Semi-Alto rendimiento para Screening Potencial Sequía-tolerancia en lechuga ( Lactuca sativa) colecciones de germoplasma

Resumen

Este protocolo se desarrolló para evaluar la tolerancia a la sequía de una gran colección de germoplasma de la lechuga vegetal de hoja (Lactuca sativa L.), con el fin de identificar un pequeño grupo de lechugas candidatas para su uso en estudios fisiológicos, moleculares y genéticos para identificar los rasgos subyacentes de tolerancia a la sequía junto con los programas de mejoramiento.

Resumen

Este protocolo describe un método mediante el cual se examinó una gran colección de germoplasma de lechuga vegetal de hoja verde (Lactuca sativa L.) en busca de probables rasgos de tolerancia a la sequía. La disponibilidad de agua dulce para uso agrícola es una preocupación creciente en los Estados Unidos, así como en muchas regiones del mundo. Los episodios de sequía a corto plazo, junto con la intervención reguladora en la regulación de la disponibilidad de agua, junto con la amenaza inminente de cambios climáticos a largo plazo que pueden conducir a una reducción de las precipitaciones en muchas regiones agrícolas importantes, han aumentado la necesidad de acelerar el desarrollo de cultivos adaptados para mejorar la eficiencia en el uso del agua a fin de mantener o expandir la producción en los próximos años. Este protocolo no pretende ser una guía paso a paso para identificar a nivel fisiológico o molecular los rasgos de tolerancia a la sequía en la lechuga, sino que es un método desarrollado y refinado a través del cribado de miles de variedades diferentes de lechuga. La naturaleza de esta pantalla se basa en parte en las mediciones simplificadas que se centran en solo tres indicadores de estrés hídrico: el contenido relativo de agua de las hojas, la marchitez y el crecimiento diferencial de las plantas después del estrés por sequía. El propósito de examinar rápidamente una gran colección de germoplasma es reducir el grupo de candidatos a un punto en el que se puedan aplicar métodos fisiológicos, moleculares y genéticos más intensivos para identificar rasgos específicos tolerantes a la sequía en el laboratorio o en el campo. Los candidatos también pueden incorporarse directamente a los programas de mejoramiento como fuente de rasgos de tolerancia a la sequía.

Introducción

La disponibilidad de agua para riego ha sido una preocupación en gran parte de los Estados Unidos y en todo el mundo durante décadas, pero la investigación sobre la respuesta al estrés por sequía, junto con otros estreses abióticos, se ha quedado rezagada con respecto al trabajo en las áreas de enfermedades y resistencia a los insectos, a nivel industrial, académico y gubernamental en gran parte debido a la falta de financiación. Históricamente, la disponibilidad de agua para la agricultura ha sido solo una idea tardía a nivel de los responsables de la formulación de políticas. Recientemente, debido a varias sequías severas en importantes regiones de producción agrícola tanto en los Estados Unidos como en Australia, la disponibilidad de agua dulce^1,2 se ha puesto en el centro de atención tanto a nivel nacional como internacional, lo que ha llevado a que muchos más recursos se dirijan a la investigación para desarrollar cultivares tolerantes a la sequía de los principales cultivos de granos. Si bien este cambio de enfoque hacia el desarrollo de cultivos principales tolerantes a la sequía es beneficioso, al igual que muchas áreas de investigación de plantas, los cultivos especializados se han dejado atrás en gran medida.

Una severa sequía está limitando actualmente la producción de hortalizas en California, la mayor región productora de lechuga (Lactuca sativa L.) en los Estados Unidos³. Estos patrones climáticos a corto plazo, junto con la acción legislativa y judicial, junto con el cambio climático a largo plazo^4,5, se han combinado para reducir el agua disponible para la agricultura en muchas de las regiones más productivas de California. La producción de lechuga en California representa una industria de 1.5 mil millones de dólares que representa casi el 80% de la producción de lechuga en los Estados Unidos³. Las hortalizas de hoja tienen un alto contenido de agua en las hojas y la lechuga, en particular, tiene un sistema radicular poco profundo^6,7 que hace que el cultivo sea vulnerable al estrés hídrico. En la lechuga, como en todos los cultivos, el desarrollo de variedades tolerantes a la sequía será cada vez más importante a medida que el suministro de agua dulce para el riego se vea más limitado⁸.

Este protocolo establece un método mediante el cual se realizó un cribado inicial en una gran colección de germoplasma de lechuga con el fin de identificar un conjunto de líneas candidatas potencialmente tolerantes a la sequía para su uso en estudios fisiológicos, moleculares y genéticos para identificar rasgos específicos de tolerancia a la sequía. Estos candidatos también se pueden utilizar directamente como fuentes de tolerancia a la sequía en programas de mejoramiento para mejorar la eficiencia en el uso del agua en cultivares comerciales. Este protocolo se desarrolló específicamente para abordar los desafíos que surgen durante el transcurso de cualquier cribado de una colección extensa de germoplasma, especialmente los problemas de disponibilidad de espacio y mano de obra. Además, el protocolo presentado se desarrolló para su uso en lechuga, pero se ha adaptado con éxito para su uso en la detección de una colección de germoplasma de espinacas (Spinacia oleracea) para determinar su posible tolerancia a la sequía y podría modificarse simplemente para evaluar cualquier cultivo de hortalizas de hoja.

Una consideración importante antes de iniciar un cribado de tolerancia a la sequía es entender qué es y qué no es este método. Este protocolo pretende representar un método rápido mediante el cual un gran grupo de germoplasma puede reducirse rápida y eficientemente a un número manejable de germoplasma candidato para su uso en estudios más específicos y exhaustivos para identificar los rasgos de tolerancia individuales. Este protocolo somete a las plantas a un estrés hídrico severo inducido rápidamente, en contraste con un estrés de sequía continuo moderado más natural e inducido lentamente que se observaría en condiciones de campo. El tipo de respuesta inducida dentro de la planta durante estos dos tipos de eventos de estrés hídrico (deshidratación rápida versus sequía natural) no es idéntico⁹, lo que podría llevar a la exclusión de algunos materiales de ensayos futuros. Sin embargo, estos dos eventos de estrés no están exentos de superposición¹⁰ y este protocolo debería servir como una forma efectiva de identificar germoplasma potencialmente tolerante a la sequía contenido en una gran colección. Este protocolo por sí solo no debe considerarse suficiente para identificar con un alto grado de certeza el germoplasma que contiene una tolerancia duradera a la sequía en condiciones de estrés hídrico en el campo, pero representa un avance significativo en la detección rápida de hortalizas de hoja verde para detectar posibles rasgos de tolerancia a la sequía.

Protocolo

1. La plantación

1. Rellene charolas (128 células; 28 x 54 cm con células 3 cm cuadrados y 5 cm de profundidad) con mezcla de tierra del enchufe. Para ayudar en el llenado uniforme de células comprimir suelo en cada bandeja utilizando una charola vacía.
2. Semillas de lechuga Planta de ¼ de pulgada de profundidad 2-3 semillas por celda. Planta de todas las líneas experimentales en bandejas replicados para proporcionar tanto una sequía estresado y bandejas de control para el proceso de sequía.
3. Coloque charolas en una bandeja de base y sin agujeros.
4. Bandejas de agua y cubierta con bandeja invertida o cúpula de plástico. La germinación ocurre normalmente en 48 a 72 h. Después de la germinación retire la tapa y mover las bandejas en invernadero.
   NOTA: Este protocolo también se podría realizar en cámaras de crecimiento.

2. Crecimiento y Cuidado de las plantas

1. Bandejas de agua según sea necesario 1-4 semanas después de la germinación, normalmente esto es 2-3 veces a la semana, llenando la bandeja inferior y permitiendo que el suelo se sature (~ 1 h) los rayos de sentarse durante largos periodoss en el agua, ya que esto puede influir negativamente en la salud de la planta y desarrollo de las raíces y pueden afectar a la pantalla de la sequía.
2. Fertilizar bandejas una vez por semana con una soluble 20-20-20 fertilizante comercial mezclado en una proporción de 1,5 cucharadita / gal.
3. Bandejas delgadas a una planta por celulares 1-2 semanas después de la germinación.

3. Inicio del Estrés por Sequía

1. Cuando las plantas de cuatro semanas de edad bandejas separadas en 2 grupos. Asunto un grupo a un grave estrés hídrico. Utilice las otras bandejas como controles bien regados. Regar el grupo de control como en el paso 2.1 durante todo el experimento. En la iniciación del estrés por sequía suspend fertilizar todas las bandejas para el resto del experimento.
2. El período de sequía experimental se produce más de una semana. En el día inicial de la prueba de estrés por sequía (Día 0) llenar todas las bandejas inferiores con agua y deje que el suelo en las charolas para convertirse totalmente saturado y escurrir el agua de las bandejas. Saturar el suelo inmediatamente antes de la iniciación de la tél período de estrés le ayudará a minimizar cualquier variación en la humedad del suelo entre las células individuales en las charolas.

4. Realización de la pantalla El estrés básico Sequía con parámetros que deben medirse

NOTA: Los siguientes pasos describen cómo recolectar las tres mediciones fisiológicas que se registrarán en el transcurso de la pantalla de la sequía y el Cuadro 1 se presenta un calendario de las medidas tomadas en cada día del período de prueba sequía estrés.

1. Mida la Hoja contenido relativo de agua (CRA) en los días 0, 2, 4 del juicio.
   1. Clip una planta de lechuga de la bandeja y retire 2 hojas.
   2. Perforar 3 discos de cada hoja utilizando un perforador de corcho # 9 (~ 1.6 cm de diámetro). Combine golpes de hojas como una muestra.
   3. Pesar los discos de hojas, este es el valor de peso fresco (FW) utilizado para el cálculo RWC, a continuación, colocar los discos en una placa de petri.
   4. Agregar suficiente agua destilada a la placa para todosujo de todos los discos de hoja floten. Esto es para hidratar por completo los discos de hojas para recoger los pesos turgentes para el análisis RWC. Permita que los discos de hoja flotar durante 24 horas a temperatura ambiente.
   5. Retire los discos de hoja ahora completamente hidratadas de las placas y secar suavemente el exterior de los discos de hojas con toallas de papel antes de pesar los discos. Anote estos pesos como peso turgente (TW) para el cálculo de la RWC.
   6. Discos Coloque la hoja en un laboratorio de papel limpie o disco de papel de filtro en una placa de Petri abierta y seca en estufa a 55 ° C durante 24 horas.
      NOTA: El papel evita que los discos de hoja se adhiera a la placa de Petri durante el secado.
   7. Pesar discos de hojas secas y grabar pesos secos (DW) para el cálculo de la RWC.
   8. Calcula la RWC con la fórmula de Weatherley como se describe por Smart y Bingham ^11,12.
      RWC = (FW-DW / TW-DW) * 100
      FW = peso fresco, TW = peso turgente, DW = peso seco
   9. Repita el paso 4.1 para cada germoplasma y tratamiento en el ensayo.
2. Registre la planta se marchitan principio una vez al día en el día 1 del ensayo de estrés por sequía y termina cuando el 100% de las plantas se marchitó, normalmente el día 4 o 5.
3. Fase de recuperación y diferencial de crecimiento
   1. El día 6, la conclusión del período de sequía, el estrés y las plantas estresadas entran en la fase de recuperación del juicio. Llenar las bandejas inferiores con agua y permitir que las bandejas de afectados por la sequía en remojo durante 24 horas antes de reanudar el programa de riego estándar, paso 2.1, como las bandejas de control.
   2. Permitir que todas las plantas se recuperen durante 10 días.
   3. A los 10 días después de la sequía de estrés cosechar la totalidad encima de la parte de tierra de cada planta, y registrar el peso fresco.

Resultados

Al realizar una gran pantalla con el fin de segregar una población por el rasgo deseado experimental, en el caso de este protocolo de respuesta a la sequía estrés, los datos generados serán correspondientemente variar desde muy subrayan susceptibles a probable tolerantes a la sequía y todos los puntos intermedios. Figura 1 contiene gráficos que representan el tipo de resultados que se pueden esperar de este protocolo. Cultivares representativos de tres tipos de lechuga diferentes (Romaine (CoS), arrepol...

Discusión

Consideraciones de número de la muestra para la pantalla.

El número de muestras necesarias debe basarse en el uso deseado de los datos desde esta pantalla. Si se desean resultados de calidad publicación se recomienda para cosechar 3 plantas individuales (3 réplicas biológicas) de cada línea y realizar un mínimo de 2 réplicas experimentales para dar puntos adecuados para el análisis estadístico de la calidad. Si el resultado deseado es simplemente para reducir rápidamente una...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
bandeja de enchufe 128	T.O. Plastics Hummert International	11-8595-1	Cualquier marca de bandeja de enchufe funcionará, pero use el mismo estilo de bandejas para todas las pruebas.
bandeja inferior (bandeja de exhibición)	T.O. Plastics Hummert International	11-3305-1
plug/planting mix (Sunshine Mix #5)	Sunshine Hummert International	10-0467-1	Es posible que sea necesario sustituir una mezcla diferente si se adapta este protocolo a un cultivo diferente. Sunshine mix #4 se utilizó en los ensayos de espinacas.
fertilizante (20-20-20)	Jack's: Fertilizante profesional soluble en agua Hummert International	07-5915-1	Se puede utilizar cualquier fertilizante, ajustar el tipo según sea necesario para adaptar este protocolo a las necesidades específicas del cultivo.