Evaluación De La Invasión Bacteriana De Las Células Cardíacas En Cultivo Y Colonización Del Corazón En Ratones Infectados Usando Listeria monocytogenes

Resumen

Listeria monocytogenes causa infecciones fetales en mujeres embarazadas y meningitis en poblaciones susceptibles. Las subpoblaciones de bacterias pueden colonizar el tejido cardíaco, causando miocarditis en pacientes y animales de laboratorio. Aquí presentamos un protocolo que describe cómo evaluar la invasión de células cardíacas de L. monocytogenes in vitro y la colonización cardíaca en animales infectados.

Resumen

Los monocytogenes de la listeriería son un patógeno intracelular facultativo Gram-positivo que es capaz de causar infecciones invasores serias en pacientes immunocompromised, los ancianos, y las mujeres embarazadas. Las manifestaciones mas comunes de la listeriosis en seres humanos incluyen meningitis, encefalitis, y aborto fetal. Una secuela significativa pero mucho menos documentada de la infección invasor de los monocytogenes del L. implica el corazón. La tasa de mortalidad por enfermedad cardíaca puede ser de hasta el 35% a pesar del tratamiento, sin embargo se sabe muy poco sobre la colonización de L. monocytogenes del tejido cardíaco y sus patologías resultantes. Además, recientemente se ha hecho evidente que las subpoblaciones de L. monocytogenes tienen una mayor capacidad para invadir y crecer dentro del tejido cardíaco. Este protocolo describe detalladamente los métodos ines vitro e in vivo que se pueden utilizar para determinar cardiotropism de los aislantes de los monocytogenes del L. Los métodos se presentan para la infección de los mioblastos cardiacos de la rata H9c2 en cultura del tejido así como para la determinación de la colonización bacteriana de los corazones de ratones infectados. Estos métodos son útiles no sólo para identificar tensiones con el potencial de colonizar el tejido cardiaco en animales infectados, pero pueden también facilitar la identificación de los productos bacterianos del gen que sirven para aumentar la invasión de la célula cardiaca y/o para conducir cambios en patología del corazón. Estos métodos también proporcionan la comparación directa del cardiotropismo entre múltiples cepas de L. monocytogenes.

Introducción

Listeria monocytogenes es un patógeno intracelular Gram-positivo capaz de causar enfermedades graves en poblaciones susceptibles, incluyendo ancianos, mujeres embarazadas, personas con VIH/SIDA y personas que reciben quimioterapia¹. La infección en estas poblaciones es frecuentemente el resultado de la ingestión de productos alimenticios contaminados, y la mayoría de las infecciones están asociadas con brotes alimentarios a gran escala^2,3. En humanos y otros mamíferos, L. monocytogenes es capaz de translocar a través de la frontera epitelial del intestino delgado, siendo posteriormente transportado al hígado^4,5. Los m....

Protocolo

1. Condiciones de almacenamiento y cultivo para cepas de L. monocytogenes

1. Prepare medios sólidos autoclavando agar de infusión cerebro-corazón (BHI) y vertiendo los medios fundidos en placas de Petri. Deje que las placas se sequen durante la noche a temperatura ambiente, luego vuelva a pasar la noche a 37 °C.
2. Usando un lazo estéril, obtenga una pequeña muestra de L. monocytogenes de cualquiera de las existencias previamente hechas del congelador (bacterias suspendidas en glicerol del 20% en medios líquidos de BHI, almacenadas en -80 °C) o de una placa de agar que contiene colonias previamente pulsadas para el aislamiento.
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Resultados

Los aislantes seleccionados de los monocytogenes del L. exhiben la invasión aumentada de células cardiacas en cultivo celular y en modelos del ratón de la infección. La Figura 1 muestra un ejemplo de cómo pueden aparecer colonias bacterianas después del revestimiento puntual de suspensiones en medios de agar. Este método permite una evaluación precisa de las UFC dentro de una muestra sin utilizar un gran número de placas de medios de agar. La Figura 2 muestra un ejemplo de un en.......

Discusión

L. monocytogenes es un patógeno humano extendido y bien caracterizado, capaz de causar una serie de manifestaciones diferentes de la enfermedad¹⁵. La bacteria se ha descrito previamente por su capacidad de translocar a través de barreras, como la barrera hematoencefálica y las barreras placentario-fetales, con el fin de alcanzar y colonizar el sistema nervioso central y el feto en desarrollo, respectivamente. La capacidad in vivo del organismo para colonizar estos tejidos a menudo se compleme.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Difco	BHI Caldo Base	237200	2 kg de Infusión Cerebro-Corazón en polvo (sin agar)
Difco	Agar	214510	2 kg de Agar Granulado
Difco	BHI Agar	241810	2 kg de Infusión Cerebro-Corazón en Polvo con 7,5% de Agar
en vitrógeno	Base de Caldo LB	12975-084	2 kg de Base de Caldo Luria en Polvo (sin agar)
Fisher	Glass Cubreobjetos	12-545-80	12 mm cubreobjetos de vidrio
Falcon	Placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos	35-3047	24 pocillos, tratada con plasma Placa de cultivo de tejidos
Falcon	14mL Tubo de poliestireno	352051	14 ml Tubos de poliestireno Falcon
	Placa inferior en U de 96 pocillos	35-3077	Placa de 96 pocillos tratada con cultivo de tejidos
Corning	0,05% Tripsina, 0,53 mM EDTA (1X)	25-052-CI	Solución madre de tripsina EDTA para el cultivo de tejidos
Corning	DMEM (alto contenido de glucosa, alto contenido de piruvato)	15-013-CU	Medios DMEM sin FBS, glutamina ni antibióticos
Corning	Pen/Strep/Glut Solution	30-009-CI	Mezcla madre de penicilina, estreptomicina y L-glutamina para cultivo de tejidos
Corning	Gentamicin	30-005-CR	50 mg/ml Solución madre de gentamicina para cultivo de tejidos
Cellgro (Corning)	L-glutamina	25005197	Stock Solución de L-glutamina sin antibióticos
Matraz Denville	75cm^2	T1225	75 cm2 matraz tratado para cultivo de tejidos
Tubos de microcentrífuga Denville de 1,5 ml	2013004	tubos de microcentrífuga de 1,5 ml
ATCC	H9c2 Cardiacos Mioblastos	CRL-1446	Mioblastos cardíacos de rata
Hyclone	Suero fetal bovino	SH30070.63	Suero fetal bovino

Matraz de