Evaluación experimental de ratón sociabilidad Utilizando un enfoque de procesamiento de imágenes automatizado

Resumen

Este protocolo describe un método para cuantificar la sociabilidad ratón. Los ratones se graban en vídeo mientras se mueven e interactúan en una jaula especial. Procesamiento de vídeo permite la cuantificación automatizada de la sociabilidad con una excelente precisión y fiabilidad.

Resumen

Mouse es el organismo modelo preferido para probar fármacos diseñados para aumentar la sociabilidad. Se presenta un método para cuantificar la sociabilidad ratón en el que se coloca el ratón análisis en un aparato estandarizado y comportamientos relevantes se evaluó en tres sesiones diferentes (llamado sesión I, II y III).

El aparato tiene tres compartimentos (ver Figura 1), los compartimientos izquierdo y derecho contener una copa invertida que puede alojar un ratón (llamado "estímulo de ratón").

En la sesión I, el ratón de prueba se coloca en la jaula y su movilidad se caracteriza por el número de transiciones realizadas entre compartimentos. En la sesión II, un estímulo del ratón se coloca debajo de una de las tazas invertidas y la sociabilidad de la prueba ratón se cuantifica por las cantidades de tiempo que pasa cerca de la copa que contiene el ratón estímulo cerrado frente a la copa invertida vacía. En la sesión III, las tazas invertidas se eliminan una d tanto en ratones interactúan libremente. La sociabilidad del ratón de ensayo en sesión III se cuantifica por el número de enfoques sociales que hace hacia el estímulo del ratón y por el número de veces que se evita un enfoque social por el ratón estímulo.

La evaluación automatizada de la película detecta la nariz del ratón de prueba, que permite la determinación de todas las medidas de sociabilidad que se describen en la sesión I y II (en la sesión III, los enfoques son identificados automáticamente, pero clasifican manualmente). Para encontrar la nariz, la imagen de una jaula vacía se sustrae digitalmente de cada fotograma de la película y la imagen resultante se digitalizan para identificar los píxeles del ratón. La cola del ratón se elimina automáticamente y los dos puntos más distantes del ratón restante se determinan; estos están cerca de la nariz y la base de la cola. Mediante el análisis del movimiento del ratón y el uso de argumentos de continuidad, se identifica la nariz.

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Figura 1. Evaluación de la sociabilidad Durante 3 sesiones Sesión I (parte superior):.. La aclimatación de prueba ratón a la jaula Sesión II (medio):. Prueba de ratón el moverse libremente en la jaula mientras que el estímulo del ratón está encerrado en una copa invertida Sesión III (parte inferior): Tanto la prueba ratón y el ratón de estímulo se les permite moverse libremente e interactuar unos con otros.

Introducción

Sociabilidad alterada es uno de los dominios de los síntomas primarios en una variedad de trastornos del desarrollo neurológico, incluyendo los trastornos del espectro autista (TEA) ^1,2. Se limita severamente la capacidad de los pacientes para desarrollar relaciones y afecta en gran medida los pacientes, familias y cuidadores ^2,3.

En un esfuerzo para entender mejor el mecanismo subyacente de la sociabilidad deteriorado y desarrollar tratamientos, varios modelos de ratón han sido estudiados ^1,4-9. Uno de estos es la cepa de ratón BALB / c, una cepa endogámica que exhibe sorprendentemente baja sociabilidad, que se asemeja características que se observan en pacientes con ASD5 ^8-12. Por ejemplo, el ratón BALB / c muestra una menor frecuencia de enfoques sociales y una respuesta generalmente negativa a los enfoques sociales por un ratón estímulo (por ejemplo, evitación social) que la cepa comparador Swiss Webster ^10.

Para probar si un tratamiento propuesto es effective en el aumento de la sociabilidad, se necesitan medidas objetivas. Un marco ampliamente aceptado es analizar la sociabilidad en un aparato estandarizado que tiene tres compartimentos (ver Figura 1).

Los compartimientos izquierdo y derecho contienen cada uno una copa invertida de alambre que alberga un ratón estímulos socialmente relevante. El ratón de prueba se libera en el aparato para tres intervalos de 10 min (sesiones I-III); sesión de I evalúa la actividad locomotora del ratón de prueba, mientras que las sesiones II y III evaluar diferentes aspectos de la sociabilidad de la prueba ratón.

En la sesión I, se permite que el ratón de prueba para aclimatar al aparato. En esta sesión, se mide el número de transiciones que la prueba ratón hace entre los diferentes compartimentos. Es importante destacar que las medidas de sociabilidad obtenidos en el aparato de tres compartimientos estándar dependen de la actividad locomotora y la actividad locomotora reducida pueden confundir la interpretación de socilos datos de capacidad.

En la sesión II, la prueba ratón se mueve libremente y un estímulo del ratón se coloca debajo de una de las tazas invertidas (compensada). Los ratones de estímulo son viejos ratones ICR macho no consanguíneos de 4 semanas, por edad y sexo adaptado a los ratones de prueba. El ratón estímulo está encerrado en una copa invertida en el lado designado como el compartimiento social y una copa invertida vacía se coloca en el lado designado como el compartimiento no social. En la sesión II, la sociabilidad de la prueba ratón se cuantifica mediante la comparación del tiempo que pasa cerca de la copa "social" invertida (menos de 2 cm de distancia) versus el tiempo que pasa cerca de la copa invertida "no social", y por el momento que pasa en el compartimento sociales versus el tiempo que pasa en el compartimento no social. ratones Swiss Webster comparadores pasan mucho más tiempo en el compartimiento social y cerca de la copa invertida social, en comparación con los ratones BALB / c que no muestran ninguna preferencia significativa para el desarrollo socialcopa invertida o el compartimento sociales ^12.

En la sesión III, los ratones de prueba y de estímulo se les permite interactuar libremente (tazas invertidas se eliminan). Las medidas de sociabilidad, comportamientos estereotipados y las transiciones entre los compartimentos se obtienen de forma fiable en la tercera sesión de 10 minutos de interacción libre entre los ratones de prueba y de estímulo y analizado. En este informe, la sociabilidad de la prueba ratón se cuantifica a través de dos medidas: 1) el número de enfoques sociales que tiene hacia el estímulo del ratón, donde un enfoque social se define como el movimiento hacia adelante (empezando por la nariz) hacia el estímulo del ratón de modo que la nariz es inferior a 2 cm de distancia del ratón de estímulo; 2) el número de evitaciones de enfoques sociales por el ratón estímulo. El ratón prueba se considera estar evitando el enfoque si resulta o se aleja del estímulo del ratón, o si se detiene temporalmente en movimiento ( "comportamiento congelación") después de que el estímulo del ratón se ha acercado a la prueba ratón. BALB /ratones c muestran una disminución en el número de enfoques sociales realizados para el ratón estímulo y un aumento en el número de respuestas negativas a enfoques sociales por el ratón de estímulo, en comparación con la cepa comparador Swiss Webster ^10.

La evaluación de las películas de comportamiento se ha hecho tradicionalmente de forma manual, es decir, por ver la película cuidadosamente (posiblemente a velocidad reducida) y la activación de los contadores de tiempo para el tiempo que el ratón pasa en un determinado compartimiento o cerca de una de las tazas invertidas ^10. Este método requiere observación de la película en varias ocasiones y es, por lo tanto, mucho tiempo. Además, la exactitud está limitada por el tiempo de reacción del evaluador para las mediciones de cronómetro y su capacidad de percibir si el ratón está dentro de 2 cm de la copa invertida. En un trabajo reciente, dos compuestos, (D-serina y D-cicloserina) han demostrado ser eficaces en la restauración de la sociabilidad en ratones BALB / c ^9,10,12. Se sabe que tanto los componentes modufinales del receptor NMDA, que se sabe que juega un papel central en el comportamiento social ^2,12. Un gran conjunto de compuestos es conocida para modular la actividad del receptor NMDA en una variedad de formas bien definidas, y la posibilidad de un gran avance en el tratamiento ASD hace que la evaluación acelerada de estos compuestos en una prioridad y un método rápido y automático para la evaluación altamente deseable.

A continuación se describe un procedimiento de análisis automático desarrollado para la evaluación de la sociabilidad ratón. Utiliza métodos de procesamiento de imágenes en todas las tramas de las películas de ratón para identificar la posición del ratón o ratones. En las sesiones I y II, se detecta aún más la posición de la nariz y la utiliza para calcular las medidas de sociabilidad. En la sesión III, que detecta automáticamente todos los enfoques, pero se requiere la clasificación manual (enfoque social, evitación social, o de otro tipo).

Protocolo

El protocolo para la facilidad de la explicación se ha dividido en 2 partes: 1) Procedimiento experimental y 2) el análisis automatizado. Todos los animales fueron tratados de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio ^15, y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional.

1. Procedimiento experimental

1. Configurar la jaula, que es una de plexiglás negro no reflectante caja rectangular (52 x 25 x 23 cm ^3), dividido en tres compartimentos: social, no sociales, y un compartimiento medio neutro (Figura 1). Colocar tazas de alambre invertidos en cada uno de los compartimentos durante las sesiones finales I y II (véase más adelante) y albergar el estímulo del ratón durante la sesión II.
2. Configurar la cámara de tal manera que la jaula llena el campo de visión. Desde la iluminación puede interferir con el comportamiento del ratón, mantener una luminancia de no más de 3,5 lux dentro de la jaula, que viene de la luz indirecta desdeuna bombilla incandescente y medido en el suelo de la jaula en la dirección hacia arriba. También utilice una fuente de luz infrarroja, que los ratones no pueden percibir pero la cámara puede detectar. Registrar todas las películas de 720 x 480 de definición estándar.
3. Grabar un solo fotograma de una jaula vacía para el procesamiento de imágenes más tarde (el llamado "sistema de referencia") y guardar como una imagen en escala de grises.
4. Sesión I: Presente prueba ratón en la jaula y agito la mano sobre la jaula, lo que indica el inicio de sesión (véase el análisis automatizado). grabación de vídeo durante 10 minutos. Al final de 10 minutos, poner el ratón de nuevo en su jaula originales.
5. Sesión II: Poner el estímulo del ratón en una de las copas invertidas (compensada).
6. Utilice el botón "Social izquierda" o "derecha social" para seleccionar si el estímulo del ratón se encuentra en la copa invertida de la izquierda o en la copa invertida a la derecha.
   NOTA: La copa invertida con el estímulo del ratón se llama la "copa social", mientras que el otrotaza de la "copa no social". El compartimiento en el que la copa se encuentra sociales se llama el compartimiento sociales, el compartimento con la copa no social es el compartimento no social, y el compartimiento medio es el "compartimento neutral".
7. Introducir la prueba ratón en la jaula. la mano de onda sobre la jaula para indicar el inicio de la sesión. grabación de vídeo durante 10 minutos. Es importante destacar que, mantener los ratones en el aparato de la sociabilidad antes de retirar las copas invertidas para comenzar la Sesión III.
8. Sesión III: Retire las copas invertidas, suelte los dos ratones y permitir que los ratones de prueba y de estímulo para interactuar libremente entre sí. la mano de onda sobre la jaula para indicar el inicio de la sesión. grabación de vídeo durante 10 minutos. Al final de 10 min, poner los dos ratones de nuevo en sus respectivas jaulas.

2. Análisis Automatizado

NOTA: Los comandos de la sección 2 se emiten a través de una interfaz gráfica de usuario (ver Figura 2) que controles nuestro software. A continuación se explica el procesamiento paso a paso que permite a nuestro software; el software también es capaz de realizar el análisis en modo por lotes sin intervención del usuario.

1. Para cada película, ejecute los siguientes pasos de procesamiento:
   1. Cargar película (en el botón Cargar click).
   2. Seleccione la configuración de la jaula, que le dice al programa de análisis de la ubicación de los límites de la jaula, límites de compartimentos, y los lugares de copa. Seleccione una de las cuatro configuraciones guardadas o ajustar manualmente todas las coordenadas.
      NOTA: La configuración por lo general no cambia de un experimento al siguiente y por lo tanto se puede reutilizar.
   3. Para cada fotograma de la película, realice los siguientes pasos de procesamiento (2.1.3.1-2.1.3.6).
      1. Convertir el marco a escala de grises haciendo clic en el botón "Escala de grises".
      2. restar digitalmente el marco de referencia de escala de grises (véase el paso 1.3) haciendo clic en el botón de "sustraer". NOTA: El objetivo de este paso es hacer que los va pixellues del bastidor muy cerca de cero en todas partes excepto en la posición del ratón.
      3. Binarización en el marco mediante el establecimiento de todos los píxeles por debajo de un cierto nivel umbral de negro, todos los píxeles por encima de ese nivel a blanco (haga clic en el botón "binarización").
         Nota: La idea es que, dado que los píxeles de ratón generalmente tienen valores más altos que los píxeles restantes, los píxeles del ratón se convertirá en blanco y negro todos los otros píxeles. El nivel de umbral óptimo depende de la condición de iluminación y se puede determinar mediante la evaluación de la forma del ratón a través de una película. Si se elige demasiado baja, el umbral, el ratón parece demasiado grande, y los píxeles que no pertenecen al ratón puede ser de color blanco. Si el umbral es demasiado alto, el ratón se vuelve pequeño y puede desintegrarse en trozos desconectados. En las películas grabadas, el umbral óptimo estuvo siempre entre 20 y 35 (en una escala de 0 a 255).
      4. Erosionan ¹³ los tiempos de imagen e binarizadas, a continuación, se dilatan ¹³ 2e veces, y luego erode veces de nuevo e, pulsando el botón "Erod / Dil".
         Nota: El propósito de este procedimiento es eliminar la cola. Para la resolución (720 x 480) que se utilizó, e = 3 trabajó en todas las circunstancias.
         Nota: El software comprueba automáticamente la presencia de una mano en la imagen (durante la grabación de películas, las manos se agitan a través de la imagen para indicar el comienzo de una sesión). Si una mano está presente, no habrá inusualmente muchos píxeles blancos en el marco binarizada porque la mano es mucho más grande que un ratón. La condición para la presencia de una mano es que hay más de 10.000 píxeles blancos en el marco binarizada. El software determina los inicios de sesiones I, II, y III, mediante la detección de la gama de marcos en los que se producen movimientos de la mano.
2. En las sesiones de I y II, continuar como sigue:
   1. Detectar el mayor componente conectado del conjunto de píxeles blancos (Haga clic en "LComp"). Nota: El propósito of este paso es eliminar los píxeles blancos que no pertenecen al ratón, por ejemplo, causada por el movimiento del ratón estímulo en sesión II. El componente conectado es más grande en casi todos los marcos del ratón.
   2. Determinar las dos píxeles blancos más distantes (llamados los "extremos" del ratón), haga clic en "Find Final".
      Nota: El software establece la continuidad de los dos extremos, es decir, para cada uno de los extremos en el primer fotograma a cuál de los extremos de las tramas posteriores que pertenecen. La idea general es que, dado que las tramas se registran a alta velocidad, los extremos no pueden viajar lejos de un fotograma al siguiente, de modo que para la continuación correcta de los extremos de una trama a la siguiente es la que minimiza la suma de las distancias que los extremos se mueven. Véase la discusión para más detalles.
   3. Determinar qué extremo del ratón es la nariz.
      1. Determinar la dirección en la que un ratón se mueve por la observación de cómo el centro de gravedad (COG)cambios de cuadro a cuadro (el movimiento del COG es el movimiento de la suma de todos los píxeles de ratón).
         Nota: El COG de un conjunto de píxeles p _1, ..., p _n con coordenadas x _1, .., x _n se define por:
         
         Los ratones normalmente se mueven hacia adelante (es decir, hacia la nariz). En una sección de varios cientos de marcos, no siempre es muy alta confianza en la detección de la cabeza / cola.
         Nota: El software determina automáticamente hacia cuál de los extremos detectado el ratón se está moviendo; este fin se identifica como la nariz y marcado con un círculo rojo en la película. Cuando la nariz detectado está marcado con un círculo rojo en cada trama, el usuario puede comprobar la calidad de la detección.
3. En la sesión III, continuará de la siguiente manera:
   1. Detectar dos mayores componentes de píxeles blancos.
      1. Si ambos son de tamaño aceptable para amouse y sus centros de gravedad (COG) son compatibles con los COG ratón de la trama anterior, tenga en cuenta estos dos componentes de los dos ratones.
      2. Considere el tamaño aceptable de ratón si no han cambiado en más de un 20% desde la trama anterior, y considerar engranajes de dos tramas consecutivas como compatibles si su diferencia no es mayor que la distancia que un ratón puede viajar en el tiempo entre tramas (esta distancia sigue de la velocidad máxima del ratón, lo que puede determinarse como parte de los preparativos de una serie de experimentos mediante el análisis del movimiento de varios ratones individuales (como en sesiones I y II).
         Nota: Si los dos componentes más grandes son los tamaños no aceptables para un ratón, o los engranajes son muy diferentes de los de la trama anterior, el software aumenta automáticamente el umbral de binarización hasta que los dos componentes más grandes son de tamaño aceptable y sus engranajes son compatibles con los de la trama anterior.
   2. Clic con el ratón en la pruebael primer fotograma. Utilice el análisis en el apartado 2.3.1 para identificar tanto la prueba y estímulo del ratón en cada fotograma de la sesión III.
   3. Identificar los marcos en sesión III en la que el uno del ratón se acerca socialmente el otro. Nota: El software implementa este paso comprobando automáticamente que la distancia entre los ratones es menor que la distancia interacción típica de los ratones (utilizamos 2 cm).
   4. Cuando el software juega un segmento corto de la película con el enfoque detectado al usuario, haga clic en un botón para indicar si este enfoque se califica como un enfoque social por el ratón de prueba, evitación social por el ratón de prueba, o ninguno.
      Nota: Paso 2.3.4 puede automatizarse si se sabe cual es el ratón el ratón de prueba. Dado que esta información se pierde cuando los ratones se ponen demasiado cerca unos de otros (o suba encima de la otra), y sin embargo, no desde que hemos encontrado una manera de etiquetar los ratones de manera que se puede detectar de forma fiable por nuestro software y hace no afecta a su comportamiento, hemos vuelto aclasificación manual para ahora.
4. Para evaluar las películas procesadas, las películas de carga utilizando el botón Cargar.
   1. Haga clic en Inicio de sesión 1 para visualizar el primer fotograma de la sesión 1 (o Iniciar Sesión 2 para visualizar el primer fotograma de la sesión 2).
   2. Haga clic en Reproducir / Detener para reproducir y detener las películas.
      Nota: Las películas procesadas mostrarán ratón con la cabeza y la cola marcada con círculos de diferentes colores. Todas las medidas de sociabilidad se visualizan en la pantalla y se actualizarán mientras se reproduce la película.
   3. Exportación de datos de sociabilidad en formato Excel haciendo clic en "Exportar".
   4. Haga clic en "Compilar datos" para recopilar todos los datos de todas las películas en una carpeta en un solo archivo de Excel.

Resultados

La Figura 3 muestra un marco de color de una película de comportamiento con una jaula vacía. El ratón no se ha introducido en la jaula todavía. La posición de las copas, (sociales y no sociales) y los límites de compartimentos están superpuestos. El marco de color de jaula vacía se convierte a escala de grises de 8 bits como se muestra en la Figura 4 y se utiliza como un marco de referencia. El sistema de referencia se resta de cada dos fotogramas de la película capturada.

Discusión

Mediante la combinación de los ratones grabar en vídeo y análisis automático de la película, hemos creado una técnica asequible y fiable de alto rendimiento de cribado.

La precisión del análisis automatizado se comparó con los resultados del análisis manual para más de 100 películas. En la inmensa mayoría de los marcos (> 99%) de los marcos, la nariz del ratón se identifica con una buena precisión. La mayor parte de los (pocos) misdetections tienen ningún efecto sobre las medidas de socia...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jaula de plexiglás	Norva Plastics, Norfolk, VA	Hecho a medida	Las dimensiones y el diseño descritos en el manuscrito, se pueden ajustar según las necesidades. Utilice plexiglás no reflectante para facilitar el procesamiento de imágenes
Tazas de alambre	Kitchen plus	315	Use uno para albergar el ratón de estímulo, una
cámara de vídeo	SONY	HDR-PJ790	Puede ser reemplazado por cualquier cámara con Especificaciones comparables
OpenCV (Biblioteca de procesamiento de imágenes)	Willow Garage	N/A	Se puede utilizar cualquier biblioteca de procesamiento de imágenes moderna .