Proteína técnica de purificación que permite la detección de Sumoylation y Ubiquitination de levadura en ciernes cinetocoro Proteínas Ndc10 y Ndc80

Resumen

Este manuscrito describe la detección de sumoylation y ubiquitinación de proteínas del cinetocoro, Ndc10 y Ndc80, en la levadura Saccharomyces cerevisiae en ciernes.

Resumen

Modificaciones post-traduccionales (PTMs), tales como fosforilación, metilación, acetilación, ubiquitinación, y sumoylation, regulan la función celular de muchas proteínas. PTM de proteínas cinetocoro que se asocian con el ADN centromérico median segregación cromosómica fieles a mantener la estabilidad del genoma. Enfoques bioquímicos como la espectrometría de masas y análisis de transferencia Western son los más utilizados para la identificación de los PTM. Aquí, un método de purificación de proteínas se describe que permite la detección de tanto sumoylation y ubiquitinación de las proteínas del cinetocoro, Ndc10 y Ndc80, en Saccharomyces cerevisiae. Una cepa que expresa etiquetados-polihistidina-Bandera Smt3 (HF-Smt3) y Myc-etiquetados Ndc10 o Ndc80 fue construido y utilizado para nuestros estudios. Para la detección de sumoylation, ideamos un protocolo para purificar por afinidad proteínas sumoylated etiquetados-Su usando perlas de níquel y utilizamos Western blot con anti-Myc anticuerpos para detectar sumoylated Ndc10 unnd Ndc80. Para la detección de ubiquitinación, ideamos un protocolo de inmunoprecipitación de proteínas Myc-etiquetados y utilizamos Western blot con el anticuerpo anti-Ub para demostrar que Ndc10 y Ndc80 se ubiquitinated. Nuestros resultados muestran que el epítopo de etiquetado proteína de interés en el Su-Bandera etiquetado cepa Smt3 facilita la detección de múltiples PTM. Los estudios futuros deben permitir la explotación de esta técnica para identificar y caracterizar las interacciones de proteínas que son dependientes de un PTM específico.

Introducción

La ubiquitinación y la sumoilación permiten la conjugación de la ubiquitina y el modificador Pequeño ubiquitina-like (SUMO; Smt3 en S. cerevisiae ¹⁾ a una proteína diana, respectivamente. PTMs de proteínas kinetochore afectan a sus niveles celulares y las interacciones proteína-proteína durante las diferentes fases del ciclo celular para asegurar la segregación cromosómica fiel. Por ejemplo, los niveles celulares de Cse4 / CENP-A y proteínas cinetocoro externo DSN1 están regulados por la proteólisis mediada por ubiquitina de asegurar la estabilidad del genoma ^2-5. La desestabilización de accesorios-cinetocoro microtúbulos incorrectas re....

Protocolo

1. Crecimiento de células de levadura

1. Inocular células de levadura en 30 ml de YPD (Tabla 1) en un matraz pequeño. Incubar a 30 ° C durante la noche con agitación.
2. Diluir las células a una densidad óptica de 0,2 a 600 nm (OD ₆₀₀ = 0,2) en 50 ml de YPD y se incuba a 30 ° C con agitación.
3. Mantener el cultivo a una densidad óptica de 1,0 a 600 nm (OD ₆₀₀ = 1,0).
4. Centrifugar las células durante 5 minutos a 2.000 xg y descartar el sobrenadante.
5. Resuspender el sedimento celular en 40 ml de agua estéril y centrifugar durante 5 min a 2000 xg para lavar las células. Descartar el sobrenad....

Resultados

Para detectar sumoylation de proteínas cinetocoro Ndc80 y Ndc10, cepas con HF-Smt3 y proteínas cinetocoro etiquetados-Myc (Ndc80 o Ndc10) fueron construidos (Tabla 2), como se describió anteriormente ^9,12. Conjugados HF-Smt3 fueron purificados por afinidad utilizando perlas de Ni-NTA. Western blot de purificado HF-Smt3 con un permitido la detección de anticuerpos anti-Bandera de formas sumoylated de sustratos SUMO que en la cepa control sin HF-Smt3 (Figura 1A y 1B,

Discusión

Etiquetas de epítopo tales como HA, Myc, Flag, GST y son ampliamente utilizados para el análisis bioquímico de las proteínas. Construcción de cepas con HF-Smt3 y kinetochore proteínas etiquetadas-Myc, tales como Ndc10 y Ndc80, facilita la detección de PTM tales como sumoylation y ubiquitinación. HF-Smt3 desplegable ensayo permite la detección de proteínas cinetocoro sumoylated, Ndc10 y Ndc80 (Figura 1). El protocolo de purificación por afinidad y análisis de transferencia Western usando anticuerpo anti-.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Perlas de vidrio	BioSpec Products	11079105	0,5 mm de diámetro
Mini batidor de cuentas	BioSpec Products	#693	8 disruptor de células
Ni-NTA superflow	Qiagen	30430	100 ml
Cóctel inhibidor de la proteasa	Sigma-Aldrich	P8215	1 ml
Anti-c-Myc gel de afinidad con agarosa cuerpo de hormiga producido en conejo	Sigma-Aldrich	A7470	1 ml
Anticuerpo monoclonal anti-Flag M2 producido en ratón	Sigma-Aldrich	F1804	Anticuerpo primario, dilución 1:1.000
anticuerpo c-Myc (A-14)	Santa Cruz Biotechnology	sc-789	Anticuerpo primario, dilución 1:5.000
Anticuerpo de ratón purificado monoclonal 9E10	Covance	MMS-150P	Anticuerpo primario, dilución 1:5.000
Ubiquitina (P4G7) anticuerpo monoclonal	Covance	MMS-258R	Anticuerpo primario, dilución 1:1.000
ECL IgG de conejo, entero ligado a HRP Ab	GE Healthcare Life Sciences	NA934V	Anticuerpo secundario, dilución 1:5.000
ECL IgG de ratón, ligada a HRP Ab GE	Healthcare Life Sciences	NA931V	Anticuerpo secundario, dilución 1:5.000
DC ensayo de proteínas	Bio-Rad	500-0116
Membrana de nitrocelulosa	Novex	LC2001	0,45 mm Tamaño de poro
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Geles de Proteína	Novex		NP0321BOX 1,0 mm, 10 pocillos
NuPAGE MES SDS Tampón de funcionamiento	Novex	NP0002	20x
NuPAGE Tampón de transferencia	Novex	NP0006-1	20x
SuperSignal West Pico Sustrato quimioluminiscente	Thermo Scientific	34078
10x PBS pH7.4	GIBCO	70011-044
Película de rayos X sensible al azul	Dbio	DBOF30003
Revelador automático	Kodak	M35AX-OMAT
Nocodazol	Sigma-Aldrich	M1404	50 mg
MG-132	Selleck Chemicals	S2619	25 mg