Pez cebra queratocitos explantes para estudiar la migración celular colectiva y reepitelización en Curación de Heridas cutáneas

Resumen

Queratocitos de pez cebra migran en láminas de células a partir de explantes y proporcionan un modelo in vitro para el estudio de los mecanismos de migración celular colectiva en el contexto de la cicatrización de la herida epitelial. Estos protocolos detalle una forma efectiva para establecer cultivos de explantes primarios para su uso en ensayos de migración celular colectivos.

Resumen

Debido a sus propiedades únicas móviles, queratocitos de pescado disociarse de largo se han utilizado cultivos de explantes para estudiar los mecanismos de la migración de células individuales. Sin embargo, cuando se establecen los explantes, estas células también se mueven en conjunto, manteniendo muchas de las características que hacen individuo queratocitos un modelo atractivo para estudiar la migración: las tasas rápidas de la motilidad, extensa laminillas actina-ricos con un cable de actina perpendicular y velocidad relativamente constante y dirección de la migración. En los primeros explantes, la rápida interconversión de células que migran de forma individual con aquellos que migran colectivamente permite el estudio del papel de las adherencias célula-célula en la determinación del modo de la migración, y hace hincapié en los enlaces moleculares entre los dos modos de migración. Las células en explantes posteriores pierden su capacidad de migrar rápidamente y colectivamente como un epitelial a mesenquimal se produce y genes asociados con la curación de heridas y la inflamación se expresan diferencialmente. Por lo tanto, los explantes de queratocitos pueden servir como un modelo in vitro para la reepitelización que se produce durante la curación de heridas cutáneas y puede representar un sistema único para estudiar los mecanismos de la migración celular colectiva en el contexto de un programa definido de cambios de expresión génica. Una variedad de líneas de pez cebra mutantes y transgénicos están disponibles, lo que permite explantes que se establecerán a partir de peces con diferentes antecedentes genéticos. Esto permite que el papel de las diferentes proteínas dentro de estos procesos que debe abordarse de forma única. Los protocolos descritos aquí describen un método fácil y eficaz para el establecimiento de estos cultivos de explantes para su uso en una variedad de ensayos relacionados con la migración celular colectiva.

Introducción

Estudios de la motilidad celular se han centrado tradicionalmente en la migración de las células de forma individual. Queratocitos cultivados de pescado y explantes de anfibios han demostrado ser un poderoso sistema modelo para estudiar los mecanismos de la motilidad celular utilizando modelos experimentales y matemáticos enfoques ^1-6. El trabajo experimental en células que migran de forma individual es ayudado por el movimiento de deslizamiento rápida, suave de las células, mientras que mantiene una forma uniforme, la velocidad y dirección. Sin embargo, in vivo, las células se mueven frecuentemente colectivamente manteniendo al mismo tiempo las uniones célula-célula, en particular durante la embriogénesis, la cicatrización de heridas, y la metástasis. Por lo tanto, la migración celular colectiva es un área en crecimiento y cada vez más importante de la investigación en el campo de la migración celular. La migración colectiva de estas células ha sido recientemente descrito ⁷ y tiene muchas características únicas que lo hacen un potente sistema para estudiar la migración celular colectiva en un modelo de cicatrización de la herida.

ove_content "> Cuando escalas son arrancadas de un pez cebra adultos anestesiados, algo de tejido epitelial permanece unido a la parte inferior de la escala. Cuando se añade medio de cultivo celular, estas células epiteliales, o queratocitos, migran rápidamente como una unidad colectiva de la escala. La cultivo de explantes puede ser visto como un modelo de curación de heridas epiteliales, en la que las células migran desde el explante como lo harían a través de la matriz provisional de un lecho de la herida para restablecer un epitelio intacto. Los datos recientes sugieren que este cultivo ex vivo imita muchas características de in vivo la cicatrización de heridas en adultos de pez cebra. tasas de cierre de la herida ⁸ se traducen a una velocidad de migración similar a la observada en el sistema ex vivo ^7. Además, en una herida in vivo modelo de curación, el tratamiento con warfarina sugiere que la hemostasia no tiene ningún efecto sobre la tasa de de la curación, mientras que el tratamiento con hidrocortisona para reducir la respuesta inmune no retrasa reepitelización ⁸ . A medida que el pez cebra no sangra cuando se retira la escala del animal, la hemostasis no es un jugador importante. Aunque hemos encontrado células inmunes en explantes, no hemos estudiado los efectos que puedan tener sobre la migración celular colectiva.

El protocolo presentado aquí describe cómo establecer cultivos de explantes de queratocitos de pez cebra que garanticen la coherencia y reproducibilidad para su uso en muchos ensayos biológicos. Estos cultivos de explantes son particularmente convincente un modelo in vitro para la migración celular colectiva por varias razones. En primer lugar, los queratocitos de pez cebra son células primarias usadas dentro de los horarios de establecer cultivos de explantes. Por lo tanto, estas células no se han sometido a los cambios morfológicos y de expresión de genes asociados con el paso de las células primarias ^9-13. En segundo lugar, este sistema representa un modelo para el estudio de la reepitelización en respuesta a heridas y ^14, como parte de la respuesta a heridas, una epitelial a mesenquimal trproceso ansition (EMT) se inicia como se evidencia por los cambios en la expresión génica y reordenamientos del citoesqueleto ^14,15. Por lo tanto, los cambios de fondo en la expresión génica y la motilidad que se producen en las células no tratadas se han caracterizado y proporcionar un contexto para interpretar los cambios con el tratamiento. Además, la queratocitos pescado y el queratinocito humano son funcionalmente equivalentes; ambas son las células epiteliales primarias de sus respectivos especies y juegan un papel clave en la cicatrización de la herida epitelial. En tercer lugar, el pez cebra adultos están ganando reconocimiento como un sistema modelo para una variedad de enfermedades humanas ^16-18 incluyendo el melanoma y otros cánceres ^19-21, la curación de heridas cutáneas ^8,14 y el tejido de regeneración ^22-24.

Las ventajas técnicas de este modelo de sistema son igualmente convincente. Un creciente número de líneas mutantes y transgénicos están disponibles sin fines de lucro, instalaciones centralizadas. En concreto, el Proyecto Mutación pez cebra (ZMP) En el Wellcome Trust Sanger Institute tiene como objetivo crear un alelo nocaut en cada proteína del gen de codificación en el genoma del pez cebra. Actualmente, se han mutado 11.892 genes, aproximadamente el 45% del genoma, con 24.088 alelos caracterizados. Además, ZMP acepta propuestas y generará de forma gratuita knock-outs. Métodos recientes en caída gen en larvas y adultos de pez cebra ^25-28 proporcionan flexibilidad para estudiar la función de genes de desarrollo importantes para las que los enfoques transgénicos son problemáticos o poco práctico.

Debido a sus muy rápidas tasas de la motilidad de ~ 145 micras / hr poco después de establecimiento de cultivos ^29, los ensayos se pueden completar rápidamente (normalmente en 24 horas o menos). Como experimentos se pueden completar rápidamente y culturas crecen bien a TA, varios de los obstáculos técnicos asociados con la que se evitan los ensayos de migración de células de mamíferos que implican la microscopía de video. Además, en la edad de apriete presupuestos de investigación, zebrafish se mantienen fácilmente ya bajo costo.

La estructura y el comportamiento del explante es compleja. Como los peces no sangran cuando se retira la escala, es poco probable que mucho más que las capas epidérmicas superficiales se eliminan con la escala. Queratocitos parecen ser el tipo celular predominante en el explante, cuando las escalas se eliminan inicialmente a partir de los peces como la gran mayoría de las células parece teñir con un anticuerpo anti-E-cadherina ^14. Además, no hay evidencia de fibroblastos en el cultivo inicial a juzgar por la ausencia de tinción por inmunofluorescencia ¹⁴ vimentina. Sin embargo, con extracción repetida escala, parece que hay numerosos neutrófilos en el explante (ver video 1). Hemos identificado estas células como los neutrófilos basadas en las observaciones morfológicas de su tamaño, rápidamente la motilidad, y su migración fuera de la lámina de células cuando se exponen a LPS (datos no mostrados). Además, estas células se tiñen ingenio brillantesh un anticuerpo para el factor citosólico de neutrófilos, así como con una variedad de anticuerpos IgG secundarias, lo que indica que tienen abundantes FcRs en su superficie (datos no mostrados). Múltiples capas de células están presentes en el explante. La microscopía confocal revela la presencia de una sola capa cerca del borde que conduce a más de dos capas de queratocitos cerca de la escala con neutrófilos visibles por encima, por debajo y entre las hojas de queratocitos celular.

En los puntos de tiempo tempranos, las células en el borde del explante polarize multi-capa, iniciando la migración colectiva de los queratocitos del explante a tasas iniciales de ~ 145 micras / hr. El área cubierta por el explante aumenta rápidamente, dando lugar a la propagación de células, la tensión dentro de la lámina, y una disminución de la tasa de avance del borde de ataque. Interconversiones rápidos entre las células líder y seguidora se observan en el borde de ataque durante la formación y el cierre de los agujeros formados espontáneamente dentro de la hoja ^7. Como elEMT proceso iniciado con el explante continúa, los fragmentos de hoja y los queratocitos pierden su motilidad rápida especializada. La expresión de genes y cambios morfológicos consistentes con EMT, cicatrización de heridas y las respuestas inflamatorias se producen dentro de los 7 días de cultivo con explantes se consideran viables durante aproximadamente 10 días ^14.

Protocolo

Este protocolo se ajusta a los principios de bienestar AVMA animales para el cuidado y uso de animales de laboratorio y ha sido aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad del Medio Oeste.

1. Preparación de anestesia, equipos, y medios de comunicación

1. Declorar aproximadamente 1,5 L de agua del grifo usando un agente comercial declorinadora (disponible en tiendas de mascotas) o dejando reposar el agua durante 24 horas. Obtener tres vasos de 1 L y rellenar cada una con 500 ml de agua sin cloro. Marque uno para la celebración de los peces antes de cualquier procedimiento y otro para la recuperación. Para el tercer vaso de precipitados, añadir 100 g / ml de metanosulfonato de tricaína; esto se convierte en el vaso de precipitados en el cual se anestesiaron pescado.
2. Llenar una bandeja poco profunda con hielo, calentar el medio de cultivo (RPMI 1640, 10% de FBS (suero fetal bovino), 50 mg / ml de gentamicina, 100 mg / ml de kanamicina, 25 mM HEPES) a RT, y reunir las pinzas de joyero limpio. Pinzas limpias por immercantar los consejos de etanol al 70% y pasar a través de un mechero Bunsen, permitiendo que el etanol se consuma.
3. Decidir si el procedimiento se realiza sin aumento, con un tablero iluminado lupa comercial con 2 - 10 aumentos, o microscopio de disección (depende por completo de la preferencia personal).

2. Establecer cultivos de explantes

1. Coger el número deseado de pescado y colóquelo en un vaso de precipitados de retención. Transferencia de un solo pez en el vaso la anestesia; lo mejor es anestesiar pescado individualmente.
2. Monitorear los efectos de la anestesia mediante la observación de la natación y de enmalle movimiento de los peces. Como anestesia progresa, el movimiento de enmalle se ralentiza y los peces nadar de forma errática y con frecuencia al revés; considerar peces anestesiados tan pronto como el movimiento de enmalle cesa. No deje el pescado durante más tiempo en el baño de la anestesia, ya que esto puede resultar en la muerte de los peces.
3. Retire el pescado del vaso y la transferencia de la anestesiade hielo, colocar el pescado en posición horizontal con la cola hacia la mano que sostiene las pinzas. Si experimentado con la técnica y si varios peces se van a utilizar para hacer explantes, considerar la colocación de la siguiente peces en el vaso de precipitados de la anestesia en este momento.
4. Para eliminar escamas, pinzas posición paralela a los peces con punta en el borde de la escala. Presione lado plano de las pinzas ligeramente en el lado del pescado para causar la escala para elevar desde el cuerpo de los peces. Sujete escala con pinzas, desplume, y lugar (sin inversión) en placa de cultivo de tejidos. Repita el procedimiento, la eliminación de un máximo de 12 escalas de un adulto grande (6 de cada lado), evitando la región branquial, la línea lateral, y las aletas.
5. Coloque el pescado en el vaso de recuperación y seguimiento para asegurar que se recupera de los efectos de la anestesia. En este momento, los peces pueden ser transferidos a un tanque individual. Deje que el pescado para recuperar por lo menos durante 21 días para permitir la regeneración completa escala.
6. Dependiendo de ladiseño experimental, colocar hasta 20 escalas por plástico 35 mm placa de cultivo de tejidos tratados o 4 - 6 escalas por vaso plato de fondo. Permitir escalas a que se adhieran a la placa antes de añadir suavemente los medios de comunicación a fin de no separar escalas, desde el plato.
   NOTA: Con la experiencia, varios peces pueden ser procesados ​​antes de añadir medios de comunicación para el primer plato.
7. Añadir 1,2 ml de medio completo (ver 1.2) en cada placa de 35 mm.
8. Preferiblemente cultivos de explantes se incuban a 28 ° C en 5% de CO ₂ durante el periodo de tiempo deseado con o sin tratamiento adicional. Alternativamente, se incuban las culturas en una platina del microscopio calentado o dentro de una cámara de cultivo de células vivas para la microscopía de vídeo.

3. Campo claro y microscopía de vídeo

1. Platos de posición que contienen láminas de células en la platina del microscopio y se centran inicialmente utilizando la lente del objetivo 4X.
   NOTA: aumentos superiores, se pueden utilizar, dependiendo del experimento. Marcar la ubicación decada hoja y / o la orientación del plato en la etapa de célula facilitarán la toma de imágenes en el tiempo con las hojas en aproximadamente la misma orientación.
2. Sacar los recipientes de la incubadora y la fotografía en diversos puntos temporales, de acuerdo con cada protocolo experimental y colocar de nuevo en la incubadora si se necesitan sólo imágenes fijas sobre el marco de tiempo experimental.
3. Durante la realización de la microscopía de vídeo, preste atención a lo siguiente:
   1. Coloque la escala / lámina de células emergente dentro del campo de visión de tal manera que la lámina de células migrar permanece en el campo de vista de la duración del vídeo.
      NOTA: Esto puede tomar un poco de experiencia en la observación de cómo las células migran de debajo de la escala. Para vídeos cortos, esto es una preocupación menor que para vídeos más largos.
   2. Para plazos más cortos, se incuba a RT. Para plazos más largos (18 + hr), utilice una etapa climatizada o una cámara de incubación para mantener la temperatura, el equilibrio del pH, y para minimizar la evaporación de la cultura medio.

4. Fijación para microscopía de inmunofluorescencia

1. Preparar y pre-caliente todas las soluciones a 28 ° C. Con el fin de ver los queratocitos bajo de fluorescencia, crecer cultivos de explantes como se ha descrito anteriormente usando 35 mm platos de cultivo de tejidos con fondo de vidrio. También puede utilizar la cámara de diapositivas de vidrio.
2. Añadir 0,8 ml de paraformaldehído al 4% en PBS 1,1x a cada plato. No retire el medio de cultivo primera. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min y aspirar para eliminar la solución.
3. Añadir 0,8 ml de paraformaldehído al 4% en PBS 1,1x a cada plato. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min y aspirar para eliminar la solución.
4. A menos que el uso de ligandos externos o epítopos externos, permeabilizar las células mediante la adición de 0,5 ml de 0,2% Triton X-100 en PBS 1X. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min y aspirar para eliminar la solución.
5. Añadir 0,5 ml de 1% de BSA en PBS 1x y se incuba durante 1 hr (a temperatura ambiente) o O / N (a 4 ° C).
   NOTA: Dependiendo de las condiciones experimentales, phalloidin se puede añadir en este paso.
6. Después de la incubación, aspirado para eliminar la solución y proceder con la tinción de anticuerpos. Alternativamente, almacenar las placas de cultivo mediante la adición de al menos 1 - 2 ml de 1% de BSA en PBS 1x por 3 - 4 semanas a 4 ° C.

Protocolo 5. Inmunofluorescencia

1. Preparar soluciones de anticuerpos primarios y secundarios de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
   NOTA: Si las recomendaciones del fabricante no están disponibles, una buena dilución de partida de anticuerpos primarios (en 1% de BSA en PBS 1x) es de 1: 500 para policlonales y 1: 1000 de anticuerpos monoclonales; una buena dilución de partida para anticuerpos secundarios es 1: 1000. Ajuste estas diluciones de la población original obtenido del fabricante más alto si la señal es débil, inferior si la señal es fuerte y el fondo es un problema.
2. Aspirar el BSA 1% en solución 1x PBS. Añadir 0,5 ml de solución de anticuerpo primario y se incuba durante 1 hr (a temperatura ambiente) o O / N (a 4 ° C).
3. Eliminar la solución de anticuerpo primario, coloque en un lugar limpio y etiquetado 1,5 ml tubo de microcentrífuga, y congelar a -20 ° C.
   NOTA: Esto permite la reutilización de la primaria de anticuerpos, si es necesario.
4. Lavar el plato de 3 - 5 veces con PBS 1x, retirar y desechar el PBS después de cada lavado.
5. Añadir 0,5 ml de solución de anticuerpo secundario. Si lo desea, agregue phalloidin fluorescente marcada con (siguiendo concentración recomendada de cualquier fabricante) durante este paso. Incubar durante 1 h (a temperatura ambiente) o O / N (a 4 ° C).
   NOTA: El uso de phalloidin fluorescente marcado permite la visualización de los filamentos de actina; hemos encontrado que faloidina 488 marcado funciona mejor en nuestros queratocitos pez cebra, pero otros fluoróforos se pueden utilizar.
6. Retire y deseche la solución de anticuerpo secundario.
7. Lavar el plato de 3 - 5 veces con PBS 1x, retirar y desechar el PBS después de cada lavado.
   NOTA: El plato se puede almacenar, protegido de la luz, a 4 ° C si no puede competirw inmediatamente; asegúrese 1x PBS se añade en el plato antes de guardarla para asegurar que las células no se sequen, pero cálido a RT (20 - 30 min), luego retire la PBS justo antes de pasar al siguiente paso.
8. Cuando esté listo para observar, añadir 2-3 gotas de medio de montaje, con o sin DAPI, dependiendo de las necesidades experimentales, en el plato y dejar reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: Utilizamos un medio de montaje disponible en el mercado, basado en glicerol con DAPI, pero otros medios de montaje se puede utilizar. Permitir 10 min para el medio de montaje para sentarse en el plato facilita la eliminación fácil de la cubreobjetos de vidrio desde el fondo del plato.
9. Después de la incubación, apretar suavemente en los lados del plato para aflojar y retirar el cubreobjetos. Añadir una caída adicional de los medios de montaje en un portaobjetos de vidrio y colocar el cubreobjetos, las células hacia abajo, sobre el portaobjetos.
   NOTA: Considere sellar el cubreobjetos al portaobjetos usando esmalte de uñas transparente si la diapositiva debe mantenerse durante más de 1-2 días.
10. Observe el portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia.
    NOTA: La mayoría de nuestras imágenes fueron tomadas usando un lente objetivo de 40X o 63X con aceite de inmersión, pero el lente objetivo específico utilizado dependerá del protocolo experimental.

Resultados

Como se ilustra en la Figura 1, hojas de queratocitos se pueden observar la migración hacia fuera de debajo de la escala dentro de hora de establecer el cultivo de explantes. De vez en cuando, un queratocitos migración individual que se ha desprendido de la hoja colectivamente migración se puede observar. Además, como el explante se estableció a partir de un pescado que habían sido hechas anteriormente, existen abundantes neutrófilos que migran a través de la hoja. En períodos de cultivo más largas, los...

Discusión

El paso más crítico para el éxito del cultivo de explantes de queratocitos está permitiendo que la escala se adhiera a la placa de cultivo durante aproximadamente 2 - 3 minutos antes de la adición del medio de cultivo. Aproximadamente el 75% de las escalas se adherirá y crecer hojas (necesitará el número de cultivos establecidos para cada experimento que ajustarse en consecuencia). Hojas de queratocitos no forman alrededor de cada escala extraerán de los peces y se colocan en cultivo durante varias razones. En primer lu...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de cultivo con fondo de vidrio de 35 mm (recubiertas de lisina Poly-D)	MatTek	P35GC-1.5-14-C	grosor de 1,5 mm es el mejor para la eliminación de cubreobjetos. El diámetro de 14 mm proporciona más área de cultivo.
Pinzas Swiss Jewelers Style, Integra, Miltex 17-303	VWR	21909-460	Descubrimos que las pinzas estrechas y finas son las mejores para la eliminación de incrustaciones.