debido a la infección leve o deshidratación) y proporcionar intervenciones apropiadas según sea necesario (incluida la administración de fluidos, la administración tópica de antisépticos, o la administración de AINE y carprofeno a 5 mg / kg).

3) Voltamperometría Grabaciones en Despierta, Rata con libertad de movimientos

1. Bajar el electrodo y la adquisición de un conjunto de entrenamiento DA.
   1. En el día del experimento, comprobar la permeabilidad de la cánula por vía oral mediante la infusión de 200 l de agua y observar las respuestas orofaciales (para verificar que la rata está probando el agua).
   2. Conecte el cabezal de la platina FSCV a la rata mediante la inserción del electrodo de estimulación (en el cabezal de la platina) en el electrodo de estimulación bipolar cannula (en la rata). Por lo tanto, el cabezal de la platina (miniaturizado convertidor de corriente a voltaje) se conecta directamente al electrodo bipolar estimulante.
   3. Retire la cánula maniquí desde el aparato de cánula y aplicar dos gotas de solución de heparina 50% en la cánula. A continuación, inserte suavemente una cánula ficticia (ligeramente más largo que la cánula ficticia que se ha eliminado previamente) para borrar cualquier coágulo de sangre o cicatrización glial que pueda haber ocurrido, que rompa electrodos de fibra de carbono que se insertarán posteriormente durante el experimento. Extender la cánula utilizada para despejar los coágulos de 3-4 mm por debajo del cráneo (al menos 2 mm por encima del sitio de la grabación).
   4. Inserte el micromanipulador, con electrodo, en la cánula guía y coloque el anillo de omega en una posición "cerrada".
   5. Conecte el cable de electrodo de referencia del cabezal de la platina al pin apropiado. A continuación, conecte el cable de electrodo de trabajo desde el micromanipulador para el cable apropiado en el cabezal de la platina.
   6. Baje las elecatropelló a aproximadamente 4-4,5 mm por debajo del cráneo.
   7. Utilice un potenciostato para aplicar una forma de onda triangular (400 V / s, -0,4 a 1,3 V). Aplicar la forma de onda al electrodo a 60 Hz por lo menos durante 10 minutos, a continuación, cambiar la frecuencia de aplicación de forma de onda de 10 Hz para las grabaciones experimentales posteriores.
      Nota: La etapa de aplicación de forma de onda de 60 Hz produce una superficie de fibra de carbono estable y le ayudará a prevenir la deriva eléctrica
   8. Aplicar la estimulación eléctrica a la VTA usando varias frecuencias (de 10 a 60 Hz) impulsos (10 a 30 pulsos) y las corrientes (50 a 150 mu), todas con un ancho de pulso de 2 ms / fase, para evocar diferentes concentraciones de pH y la liberación de DA turnos. Adquirir al menos 5 concentraciones diferentes de liberación de DA y 5 cambios de pH diferentes. Espere (2 - 3 minutos mínimo) entre estimulaciones para permitir la recarga vesicular [14].
      Nota: Es importante obtener estímulos que producen concentraciones de DA en toda la gama que se recogerán durante el posteriorexperimento, ya que se utilizarán como un conjunto de entrenamiento para el Análisis de Componentes Principales (ver sección 5.1).
   9. Baje el electrodo en el núcleo NAC (6,3 mm ventral a Durá). Posteriormente bajar el electrodo en incrementos de 100 micras dentro del núcleo NAc hasta que se observaron eventos transitorios liberación de DA en las frecuencias de al menos 1 por min.
   10. Conectar el tubo (diámetro interior de 1/32 ", diámetro exterior 3/32") a una jeringa de 20 ml, unido a una bomba de jeringa. En el otro extremo del tubo, utilizar una aguja 23 G biselado para conectar la tubería a la cánula de la rata. Asegúrese de que el tubo se llena completamente con el saborizante deseada y compruebe que no existen burbujas en el tubo.
       Nota: Por lo general, administrar una pequeña cantidad de saborizante en la boca de la rata antes de grabar para asegurar que la primera infusión para la grabación entrega la cantidad completa de infusión y no cualquier agua residual o de aire en el tubo. Además, esto permite que el animal pueda tener algo de ingenio experiencia previah el saborizante ya nuevos estimulantes del gusto, incluso los apetitiva, puede ser aversivo inicialmente debido a su novedad.
   11. Para la recolección de datos, infundir 200 l de saborizante (6,5 seg usando una bomba y tubos descrito anteriormente). Infundir el saborizante cada 1-3 min. Infundir un total de 25 veces por saborizante. Cada infusión entrega 200 l de solución.
   12. Si varios estimulantes del gusto se están entregando en un solo experimento, lave el catéter oral con agua después de la recolección de datos para un saborizante y espere al menos 20 minutos antes de la infusión de la nueva saborizante.
   13. Después de la sesión de grabación DA, prepararse para la verificación histológica mediante la creación de una pequeña lesión en el lugar de grabación. Para preservar el electrodo de fibra de carbono para la posterior calibración, primero retraer el electrodo y eliminar el micromanipulador. A continuación, utilice una nueva micromanipulador con un microelectrodo de vidrio y un alambre de tungsteno (que se extiende 100 m más allá de la punta de vidrio) a la misma profundidad (por debajo de la duramadre) como el f de carbono original,microelectrodos iber.
   14. Para la verificación histológica, crear una pequeña lesión mediante la aplicación de 3 V en el alambre de tungsteno y el aumento de la tensión en incrementos de 1 V, cada 10 seg, hasta que se alcanza el ajuste de 10 V.
   15. Si una curva de concentración estándar que ya ha sido creado usando múltiples electrodos de fibra de carbono, realice el paso por encima de la lesión (3.1.14) aplicando el potencial directamente el electrodo de fibra de carbono.
       Nota: Este método lesión dañará la fibra de carbono y prevenir la posterior calibración con ese electrodo específico.
   16. La eutanasia del animal usando una inyección letal de pentobarbital (150 mg / kg, ip).
   17. Desalojar el casquete con las cánulas con unos alicates tirando directamente hacia arriba en el casquete. No tuerza el casquete ya que esto puede causar daños innecesarios al cerebro y hacer que sea difícil de identificar la localización del electrodo durante la histología.
       1. Retire el cerebro y colocar en formalina al 4% durante 3 días seguidos en un 30% suCrose durante 1 semana. Crear 30 micras rodajas usando un criostato, montar en cubreobjetos y examinar rebanadas bajo un microscopio de luz para identificar la ubicación de la fibra de carbono o lesión de tungsteno.
          Nota: La perfusión es opcional para 3.1.17.

4) calibración del electrodo

1. El uso de la celda de flujo para crear un factor de conversión de corriente de la concentración.
   1. Con el fin de determinar la sensibilidad del electrodo, calibrar los electrodos después de cada experimento utilizando un aparato de flujo "de células t". Bajar el electrodo en la "células T", mientras tampón Tris, soluciones de pH, o soluciones DA se lavan sobre la superficie del electrodo (a una velocidad de 2 ml / min). Use un actuador solenoide de aire de seis posiciones para alternar entre la memoria y el pH o solución DA.
   2. Para cada calibración, recoger datos voltamétricos durante 5 seg aplicación de tampón Tris (línea de base), seguido de 5 seg aplicación del pH o solución DA, seguido de 20 segundos de unplicación de tampón Tris (total del archivo 30 seg). Repita cada carrera 3 veces para cada concentración del patrón de calibración, de contrapeso entre las diferentes concentraciones de cada norma.
   3. Para cada toma de muestras, medir el pico DA o corriente pH-evocado. Un promedio de la corriente de pico a través de cada ensayo para obtener una concentración frente a la relación de corriente de pico. Para obtener instrucciones más detalladas, consulte [12] y [13].

5) Análisis de Datos

1. El uso de un conjunto de entrenamiento en el análisis de componentes principales (PCA)
   Nota: Durante un experimento de voltametría, la salida se produce como corriente, que es el resultado de la oxidación y la reducción de la dopamina, los cambios de pH, y el ruido electroquímico. PCA permite la separación de estos factores para que se pueda aislar los componentes deseados (DA y pH) y quitar componentes adicionales que podrían distorsionar las señales deseadas (para una descripción más detallada, véase ^{15, 16).}
   1. Asignar un factor de calibración a thactual e salida (aproximadamente 5.10 nA / M) después de PCA para permitir que los valores de concentración de los analitos a determinar.
   2. Utilice el conjunto de entrenamiento obtenida durante un experimento para "entrenar" el modelo PCA para separar a cabo DA, pH y otros factores. PCA toma el conjunto de entrenamiento voltamogramas cíclicos (recogidos en la sección 3.1.8) y determina qué características esenciales de la voltamograma pueden ser utilizados para identificar cada analito recogida durante grabaciones en vivo de voltametría.
   3. Para determinar el número de componentes principales para mantener, utilizar una prueba F Malinowski. Por lo general, mantener sólo 2 o 3 componentes principales que normalmente explican sobre 95-99% de la varianza en los datos. Para más discusión sobre la aplicación de la prueba F Malinowski, ver ^17.
      Nota: Una vez que se determina el número de componentes, el análisis PCA efectivamente proyectará los voltamogramas medidas a partir de DA y la formación pH establece en los principales componentes que han sido retenidas.El resultado es un conjunto de datos que ha sido filtrada de manera que sólo los datos de DA (o pH) se mantiene y se elimina los datos residuales que no se parece DA o pH (Ver representativos Resultados para salida esperada). Para una explicación más detallada y paso a paso las instrucciones para el uso de la ACP para el análisis voltamétrica ver hoja Materiales y ^{16, 17.}

Resultados

FSCV combinada con la implantación del catéter intraoral se utilizó para examinar cómo sacarosa, un saborizante apetitiva, modula fásica la liberación de DA en el núcleo NAc. Antes de la infusión saborizante, la estimulación eléctrica (150 mu, 60 Hz, 24 pulsos, indicada por la barra roja) de la VTA produce aumentos sólidos en fásica liberación de DA en el NAc (Figura 1) Figura 1 muestra un gráfico de color con potencial sobre. el eje y, el tiempo en el eje x, y la corriente (representado como falso colo...

Discusión

Entrega saborizante intraoral combinada con FSCV permite el análisis del "tiempo real" respuestas DA a saborizantes orales. Hay tres pasos críticos en el protocolo que se requieren para mediciones exitosas DA. En primer lugar, la implantación adecuada del catéter oral es crítico para la entrega de saborizantes. Asegurarse de que el catéter se inserta detrás de la primera molar y encajada en su lugar evita que el catéter de la pérdida de permeabilidad y evita la extracción accidental por el animal. Lavado del c...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Electrodo estimulante	PlasticsOne	MS303/2-A/SPC	al realizar el pedido, solicite un corte de 22 mm por debajo del pedestal
Cánula para electrodo	BioAnalytical Systems	MD-2251
Sistemas capilares	de vidrio A-M	624503
fibra de carbono	Thornel	T650
Extractor de electrodos	Narishige International	PE-22
Neurolog estimulador de estímulos	Digitimer Ltd.	DS4
Termorretráctil	3M	FP-301
Cables aislados para electrodos	Electrónica Squires	Custom	L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1
BLU Micromanipulador	Univ. de Illinois en Chicago, Taller de Ingeniería de Máquinas
Epoxi	ITW Devcon	14250	"Epoxi de 5 minutos"
Copolímero de ácido perfluoro-3,6-dioxa-4-metil-7octeno-sulfónico y tetrafluoroetileno	Ion Power	LQ-1105	i.e., Nafion
Pintura plateada	GC Electronics	22-023
Fuente de alimentación	BK Precision	9110
Tubo para catéteres intraorales	Intramedic		427426 PE 100, D.I. = 0,86 mm; D.O. = 1,52 mm
Tubo para infusión intraoral	Fischer Scientific	02-587-1A	D.I. 1/32"; Diámetro Exterior 3/32"
Bomba de jeringa para celda de flujo	Pump Systems Inc.	NE 1000
Cemento quirúrgico	Dentsply Caulk	675571 y 675572
Actuador neumático	VICI	A60	Interfaz de válvula digital de 6 posiciones
Interfaz de válvula digital	VICI	DVI	230 VAC
Cabecera cuádruple	Univ. de Carolina del Norte, Instalación de Electrónica Fuente
alimentación UEI	Univ. de Carolina del Norte, Electrónica Instalación
Caja de conexiones UEI	Univ. de Carolina del Norte, Instalación de Electrónica Fuente
alimentación para bomba de jeringa tastant	Med Associates	SG-504
Bomba de jeringa	Tastant Med Associates	PHM-107
Microelectrodo de tungsteno	MicroProbes	WE30030.5A3
Referencia de alambre de plata con AgCl	InVivo Métrico	E255A
Sacarosa	Sigma	80497
Cloruro de magnesio	Sigma	M8266
Cloruro de sodio	Sigma	S7653
Ácido perclórico	Sigma	244252
Ácido clorhídrico (4 M)	Sigma	54435
Hidróxido de soidum	Sigma	306576
Peróxido de hidrógeno	Sigma	H1009
Clorhidrato de dopamina	Sigma	H8502
TarHeel HDCV Software	Universidad de Carolina del Norte-Chapel Hill		Debe solicitar software: haga clic aquí para acceder al enlace a la página de solicitud de software