Un chip de microfluidos para ICPMS Introducción Muestra

Summary

Presentamos un sistema de introducción de muestras de gotas discreto para la espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). Se basa en un chip microfluídico barato y desechable que genera gotitas altamente monodispersas en un intervalo de tamaños de 40-60 micras, con frecuencias de 90 a 7000 Hz.

Abstract

Este protocolo se discute la fabricación y el uso de un bajo costo chip de microfluidos desechable como sistema de introducción de muestras para espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). El chip produce gotas monodispersas muestra acuosa en perfluorohexano (PFH). El tamaño y la frecuencia de las gotitas acuosas se pueden variar en el intervalo de 40 a 60 micras y de 90 a 7000 Hz, respectivamente. Las gotitas son expulsadas desde el chip con un segundo flujo de PFH y permanecen intactos durante la eyección. Un sistema de eliminación de disolvente hecha a la medida elimina la PFH y transporta las gotas en los ICPMS. Aquí, las señales muy estables con una distribución de intensidad estrecha se pueden medir, mostrando la monodispersidad de las gotitas. Se demuestra que el sistema de introducción se puede utilizar para determinar cuantitativamente el hierro en los glóbulos rojos bovinos individuales. En el futuro, las capacidades del dispositivo de introducción fácilmente se pueden extender por la integración de módulos adicionales de microfluidos.

Introduction

El análisis elemental de muestras líquidas por ICP-MS (ICP-MS) se lleva a cabo utilizando nebulizadores comúnmente en combinación con cámaras de nebulización como sistema de introducción ^1. En este sistema de introducción de muestra de la muestra se pulveriza mediante un nebulizador para generar un aerosol polidispersa. Una cámara de pulverización de aguas abajo se utiliza para filtrar grandes gotitas. Este método se asocia con un alto consumo de muestra (> 0,3 ml min ^{-1) 2} y un transporte de la muestra incompleta. Por lo tanto, se convierte en impracticable para aplicaciones en las que los volúmenes de muestra sólo microlitros están disponibles, como en estudios biológicos, forenses, toxicológicos y clínicos ^3. Para reducir el consumo de muestra, nebulizadores con dimensiones de boquillas más pequeñas se desarrollaron ^3. Sin embargo, el tamaño de la boquilla reducido aumenta el riesgo de obstrucción cuando las muestras de fluidos biológicos no digeridos o soluciones salinas concentradas tienen que analizarse ^3.

Un enfoque diferente para la introducción de la muestra fue propuesto por Olesik et al. ^4. Los autores inyectaron un líquido en ICPMS en forma de microgotas discretas monodispersas, que fueron producidos por una microbomba impulsado piezo-eléctricamente. A pesar de que este mismo sistema no se encontró una amplia aplicación, se inició el desarrollo del concepto de introducción de gotas discretas en ICPMS. Hoy en día, piezo-eléctricamente impulsado sistemas, que pueden generar gotitas de tamaño de 30, 50, 70 y 100 micras y en las frecuencias de 100-2.000 Hz dispensación, se puede comprar. Las gotas pueden ser transportadas en ICPMS con cerca de 100% de eficiencia ^5. Estos dispensadores microgotas se han aplicado para medir cuantitativamente nanopartículas individuales ^5,6, así como la caracterización de las células biológicas individuales ^7. Un sistema similar basado en la tecnología de inyección térmica de tinta ⁸ se ensayó para el análisis de muestras biológicas ^9. Aunque el AvaIsistemas de introducción de gotas individuales lable son muy eficientes, se puede utilizar para pequeños volúmenes de muestra y son prometedores para el análisis de las nanopartículas y células, tienen varias limitaciones. Para un tamaño de boquilla fija, el tamaño de gota se puede variar sólo ligeramente (a menos que los ajustes personalizados se utilizan ^10). Los cambios de las propiedades físicas del líquido (pH, contenido de sal) pueden alterar las características de la gota (tamaño, velocidad de inyección). Además, estos dispositivos son bastante caros, con tendencia a la obstrucción y son difíciles de limpiar.

Otro método para generar gotitas se conoce en el campo de la microfluídica gotita ^11. En los últimos años microfluidos gota ha ganado el interés de (bio) reacciones químicas ^12-15 y para estudios de células individuales ^16,17. Además, esta técnica se aplicó para la introducción de muestras en la espectrometría de masas de ionización por electrospray ^18,19 y para la preparación de muestras en la matriz asistida por láser de desorción / ionization espectrometría de masas ^20,21.

Recientemente, hemos introducido un sistema basado microfluidos para la introducción de la muestra en ICPMS ^22. El componente clave de nuestro sistema de introducción es la expulsión de gotitas (LADE) de chips líquida asistida. Este chip consiste completamente de poli (dimetilsiloxano) (PDMS). En el primer cruce canal de flujo de enfoque se usa para generar gotas monodispersas de una solución acuosa de la muestra (Figura 1). Para ello, el (punto de ebullición de 58-60 ° C ²³⁾ altamente volátil y perfluorohexano fase de la portadora inmiscible (PFH) se utiliza (Figura 1). Estas propiedades PFH permiten una generación de gotas estable y rápida eliminación de la fase de la portadora. Los cambios en las propiedades de la influencia líquido de muestra este método de generación de menos, en comparación con otros generadores de gotas. El tamaño de las gotas es ajustable en un amplio intervalo cambiando los caudales de la fase acuosa y la PFH. En una secondar aguas abajoy unión, se añade más PFH para aumentar la velocidad de flujo para al menos 1 m ^s-1. A esta velocidad el líquido puede ser expulsado desde el chip en chorro estable y recta (Figura 1) sin destrucción de gota (Figura 1 recuadro). Este diseño de doble unión permite el control de la estabilidad del chorro independiente de generación de gotas. Las gotitas se transportan a los ICPMS con un sistema de transporte personalizado. Este sistema se compone de un tubo de caída y un desolvator membrana para eliminar el PFH. Los residuos secos de las gotitas acuosas se ionizan posteriormente en el plasma de la ICP-MS y un detector mide la masa de los iones. La parte frontal del chip es para asegurar una conexión hermética con el sistema de transporte de gotitas en forma de barril. La eyección de la muestra acuosa en forma de gotitas en PFH es beneficioso, ya que el contacto con la boquilla se evita. Esto reduce considerablemente el riesgo de obstrucción de la boquilla, que puede ser un problema cuando se trabaja con suspensiones de células o cosoluciones salinas ncentrated. Los chips de LADE, fabricados por PDMS litografía blanda, son baratos (coste del material de aproximadamente $ 2 por chip), disponible y fácil de modificar. En combinación con la fabricación que requiere sólo una pequeña cantidad de trabajo manual de cada experimento se puede realizar con un nuevo chip. Por lo tanto, no es necesaria una limpieza laboriosa y contaminación cruzada se reduce al mínimo.

Aquí, la fabricación del chip LADE por litografía blanda y su aplicación para ICPMS se describen. Se presentan ejemplos de mediciones con una solución acuosa y una suspensión celular.

Protocol

1. SU-8 de fabricación Master (Figura 2)

NOTA: Realice la fabricación de los SU-8 maestros moldes en una habitación limpia para evitar los defectos causados ​​por partículas de polvo. Se necesitan dos obleas para la fabricación, una oblea con características de microfluidos y otro sin él.

1. Preparar los moldes maestros para el chip de microfluidos. En primer lugar aplicar una capa de adhesión a la oblea de silicio.
   1. Deshidratar una oblea de silicio durante 10 minutos a 200 ° C. Enfriar la oblea hasta RT y cargarlo a una capa que recubridora de rotación y giro con SU-8 2002 con el siguiente protocolo.
   2. Sobre Dispense 3 ml resisten sobre la oblea.
   3. Girar la oblea a 500 rpm durante 10 seg para difundir la resisten sobre toda la oblea.
   4. Girar la oblea a 2000 rpm durante 30 segundos para alcanzar una altura resistir de aproximadamente 2 micras.
2. Retire el exceso de resistir desde el borde de la oblea con un hisopo empapado en acetona, para evitarpegado de la oblea a la placa caliente en el siguiente paso. Hornee la oblea de 60 segundos a 95 ° C en un plato caliente.
3. Exponer a toda la oblea con luz ultravioleta (80 mJ / cm ² a 365 nm). Post-hornear la oblea durante 120 segundos a 95 ° C.
4. Enfriar la oblea hacia abajo y girar inmediatamente capa de la oblea de nuevo utilizando el siguiente protocolo de SU-8 2050:
   1. Girar la oblea a 100 rpm durante 20 seg (dosificar aproximadamente 3 ml SU-8 resistir durante este paso).
   2. Girar la oblea a 500 rpm durante 10 seg para difundir la resisten sobre toda la oblea.
   3. Haga girar la oblea a 3250 rpm durante 30 segundos lo que resulta en un espesor resistir de aproximadamente 40 micras.
5. Una vez más, retire el exceso de resistir desde el borde de la oblea con un hisopo empapado de acetona y hornear suave la oblea en una placa caliente durante 180 segundos a 65 ° C y 360 segundos a 95 ° C.
6. Preparar la fotomáscara por sticking a un vidrio de sosa-cal. Vea la Figura 3 para el diseño de la máscara. Utilice un alineador de máscara para exponer la capa protectora con luz ultravioleta (160 mJ / cm ^2, medida a 365 nm) a través de la máscara preparada. Hornee la oblea expuesta de nuevo en un plato caliente durante 60 segundos a 65 ° C y 360 segundos a 95 ° C.
7. Después de enfriar la oblea a RT, sumergirlo en una placa de Petri de vidrio lleno de desarrollador durante 5 minutos para desarrollar la resisten. Agitar suavemente la placa de Petri para eliminar no expuesta SU-8. Enjuague la oblea con isopropanol y secarlo con una pistola de nitrógeno.
8. Examinar la oblea bajo un microscopio. En caso de no desarrollado resistir restos sobre las características, el desarrollo de la oblea de nuevo durante unos minutos, tal como se describe en el paso 1.7.
9. Retire cualquier disolvente residual cociendo las obleas durante 2 horas a 200 ° C. Compruebe la altura de las características con un perfilador paso. En caso de que la altura medida difiere de la altura deseada comenzar con este protocol de nuevo y adaptar la velocidad de centrifugado en el paso 1.1.4.
10. Para evitar que se pegue de los PDMS a la oblea silanizar colocándolo en un desecador junto con 50 l de 1 H, 1 H, 2 H, 2 H -perfluorodecyltrichlorosilane en un pequeño plato de porcelana. Reducir la presión en el desecador hasta 100 mbar y se incuba la oblea durante 12 horas.
    1. Para los PDMS en blanco partes silanizar otra oblea de silicio utilizando el método de la etapa 1.10. Para ahorrar tiempo silanizar ambas obleas al mismo tiempo en un solo desecador.

2. LADE chip Fabrication

NOTA: El chip LADE está hecho de dos PDMS piezas unidas entre sí mediante unión adhesiva ^24. La primera parte contiene las características de microfluidos. La otra parte es plana y se utiliza para sellar los canales. Unidas entre sí, forman la forma redonda necesaria para interconectar el chip con el sistema de transporte de las gotas. Aquí, la fabricación delas dos partes y su unión se describen a continuación. Todos los pasos del proceso se muestran en la Figura 4.

1. Prepare 44 g de PDMS mezclando 40 g de prepolímero con 4 g de los PDMS agente de curado (esto se traducirá en hasta 6 patatas fritas). Desgasificar la PDMS en un desecador hasta que esté libre de burbujas (tardará unos 20 minutos).
2. Moldeo Réplica de las mitades estructurados.
   1. Coloque el molde de fundición en la parte superior de la oblea y que encaje en su lugar con las estructuras de guía alrededor del diseño (ver Figura 5). Saltear el chasquido en su lugar para el reducir a la mitad PDMS plana.
   2. Verter aproximadamente 3 a 4 g de los PDMS desgasificado en forma de colada y colocarlo durante 6 minutos en una placa caliente a 150 ° C. Enfriar el PDMS curados en forma de colada y levante con cuidado el molde de fundición de obleas utilizando una espátula.
   3. Con el fin de evitar cualquier contaminación de los canales de microfluidos cubrir el lado del chip que estaba previamente en contacto with la oblea con cinta adhesiva. Cortar cuidadosamente la cinta a lo largo del borde de la parte PDMS para eliminar el exceso PDMS.
3. Para fabricar los PDMS mitades planas repiten el 2.2.1 etapas mencionadas anteriormente a 2.2.3 con la oblea silanizada en blanco.
4. Peel de la cinta y perforar orificios de conexión de fluido en las mitades estructuradas con un golpeador biopsia. Proteger las estructuras con cinta durante el almacenamiento.
5. Unir las partes de PDMS juntos mediante unión adhesiva utilizando los PDMS agente de ²⁴ curado.
   1. Tomar una oblea de silicio no tratado y girar cubrir con PDMS agente de curado durante 30 segundos a 6000 rpm. Tome el hojaldre del recubridora de rotación.
   2. Retire la cinta de las mitades estructurados y colocarlos con las estructuras orientadas hacia abajo sobre la oblea. Presione suavemente en la parte superior de los PDMS para eliminar las burbujas de aire.
   3. Retire la cinta de los PDMS mitades en blanco. Tome un halve estructurado a partir de la oblea y manualmente alinearlo en la parte superior de la halve PDMS plana. Apriete suavemente elParte se reúnen para eliminar las burbujas de aire y dejar que la cura de chip montado durante 24 horas a RT. No empuje las dos partes con fuerza ya que esto puede causar que los canales se colapsen.
6. Cortar la punta de la viruta a lo largo de la línea indicadora ortogonal al canal de la boquilla con un cuchillo para abrir la boquilla de salida. Utilice un dispositivo de alineación para asegurar un corte recto, que es necesaria para una inyección de líquido recta. Inspeccione el chip con un microscopio para detectar defectos en los canales de microfluidos y partículas de polvo. Ponga una cinta sobre los agujeros de entrada para proteger los chips durante el almacenamiento.
7. Conecte una botella Woulff con un tubo a una fuente de nitrógeno seco y para todas las entradas del chip LADE. Depósito 50 l de 1 H, 1 H, 2 H, 2 H -perfluorodecyltrichlorosilane en la parte inferior de la botella Woulff y cerrarla.
8. Silanizar los canales microfluídicos por todos los canales de lavado durante 20 minutos con la corriente de nitrógeno que lleva 1 H, 1 H , 2 H, 2 H -perfluorodecyltrichlorosilane a un caudal de aproximadamente 1 ml / seg. Los chips están listos para experimentos y se pueden almacenar durante al menos varias semanas a temperatura ambiente.

3. Preparación de Sistema de Medición / Gotita Transporte

NOTA: Construir todo el sistema de transporte de gotas en la parte superior de una mesa óptica, ya que es necesario construir una estructura de soporte estable para la configuración. Un esquema de todo el sistema de transporte de gotas se representa en la Figura 6.

1. Instalar un poli ciclónico personalizado (metacrilato de metilo) adaptador (PMMA) con un 50 cm adjuntos tubo de acero inoxidable vertical. Conecte el adaptador a una fuente de helio con un controlador de flujo másico. Adjunte una (alta velocidad) de la cámara y una lámpara para el adaptador en los sitios opuestos para la visualización de las gotas.
2. Coloque un calentador de cartucho en el medio del tubo de acero y el uso de poli (cloruro de vinilo) (PVC) tubo y un tubo Legrisconector para conectar el extremo del tubo de acero con la entrada de la desolvator membrana.
3. Conectar la salida de la desolvator con otro tubo de PVC a un adaptador de flujo laminar, que está conectado directamente a la entrada ICPMS. Conecte el adaptador de flujo laminar a una fuente de argón con un controlador de flujo de masa y después utilizarlo para mezclar argón para lograr una condición de operación estable.
4. Alinear el adaptador así como el tubo vertical de acero con un nivel de burbuja. Si la alineación no es correcta, puede conducir a pérdidas significativas de gotitas. Inserte un enchufe en el adaptador para evitar que los gases de escape durante el tiempo de calentamiento del sistema.
5. Iniciar flujos y los dispositivos que utilizan la configuración de la Tabla 1 de gases de todo antes mencionados. Deje que el sistema se caliente durante 15 minutos. El calentador de cartucho necesita 2 horas para estabilizar la temperatura, enciéndalo de antemano.
6. Coloca las bombas de jeringa en un estante a la altura del adaptador de helio ciclónica. Mantenga la distancia entre elbombas de jeringa y el adaptador lo más corto posible.

4. Mediciones

NOTA: El protocolo siguiente se escribe en términos generales debido a la variedad de soluciones y suspensiones que se puede utilizar. Sin embargo, las suspensiones celulares deben diluirse hasta una concentración de <1 x 10 ⁷ células / ml, cuando se realiza el análisis de células individuales, para asegurar que la mayoría de las gotas de llevar una sola célula. Para las mediciones con células de lugar las bombas de jeringa en un ángulo tal que la salida de las jeringas apuntar hacia abajo e instalar el tubo de tal manera que apuntan hacia abajo.

1. Conecte la tubería a las jeringas. Cargar dos 5 ml jeringas con perfluorohexano y una jeringa de 1 ml con una solución de muestra o suspensión. Quite todas las burbujas atrapadas en las jeringas y tubos.
2. Instale las jeringas en una bomba de jeringa y conectarlos a las entradas del chip. Inicie las bombas de jeringa utilizando la configuración de inicio deTabla 1 (o velocidades de flujo más altas). Dar a los flujos de 3 a 5 minutos para estabilizar.
   1. Eliminar el exceso de líquido de la punta del chip con un pañuelo de papel. Los líquidos deben ahora expulsar del chip en un chorro recto. Si una recta de expulsión no puede lograrse frotando con un tejido de cambiar el chip y empezar de nuevo con este paso.
3. Retire el tapón del adaptador e inserte con cuidado el chip en el adaptador. Lubrique el chip con el FC-40 si es necesario. Un chip se puede utilizar durante al menos 2 h de experimentos.
4. Cambie la velocidad de flujo para estar dentro de los parámetros de medición recomendados de la Tabla 1. Bajo caudal del PFH no sólo ahorra PFH sino que también reduce la señal de fondo, causada por las interferencias isobáricas.
5. Dar el sistema de 2-5 min para estabilizar (dependiendo de las velocidades de flujo escogidos). Optimizar los ICPMS para la intensidad de señal más alta de los analitos de interés.
   1. Sucesivamente ajustar los flujos de todo el gases sobre los controladores de flujo de masa (ver los rangos recomendados de la Tabla 1) hasta que la intensidad máxima de la señal de los analitos de interés se consigue. Tune la potencia de plasma y las tensiones de lente de enfoque (de acuerdo a los rangos recomendados por el fabricante) en las ICPMS de la misma manera.
6. Ajuste los ICPMS a un tiempo de permanencia de 10 mseg (aplicada por las mismas ICPMS utilizados pero se puede ajustar con otros instrumentos para asegurar una adquisición resuelta en el tiempo). Comience a grabar la señal de un particular, m / z utilizando el protocolo del fabricante.
7. Después de la medición, la transferencia de los datos en bruto a programa de análisis de datos para la evaluación. Bin los datos, que figuran en cuentas por 10 ms, con un built-in-función, y la trama resultante valores de centros bin contra los cargos. Colocar cada pico en el histograma de distribución de frecuencia de trazado con una función de Gauss. La media y sigma del ajuste representan la intensidad de la señal media y su desviación estándar, respectivamente.

5. Concepto de calibración

1. Mida una solución simple o estándar de múltiples elementos que contiene el elemento o elementos de interés en los mismos caudales como la muestra.
2. Coloque un chip LADE en una placa de Petri en un microscopio. Para una mejor calidad de imagen utilizar un chip no redonda. Fabrique este chip como se describe en el paso 2, pero utilizando un molde de fundición simple rectangular en lugar de la parte en forma de ronda.
3. Siga los pasos 4.1 a 4.2.1 para iniciar la generación de gotas. Establecer los caudales de los caudales utilizados en el paso 5.1.
4. Graba imágenes de las gotas acuosas con una cámara de alta velocidad conectado a un microscopio (objetivo 20X). Utilice un software de análisis de imagen como la morfometría de la gotita y software velocimetría por Basu ²⁵ para obtener el diámetro medio de gota de las grabaciones.
5. Utilice diámetro medio de gota para calcular el volumen de la gotita, suponiendo que la gotita es un objeto esférico.
   1. De este volumen y el knpropia concentración de un analito en la gota de calcular el número de átomos correspondientes. Divida el número de iones medidos por gotita por el número de átomos de obtener la eficiencia de detección. Utilice esta eficiencia de detección para calcular el número de átomos en una muestra desconocida.
      Nota: Puesto que las variaciones entre chips individuales son pequeñas ^22, no es necesario repetir la medición del tamaño de gota para cada chip o solución si las velocidades de flujo siguen siendo los mismos. Una lista de los tamaños de gota y frecuencias de acuerdo con los caudales específicos es publicado por Verboket et al. ^22.

Results

El sistema presentado se puede emplear para medir pequeños volúmenes de soluciones o suspensiones que contienen células o nanopartículas. Ejemplos de una medición de una solución estándar y caracterización de células individuales se muestran aquí. Más ejemplos se pueden encontrar en Verboket et al. ^22.

Normalmente la señal de una sola gota de una solución es un evento muy corto. Por lo general tiene una duración de unos 100 microsegundos ^26. Con los ICPMS utili...

Discussion

Aunque la fabricación de los chips es muy fiable, hay algunos puntos críticos durante la fabricación que requieren una atención especial. En primer lugar, la limpieza durante el montaje es muy importante para evitar la contaminación del chip por el polvo. El polvo puede bloquear los canales y evitar una generación de gotas estable. En segundo lugar, es especialmente importante que la punta se corta ortogonal al canal de la boquilla. El ángulo del corte influye fuertemente en el ángulo de eyección. Si el líquido se expul...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oblea de silicio 100 mm	Si-Mat (Kaufering, Alemania)
SU-8 2002	Microchem Corp. (Massachusetts, EE. UU.)
SU-8 2050	Microchem Corp. (Massachusetts, EE. UU.)
Acetona	Merk VWR (Darmstadt, Alemania)	100014
Desarrollador de RM 600	Microresist Technology GmbH (Berlín, Alemania)
Isopropanol	Merk VWR (Darmstadt, Alemania)	109634
1H,1H,2HH-perfluorodecililtriclorosilano	ABCR-Chemicals (Karlsruhe, Alemania)	AB111155
Sylgard 184 kit de elastómero de silicona (PDMS)	Dow Corning (Michigan, EE. UU.)	39100000
Perfluorohexano 99%	Sigma-Aldrich (Missouri, EE. UU.)
FC-40	ABCR-Chemicals (Karlsruhe, Alemania)	AB103511
Solución salina tamponada con fosfato	Life Technologies (Paisley, Reino Unido)	10010-015
Glóbulos rojos en solución salina tamponada con fosfato	Rockland Immunochemicals Inc. (Pensilvania, EE. UU.)	R400-0100
Soluciones estándar de un solo elemento Na, Fe	Inorganic Ventures (Virginia, EE. UU.)
Solución estándar multielemento	Merck Millipore (Massachusetts, EE.UU.)	IV
Ácido nítrico	subhervida
	Merck Millipore (Massachusetts, EE. UU.)
Placa calefactora HP 160 III BM	Sawatec (Sax, Suiza)		utilizada para la preparación
de obleas Módulos de centrifugado SM 180 BM	Sawatec (Sax, Suiza)		utilizada para la preparación de obleas
Fotomáscara de película de alta resolución	Microlitho (Essex, Reino Unido)
Perfilador de pasos Dektak XT advanced	Bruker  (Massachusetts, EE.UU.)
Placa calefactora MR 3002	Heidolph (Schwabach, Alemania)		utilizada para el moldeo de réplicas
Punzonadora de biopsia de 1,5 mm	Miltex (Pensilvania, EE.UU.)	33-31AA/33-31A
Recubridor giratorio  WS-400 BZ-6NPP/LITE	Laurell (Pensilvania, EE.UU.)		utilizado para la unión adhesiva
Bomba de jeringa neMESYS	Cetoni (Korbussen, Alemania)
Jeringa de 1 ml	Codan (Lensahn, Alemania)	62.1002
Jeringa de 5 ml	B. Braun (Melsungen, Alemania)	4606051V
Tubo de PTFE	PKM SA (Lyss, Suiza)	PTFE-AWG-TFT20. ICPMS
ELAN6000	PerkinElmer (Massachusetts, EE. UU.)
Desolvator de membranas CETAC6000AT+	CETAC Technologies (Nebraska, EE. UU.)		solo se utiliza la unidad desolvator
Cámara de alta velocidad Miro M110	Vision Research (Nueva Jersey, EE. UU.)
Programa de análisis de datos Origin pro	OriginLab Corp. (Massachusetts, EE. UU.)	versión 8.6
Microscopio	Olympus (Tokio, Japón)	IX71