Artículo de método

Generación de células madre adiposas Humano a través Desdiferenciación de adipocitos maduros en culturas de techo

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DOI:

10.3791/52485

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7 de marzo de 2015

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1IUCPQ Research Center, 2CHU de Québec Research Center, 3Laval University

En este artículo

Resumen

Los adipocitos maduros pueden representar una fuente abundante de células madre a través de la desdiferenciación, lo que conduce a una población homogénea de células similares a los fibroblastos. La digestión de la colagenasa se utiliza para aislar los adipocitos maduros de la grasa humana. El objetivo de nuestro protocolo es obtener células grasas multipotentes y desdiferenciadas a partir de adipocitos maduros humanos.

Resumen

Se ha demostrado que los adipocitos maduros revierten su fenotipo en células similares a fibroblastos in vitro a través de una técnica llamada cultivo en techo. Los adipocitos maduros también se pueden aislar a partir de tejido adiposo fresco para la caracterización específica de su función y propiedades metabólicas. Aquí, describimos un protocolo bien establecido para aislar adipocitos maduros de tejidos adiposos mediante la digestión de colagenasa y los pasos posteriores para realizar cultivos de techo. En resumen, los tejidos adiposos se incuban en un tampón Krebs-Ringer-Henseleit que contiene colagenasa para alterar la matriz tisular. Los adipocitos maduros flotantes se recogen en la superficie superior del tampón. Las células maduras se colocan en un matraz T25 completamente lleno de medios y se incuban boca abajo durante una semana. Un enfoque alternativo de cultivo en placa de 6 pocillos permite la caracterización de los adipocitos en proceso de desdiferenciación. La morfología de los adipocitos cambia drásticamente con el tiempo de cultivo. La inmunofluorescencia se puede realizar fácilmente en portaobjetos cultivados en placas de 6 pocillos, como lo demuestra la tinción con inmunofluorescencia FABP4. La proteína FABP4 está presente en los adipocitos maduros, pero se regula a la baja a través de la desdiferenciación de las células grasas. La desdiferenciación de adipocitos maduros puede representar una nueva vía para la terapia celular y la ingeniería de tejidos.

Introducción

La desdiferenciación in vitro de adipocitos maduros se logra a través de una técnica llamada cultivo de techo1. Debido a su tendencia natural a flotar en soluciones acuosas, los adipocitos maduros aislados se adhieren a la superficie de un matraz invertido completamente lleno de medio de cultivo. A lo largo de unos días, las células modifican su morfología esférica y se convierten en células similares a los fibroblastos. Las células resultantes, llamadas células de grasa desdiferenciada (DFAT), son multipotentes2. Los artículos de investigación sobre la desdiferenciación de adipocitos, especialmente en células humanas, son limitados. Sin embargo, ya han aportado información interesante sobre la multipotencia, el fenotipo celular y la capacidad replicativa de las células DFAT2. Los adipocitos maduros que se originan en varios compartimentos de grasa se han desdiferenciado con éxito, incluidos los que se originan en tejidos adiposos viscerales y subcutáneos humanos2-4. Además de estos depósitos, Kishimoto y colaboradores tomaron muestras de tejido adiposo de las almohadillas de grasa bucal y adipocitos desdiferenciados en células DFAT5. Matsumoto y sus colaboradores generaron con éxito células DFAT subcutáneas a partir de pacientes que cubrían un amplio rango de edades, y la mayoría de las células tenían una alta tasa proliferativa y menos del 6% de senescencia incluso después de 10 pasos en cultivo2.

Las células DFAT se han rediferenciado con éxito en varios linajes, incluidos los linajes adipogénicos, osteogénicos, condrogénicos y neurogénicos2,3,6. Estas células expresan varios marcadores de células madre embrionarias como Nanog y los cuatro factores pluripotentes identificados Oct4, c-myc, Klf4 y Sox23. También expresan marcadores específicos para cada una de las tres capas germinales7. Además, las células DFAT son similares a las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea (MSC derivadas de BM) en función de su firma epigenética3. Explotando la capacidad de las células madre de las células DFAT, muchos grupos han investigado su potencial para tratar o mejorar diversas enfermedades8,9. Se han observado mejoras de las condiciones patológicas, como tejido cardíaco fracturado, lesión de la médula espinal y disfunción del esfínter uretral, con inyecciones de células DFAT en modelos de enfermedad10-12 en ratas.

Además de las propiedades de las células madre de las células DFAT, pueden representar un nuevo modelo celular para los estudios de fisiología de los adipocitos. La línea celular 3T3-L1 se utiliza a menudo para este propósito, ya que estas células se diferencian en adipocitos adherentes que almacenan lípidos bajo estimulación adipogénica13. Sin embargo, estas células se originan a partir de tejido embrionario de ratón13. Además, la especificidad del depósito no se puede investigar con este modelo y puede que no refleje completamente la fisiología de los adipocitos humanos14. Otros laboratorios trabajan con células adiposas aisladas de depósitos de grasa murinos, pero la distribución de la grasa no es dimórfica en ratones y la configuración anatómica de la cavidad abdominal del roedor impide extrapolar directamente a los humanos15. Para estudiar los adipocitos en el contexto de la fisiopatología de la obesidad humana, se ha vuelto esencial considerar la distribución de la grasa corporal y las diferencias específicas del depósito de grasa16. Algunas limitaciones de los cultivos primarios de preadipocitos, incluidas las cantidades de células obtenidas de muestras de biopsia de tejido adiposo y su senescencia después de algunos pasos en el cultivo, crearon la necesidad de modelos alternativos. Perrini y sus colaboradores investigaron la especificidad del depósito en la expresión génica de las células DFAT procedentes de la grasa visceral y subcutánea y las compararon con las células madre derivadas del tejido adiposo (ASC) del mismo depósito de grasa. Demostraron que las diferencias en la expresión y función génica se encontraban principalmente entre depósitos que entre tipos de células, lo que sugiere que las células DFAT están fisiológicamente cerca de ASC del mismo depósito. Las células DFAT pueden representar una alternativa interesante a los modelos disponibles para estudios sobre la distribución de la grasa en la fisiopatología de la obesidad humana. Además, el cultivo en techo es un método prometedor para obtener células madre adultas con fines de ingeniería de tejidos.

Aquí, describimos la digestión de la colagenasa, una técnica ampliamente utilizada para aislar adipocitos maduros de las muestras de grasa subcutánea y/o visceral17, y los pasos posteriores para realizar el cultivo de techo y desdiferenciar estas células en células multipotentes, similares a los fibroblastos.

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Protocolo

Declaración de Ética: El proyecto ha sido aprobado por el Comité Ético de Investigación de IUCPQ previo a la contratación del paciente. A los efectos de este artículo / video, obtuvimos tejidos de 2 pacientes: 1) un paciente varón de 62 años de edad con un IMC de 50,7 kg / m 2 y 2) una paciente de 35 años de edad con un IMC de 57 kg / m 2. Los experimentos se pueden realizar con las dos compartimentos de grasa, pero se han limitado a un compartimento de grasa para el propósito de este video. Aspectos técnicos del video se realizaron con el paciente 1 e inmunofluorescencia FABP4 se realizó con células indiferenciadas del paciente 2.

Procesamiento 1. Muestra

  1. Pregunta a los cirujanos para recoger el tejido adiposo de los compartimentos de grasa omental y subcutáneo en el momento de la cirugía bariátrica laparoscópica.
  2. Traer rápidamente las muestras de tejido adiposo al laboratorio a temperatura ambiente y procesar inmediatamente.
  3. Realizar la digestión en el laboratorio, en un ambiente no estéril. Lacélulas eventualmente serán transferidos a la sala de cultivo y se cultivaron bajo condiciones estériles. Para evitar la contaminación, preparar tampón KRH con agua destilada y se filtró y el seguimiento de un (filtro 0.22μM) filtración antes de la digestión. Tubos Limpiar a fondo con etanol transferencia antes de la campana de cultivo celular para frasco y preparación plato.
  4. Coloque el tejido adiposo en un plato pesado previamente y registrar el peso. Fijar un pequeño trozo de cada muestra de tejido (menos de 1 cm 2) en tampón de formalina al 10% a temperatura ambiente durante al menos 24 h antes de la inclusión en parafina. Utilice esta muestra embebido para experimentos de inmunohistoquímica (técnica no mostrado).
  5. Coloque una pieza más en un tubo de 50 ml y el flash-congelación en nitrógeno líquido antes de almacenar a -80 ° C durante más estudios sobre los tejidos adiposos enteros (por ejemplo, la expresión de genes - técnica no se muestra).

2. digestión con colagenasa

  1. Coloque la pieza de tejido adiposo que permanece en un ml tu 50ser para la digestión.
  2. Añadir 4 ml de KRH-WB suplementadas con colagenasa (350 U / ml) por gramo de la muestra en el tubo de digestión.
  3. Picar el tejido adiposo con unas tijeras.
  4. Coloque picada suspensión de tejido adiposo en una coctelera, 37 ° C, 90 rpm máximo, para una incubación de 45 minutos (máximo 1 hora).

3. Purificación de los adipocitos y preadipocitos

  1. Vierta la solución transparente con unos trozos de grasa a través de un nylon 400 mM de malla en un vaso de plástico.
  2. Con pinzas, frotar la preparación de células en la malla de nylon y se lava con 5 ml de KRH-WB.
  3. Transferir delicadamente la suspensión celular se filtró en un tubo de 50 ml con el tubo de plástico en ella y una jeringa de 60 cc unida a la extremidad del tubo.
  4. Que la suspensión con adipocitos maduros reposar durante aproximadamente 10 min, permitiendo que las células alcanzan la parte superior de la memoria intermedia por flotación.
  5. Lentamente aspirar el tampón en la parte inferior del tubo utilizando Syrin 60ccsucción ge.
  6. Añadir 20 ml de KRH-WB para lavar. Repita desde el paso 3.4 para 2 lavados adicionales.
  7. Recoger el tampón para llevar la suspensión de adipocitos a un volumen final de 5 o 10 ml, dependiendo de la cantidad de células. Continuar con los pasos en la sección 5.
  8. Recuperar la fracción estromal-vascular de la memoria intermedia recogido con la jeringa de 60 cc por centrifugación (3000 rpm, RT, 5 min) para su posterior cultivo celular primario si se desea (técnica no se muestra).

4. adipocito maduro Cuenta de la célula

  1. Cargar 10 l de suspensión de los adipocitos sacudido suavemente en una cámara de recuento (hemocitómetro). Realizar el recuento de células por cuadruplicado.
  2. Calcular el número de células maduras aisladas.

5. maduro Adipocito Desdiferenciación en T-25 Frasco

  1. Llene un 25 cm2 tejido cultivo en matraz a ¾ del volumen con DMEM / F12-20% de suero de ternera.
  2. De acuerdo con el recuento de células, vierta 500.000 células maduras en el matraz.
  3. Llene el frasco completamente utilizando un tubo de 50 ml con medio y eliminar tantas burbujas como sea posible.
  4. Tornillo de la tapa sin ventilación en el matraz.
  5. Limpiar el matraz con etanol antes de la incubación para evitar la contaminación.
  6. Incubar el frasco boca abajo durante una semana sin tocarlo para evitar el movimiento de la cultura que puede perturbar la adhesión celular.
  7. Antes de invertir el matraz a 7 días de cultivo invertida, manipular suavemente el matraz y eliminar todo el medio en el matraz por aspiración, evitando movimientos bruscos.
  8. Añadir 12 ml de DMEM-F12-20 suero% ternera y cultivar células con técnicas estándar. A filtrada, tapa ventilada se puede añadir al matraz.

6. maduro Adipocito Desdiferenciación en una placa de 6 pocillos

  1. Coloque un cubreobjetos en la parte inferior de cada pocillo de una placa de 6 pocillos
  2. Añadir un ½ "casquillo de plástico en la parte superior de cada cubreobjetos.
  3. Llenar los pocillos con 8 ml de 20% de medio de suero de ternero-DMEM.
  4. Ponga un cubreobjetos en cada casquillo de plástico.
  5. Inserte punta de la pipeta entre la corredera y el tubo para inyectar células bajo la corredera (50.000 células por pocillo).
  6. Incubar las placas en una incubadora de cultivo celular estándar a 37 ° C con 5% de CO 2 durante una semana.
  7. Cubreobjetos inversa con células unidas en cada pocillo que contiene 2 ml de medio suplementado con suero de ternera 20% y llevar a cabo la cultura.
  8. Utilice cubreobjetos con células que experimentan desdiferenciación para varios propósitos incluyendo inmunofluorescencia (técnica no se muestra).

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Resultados

Los principales cambios morfológicos ocurren a adipocitos maduros durante la desdiferenciación (Figura 1). Como se muestra en la Figura 2, las células sometidas a la desdiferenciación se tiñeron con un anticuerpo anti-FABP4 para el análisis de fluorescencia. Las células con una morfología redonda expresaron la proteína FABP4 mientras que la mayoría de las células similares a fibroblastos no lo hizo. Después de desdiferenciación, células DFAT pueden cultivarse con procedimientos estándar...

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Discusión

Desdiferenciación de adipocitos maduros con la técnica de cultivo de techo es un nuevo enfoque para la obtención de células madre adiposas de una pequeña muestra de tejido adiposo nativo. Basándonos en nuestra experiencia y la de otros 2, un gramo de tejido es suficiente para platear un matraz de 25 cm2 y para obtener una población de células DFAT para que la homogeneidad se ha demostrado por Poloni y colaboradores 3. Desdiferenciación adipocito parece posible con células de un donante, ...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá Discovery Grant (371697-2011, AT). Los autores quieren agradecer la ayuda de los cirujanos bariátricos Drs. S. Biron, F-S. Hould, S. Lebel, O. Lescelleur, P. Marceau, así como Christine Racine y Caroline Gagnon del Banco de Tejidos de la IUCPQ. Agradecemos al Sr. Jacques Cadorette, de los servicios audiovisuales de la IUCPQ, por la grabación y edición del vídeo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Albúmina sérica bovinaSigmaA7906
AdenosinaSigmaA4036
Ácido ascórbicoSigmaA0278
NaClSe puede utilizar cualquier marca
KClSe puede utilizar cualquier marca
CaCl2Se puede utilizar
cualquier marcaMgCl2Se puede utilizar cualquier marca
KH2PO4Se puede utilizar cualquier marca
HEPESSe puede utilizar cualquier marca
GlucosaSe puede utilizar cualquier marca
tipo IWorthington Biochemical CorpLS-004196
DMEM/F-12, HEPES, rojo sin fenolGibco-Life Technologies11039-021Añadir a medio : 20% suero de ternera, gentamicina (50 µ g/ml) y Fungizone (2,5 y micro; g/ml)
Suero para terneros, suplementado con hierro, procedente de terneros alimentados con fórmulaSigmaC8056-500 ml
1/2 En casquillo de plásticoIberville2704-CPSKU:1000120918 (Home Depot)
Nitrógeno líquidoLinde
Formalin soluton, tamponado neutro, 10%SIGMAHT501128
Pinzas estériles
Tijeras estériles
Jeringas de 60 ccJeringa BD Tubo
de plástico Tampón
de stock Krebs-Ringer-Henseleit (KRH)Prepare el tampón de stock de la siguiente manera: 25 mM HEPES pH 7,6, 125 mM NaCl, 3,73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2,5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Ajuste el pH a 7.4.
Tampón de trabajo Krebs-Ringer-Henseleit (KRH-WB)Añada los siguientes componentes frescos al tampón KRH: 4% albúmina sérica bovina, 5 mM de glucosa, 0,1 y micro; M adenosina, 560 µ Ácido ascórbico
M KRH-WB suplementado con colagenasaAñadir 350 U/ml de colagenasa tipo I
T25 matraz de cultivo de tejidos con tapa sin ventilaciónSarsted u otra marca
Placa de cultivo de tejidos de 6 pocillosBD Falcon u otra marca
Cubreobjetos de microscopio 22x22Fisherbrand12-542-B
Vasos de precipitados estériles
Colagenasa tipo I

Referencias

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