Se describe un módulo de laboratorio factible para estudiantes de biología que explora conceptos celulares y moleculares avanzados utilizando el cultivo de células animales. Los estudiantes cultivan, caracterizan y manipulan un modelo de células de cáncer de mama mediante la exposición a agentes de quimioterapia. La viabilidad celular se analiza mediante el recuento de células utilizando un método estándar y novedoso.
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Artículo de método
El uso de células tumorales mamarias de ratón para enseñar conceptos básicos de biología: Un módulo de laboratorio simple
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Resumen
Resumen
Los estudiantes de biología de pregrado deben aprender, comprender y aplicar una variedad de conceptos y técnicas de biología celular y molecular en preparación para programas biomédicos, de posgrado y profesionales o carreras en ciencias. Para abordar esto, se ideó un módulo de laboratorio simple para enseñar los conceptos de división celular, comunicación celular y cáncer a través de la aplicación de técnicas de cultivo de células animales. En este caso, la línea celular de tumor mamario de ratón (MMT) se utiliza para modelar el cáncer de mama. Los estudiantes aprenden a cultivar y caracterizar estas células animales en cultivo y a probar los efectos de los agentes de quimioterapia tradicionales y no tradicionales en la proliferación celular. Específicamente, los estudiantes determinan la concentración celular óptima para la siembra y el crecimiento de células, aprenden a preparar y diluir soluciones de medicamentos, identifican la mejor dosis y el curso del tiempo de tratamiento de los agentes antiproliferativos y determinan la tasa de muerte celular en respuesta a varios tratamientos. El módulo emplea una técnica estándar de recuento de células utilizando un hemocitómetro y un nuevo método de recuento de células utilizando software de microscopía. El procedimiento experimental se presta a la indagación abierta, ya que los estudiantes pueden modificar los pasos críticos del protocolo, incluidas las pruebas de agentes homeopáticos y medicamentos de venta libre. En resumen, este módulo de laboratorio requiere que los estudiantes utilicen el proceso científico para aplicar su conocimiento del ciclo celular, las vías de señalización celular, el cáncer y los modos de tratamiento, todo mientras desarrollan una variedad de habilidades de laboratorio que incluyen el cultivo celular y el análisis de datos experimentales que no se enseñan rutinariamente en el aula de pregrado.
Introducción
A menudo, en los cursos de biología general de pregrado, los temas de regulación del ciclo celular y el cáncer se tocan pero no exploradas en detalle porque la amplitud de contenidos en estos cursos deja poco tiempo para la profundidad. Además, los estudiantes de pregrado de biología no están normalmente expuestos a las técnicas avanzadas asociadas con cultivo de células animales. Para ayudar a los estudiantes a desarrollar una comprensión más profunda de estos conceptos, mientras que la aplicación y el análisis de lo que han aprendido, una actividad de laboratorio se desarrolló como una modificación del Instituto Walter Reed del Ejército de Investigación (WRAIR) extendió la actividad de laboratorio 1. El módulo de laboratorio utiliza una estrategia experimental paso a paso que incluye el cultivo y la caracterización de un modelo de células de cáncer, desarrollo y ejecución de los métodos de recuento de células, estableciendo curso temporal óptimo y las dosis para el tratamiento de las células con agentes anti-proliferativos, y la identificación de vías de señalización celular aberrantes . El experimento también permite abiertoconsulta -ended.
La mayor parte de las técnicas necesarias para esta actividad puede llevarse a cabo en un laboratorio típico biología-enseñanza. La actividad se inicia con los estudiantes que caracterizan la tasa de la morfología y el crecimiento del tumor mamario de ratón (MMT) línea celular, un modelo de cáncer de mama humano 2. El cáncer de mama fue elegido como el cáncer de modelo debido a su prevalencia en la población, su familiaridad con los estudiantes en edad universitaria, y los datos difundidos disponibles. La línea de células MMT fue seleccionado específicamente porque es fácil de obtener, bien caracterizado, tiene un tiempo de duplicación de corto y es fácil de cultivar. Además, las células MMT son dependiente de estrógenos que es consistente con la mayoría de los cánceres de mama femenino. Luego, los estudiantes identifican vías de señalización celular aberrante en las células MMT tratando las células con medicamentos de quimioterapia cuyo mecanismo de acción es así established.The concentración de los fármacos y la duración de los tratamientos son variados permitiendo a los estudiantespara evaluar el efecto de estas variables en la tasa de división celular. El ensayo clave para esta actividad es la determinación de la viabilidad celular, que requiere simplemente el recuento de células, utilizando uno de dos métodos. Cada método depende de fuertes habilidades de microscopía. Los estudiantes determinan la viabilidad celular mediante el uso de un estándar, el método hemocitómetro y un método fotomicroscopía novedosa y proponen. Con base en sus hallazgos, pueden proponer y probar modificaciones a la actividad. Luego, los estudiantes representan a sus datos e interpretar los resultados para refinar su hipótesis y diseñar nuevas estrategias experimentales.
Esta actividad de laboratorio es adecuado para estudiantes de primer año o segundo nivel de estudiantes que se especializan en las ciencias biológicas. Se condensa en un módulo de laboratorio de una semana de duración que se puede completar en un primer año, biología general o segundo año, celular / molecular curso de biología. Habilidades necesarias para la correcta ejecución de la actividad incluyen la aritmética básica y el álgebra, la familiaridad con una variedad de ctécnicas de laboratorio de mineral (por ejemplo, pipeteo, la toma de solución, técnica estéril), análisis de datos, la gestión básica microscopía de luz y el tiempo, junto con el conocimiento del instructor de cultivo celular y el software de hoja de cálculo. Los reactivos necesarios incluyen un modelo de línea celular animal para el cáncer (por ejemplo, células mamarias de ratón tumorales, MMT 2), agentes de quimioterapia (por ejemplo, el tamoxifeno, la curcumina, la metformina, y la aspirina), tripano medios de cultivo azul y celular (por ejemplo, medio esencial mínimo de Eagle ; EMEM) con los suplementos apropiados (por ejemplo, caballo donante y suero fetal bovino). Instrumentos necesarios incluyen un microscopio invertido de luz con apego cámara digital, ordenador, 100 mm y 24 placas de cultivo de tejidos así, incubadora de CO 2 (o equivalente), gabinete de bioseguridad (BSC; Clase II), hemocitómetro, y el software de la microscopía digital.
Hay buenos ejemplos de actividades de laboratorio específicas que se basan en cultivo de células animales a TEACestudiantes de pregrado h sobre conceptos de la biología celular 3. Sin embargo muchos de ellos requieren suministros o técnicas que no son de fácil acceso (por ejemplo, isótopos radiactivos, tejido animal vivo, equipos de imagen avanzada 1,4,5), describen los protocolos que están bastante avanzados (por ejemplo, adecuado para un curso de nivel 400 6), o requerir varias semanas o semestre proyectos largos 6,7. La actividad de laboratorio descrito aquí es sencillo y puede llevarse a cabo en una sola semana con equipo de laboratorio común.
En resumen, este módulo de laboratorio introduce o refuerza los conceptos de ciclo celular, vías de señalización celular y el cáncer, mientras que la enseñanza de habilidades de laboratorio básicos y avanzados, análisis de datos experimentales, el método de cultivo de células animales y el proceso científico eficaz. El módulo de laboratorio es simple y económicamente accesible y proporciona la flexibilidad y la oportunidad para la investigación abierta. La actividad fomenta la creatividad del estudianteproporcionando una estrategia experimental plantilla que actúa como una guía, pero no una receta. Lo más importante, los satisface actividad todos los dominios de aprendizaje de Blooms Taxonomía 8, ya que requiere recordar, comprender, aplicar, analizar, evaluar y crear mediante la participación de los estudiantes en un proceso que los saca del libro de texto y en el mundo de la investigación científica.
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Protocolo
Notas: Realice todo el trabajo con células y reactivos de cultivo celular en un gabinete de bioseguridad (BSC) de Clase II)9. Las células MMT se clasifican como nivel de bioseguridad I, ya que presentan un riesgo biológico de bajo a moderado. Aplique procedimientos adecuados de limpieza y descontaminación al BSC entre usos (por ejemplo, luz ultravioleta, limpieza con etanol al 70%).
1. Cultivar células MMT
- Cultive células en placas de cultivo de tejidos de 10 cm que contengan 10 ml de medios ricos en nutrientes que consistan en medio esencial mínimo de águilas (EMEM) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de glutamina y un 1% de antimicótico/antibiótico (10 unidades de penicilina, 100 μg de estreptomicina, 0,25 μg de anfotericina B). Cultive las células en una cámara humidificada con CO2 al 5%, a 37 °C. Coloque las células en placas a una densidad de 3,6 x 106 células/cm2 (consulte Recuento de células en el paso 2).
- Reemplace la mitad de los medios de cultivo celular con medios nuevos cada 48 horas, a menos que se indique lo contrario. Compruebe la viabilidad y la morfología de las células mediante un examen con un microscopio óptico de contraste de fase invertida.
- Anote y caracterice el tamaño, la estructura, la forma, la organización y el número estimado de las celdas con un aumento de 100 a 200X. A esta densidad, las células deben aparecer en un plano, no agrupadas unas sobre otras y muy próximas. Cada célula consta de un núcleo grueso y esférico con extensiones delgadas, largas y en forma de rama que se expanden desde él y llegan a un punto (ver Figura 1).
- Subdividir las células cuando alcanzan una densidad de células de 7,2 x 106 células/cm2. Las células presentan una tasa de duplicación de 1,8 x 106 células/cm2 cada 24 horas. Designe las celdas Pasaje X (Px) para denotar el número de veces que se han dividido.
- En la generación 3 (es decir, después de tres pasos, P3), recoje, cuente y coloque las células en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos a una densidad de 3,6 x 106 células/cm2.
- Vea las células todos los días y registre fotomicrografías digitales. Observe y describa la morfología de la célula (es decir, tamaño, forma, propiedades reflectantes de la luz). Determine el tiempo de duplicación de celdas contando las celdas regularmente y relacionando el tiempo transcurrido con el número de celdas.
2. Contar células MMT
Nota: Cuente las células para determinar si las células necesitan ser subcultivadas, para prepararse para un experimento o para determinar la viabilidad de la célula. Aquí se presentan dos métodos.
- Uso de un hemocitómetro, una técnica estándar para contar células.
- Obtenga un hemocitómetro de línea brillante, una solución al 0,2% de colorante azul de tripán, un microscopio óptico compuesto, tubos de ensayo estériles, pipetas y un contador manual de células.
- Bajo el BSC, use una pipeta de 10 ml para extraer células de una placa de cultivo de tejidos de 10 cm. Si las células se cultivan en una placa de 24 pocillos, utilice una pipeta de 1 ml o una micropipeta de 1.000 μl para eliminar el medio.
- Introduzca el medio celular en la pipeta, coloque la punta de la pipeta contra el fondo de la placa y expulse el medio mientras desliza la punta de la pipeta por la placa. Repita de 4 a 5 veces para ayudar a desalojar las células, disociar los grupos y obtener un recuento de células más preciso.
- Coloque la suspensión celular resultante en un tubo estéril de 15 ml (o una microcentrífuga de 1 ml u otro tubo de pequeño volumen). De lo contrario, deje las células en la placa/pocillo original de cultivo de tejidos.
- Bajo el BSC, combine 10 μl de la suspensión celular con 10 μl de la solución de azul de tripano (proporción 1:1) en una microcentrífuga no estéril u otro tubo de pequeño volumen.
Nota: El azul de tripán es una mancha vital que no es absorbida por las células viables sanas. Cuando las células están dañadas o muertas, el azul de tripán puede entrar en la célula permitiendo contar las células muertas (también conocido como método de exclusión de colorantes). Por lo tanto, bajo un microscopio, las células muertas aparecen de color púrpura oscuro, mientras que las células viables son de color brillante y claro. - Incubar en RT durante 5 min.
- Coloque el cubreobjetos en el hemocitómetro. Aplique 10 μl de la mezcla de suspensión de celdas azules de tripano en la ranura. Vea el hemocitómetro con un aumento de 100 a 200X. Es evidente una cuadrícula de cuatro esquinas (ver Figura 2).
- Cuente el número de células viables (sin teñir) en comparación con el total de células en cada área cuadriculada. Promedie las cuatro cuadrículas y multiplíquelas por 1 x 104 para obtener celdas/ml.
- Extrapola el número total de células por plato (o células/cm2). Utilice este número para determinar el volumen correcto de la suspensión celular que se utilizará para sembrar una nueva placa de cultivo de tejidos a la densidad deseada de 3,6 x 106 células/cm2 o determine el número total de células viables en la placa o en el pocillo><. Nota: Para obtener orientación adicional sobre el uso de un hemocitómetro, consulte10.
- Utilice un software y una cámara digital para contar las células viables.
- Obtenga una cámara digital, el software que la acompaña, una solución al 0,4% de tinte azul de tripán, un microscopio óptico compuesto, tubos de ensayo estériles, pipetas y una computadora.
Nota: Aquí se emplea una cámara digital Moticam 2.000 con el software Motic que la acompaña. Cualquier cámara y software comparables deberían ser suficientes. Asegúrese de que el software de la cámara digital se haya calibrado de antemano (de acuerdo con el protocolo del fabricante). - Bajo el BSC, use una pipeta de 1 ml o una micropipeta de 1,000 μl para eliminar el medio de las células MMT que crecen en una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos. Lave las células adherentes aplicando suavemente una pequeña cantidad (aproximadamente 500 μl) de medios frescos no suplementados (es decir, EMEM sin ningún suplemento) a la placa y luego retírelos. Aplique 10 μl de azul de tripano al 0,2% (elaborado diluyendo 1:1 con EMEM no suplementado) directamente sobre el pocillo.
- Incubar la placa a RT durante 5 min.
- Observe la placa bajo el microscopio con un aumento de 100 a 200X con una cámara digital conectada. La placa se puede lavar con medios no suplementados si la tinción con azul de tripán al 2% es demasiado oscura.
- Abra el software en la computadora y verifique que el software esté calibrado para el objetivo utilizado a través de la pestaña de configuración. Debería aparecer una imagen del campo de visión.
- Seleccione la cuadrícula en la pestaña Medir. Aparecerá una cuadrícula de cuadrados de aproximadamente 0,005 cm de ancho. Seleccione Información de cuadrícula para confirmar el área de cada cuadrado.
- Elija un área específica de la cuadrícula para contar las celdas (es decir, 5 cuadrados x 9 cuadrados). Seleccione Rectángulo en la pestaña Medir. Haga clic en la esquina de un cuadrado y arrastre el cursor para abarcar los cuadrados de su elección.
Nota: Un tono de verde cubrirá los cuadrados elegidos y aparecerá un cuadro blanco en la esquina que proporciona el ancho, la altura, el área y el perímetro de la sección de la cuadrícula elegida (consulte la Figura 3). - Cuente el número de células viables dentro del área determinada. Haga lo mismo para otros dos lugares en el mismo pocillo o placa moviendo la placa bajo el microscopio.
- Asegúrese de que el área medida sea la misma y que el aumento no haya cambiado. Calcule el número promedio de células viables dentro del área. Usando el área del pocillo (para una placa de 24 pocillos, un pocillo tiene un área de 2 cm2, para un plato de 100 mM el área es de 78,6 cm2), extrapola el número de celdas viables del área delineada en la cuadrícula al número total de celdas dentro del pocillo (celdas/cm2).
- Obtenga una cámara digital, el software que la acompaña, una solución al 0,4% de tinte azul de tripán, un microscopio óptico compuesto, tubos de ensayo estériles, pipetas y una computadora.
3. Tratar las células MMT con agentes antiproliferativos
- Preparar soluciones de los agentes terapéuticos antiproliferativos seleccionados (tamoxifeno, curcumina y metformina) y el fármaco opcional, aspirina bajo el BSC.
- Disuelva la curcumina y el tamoxifeno en etanol al 100% para generar una concentración de caldo de 27 mM. Disuelva la metformina y la aspirina en EMEM no suplementado para generar una concentración de stock de 500 mM y 15 mM, respectivamente.
- Establecer una respuesta a la dosis.
- Trate las células MMT con los tres agentes terapéuticos antiproliferativos (tamoxifeno, curcumina y metformina) y el fármaco opcional (aspirina) a concentraciones variables durante 96 horas para generar una curva de respuesta a la dosis. Administrar inicialmente todos los fármacos en un rango de concentraciones basado en los informes publicados1,11-16 y luego en concentraciones mayores o menores que las publicadas.
Nota: Una dosis-respuesta determina la concentración mínima de un fármaco necesaria para producir los resultados deseados. En este caso, el resultado deseado es una reducción de la proliferación celular en comparación con el control.- Para el tamoxifeno y la curcumina, utilice concentraciones (y volúmenes correspondientes) de 0,054 mM (1 μl), 0,108 mM (2 μl), 0,162 mM (3 μl) y 0,216 mM (4 μl).
- Para la metformina, utilice concentraciones (y volúmenes correspondientes) de 2 mM (2 μl), 4 mM (4 μl), 6 mM (6 μl), 8 mM (8 μl) y 10 mM (10 μl).
- Para la aspirina, use concentraciones (y volúmenes correspondientes) de 0,030 mM (1 μl), 0,060 mM (2 μl), 0,099 mM (3,3 μl), 0,150 mM (5 μl) y 0,216 mM (6,7 μl).
- Divida las células MMT de la placa de 10 cm en una placa de 24 pocillos a una concentración de 3,6 x 106 células/cm2. Determine la concentración inicial de células mediante ambos métodos de recuento de células (Paso 2). Llame a esta nueva placa de celdas de 24 pocillos "Day Split".
- 24 horas después de la siembra celular, trate las células MMT con cada uno de los agentes terapéuticos antiproliferativos, tamoxifeno, curcumina, metformina y aspirina, en las concentraciones descritas en el paso 3.2.1. Refiérase a esto como "Día 0".
- Dado que cada pocillo puede contener un máximo de 500 μl de medio, utilice micropipetas con puntas de micropipeta estériles y una nueva punta cada vez que se trate un nuevo pocillo para evitar la contaminación cruzada. Utilice dos pocillos como controles: células cultivadas en ausencia de cualquier tratamiento farmacológico (control negativo) y células cultivadas en presencia de etanol al 100% (control con disolventes).
- Cultive células y vuelva a administrar medicamentos en las concentraciones descritas cuando las células se alimentan cada dos días (ver Paso 1.2) durante 96 horas (hasta el día 4). En los días 1 a 4 de tratamiento, observe las células bajo el microscopio y cuente utilizando el método del paso 2.2 (véase la figura 4).
- Repite el experimento al menos tres veces.
- Determine la concentración óptima de cada fármaco graficando la relación entre la viabilidad celular y la dosis del fármaco a lo largo del experimento (véase la figura 5).
- Trate las células MMT con los tres agentes terapéuticos antiproliferativos (tamoxifeno, curcumina y metformina) y el fármaco opcional (aspirina) a concentraciones variables durante 96 horas para generar una curva de respuesta a la dosis. Administrar inicialmente todos los fármacos en un rango de concentraciones basado en los informes publicados1,11-16 y luego en concentraciones mayores o menores que las publicadas.
- Establece un curso de tiempo.
- Tratar las células MMT con los tres agentes terapéuticos antiproliferativos (tamoxifeno, curcumina y metformina) a una concentración fija durante períodos de tiempo variables. Utilice la concentración óptima identificada a través de los experimentos de Dosis-Respuesta (ver Paso 3.2).
- Utilice las siguientes concentraciones: 0,216 mM de tamoxifeno, 0,216 mM de curcumina y 10 mM de metformina.
Nota: Un curso de tiempo determina la cantidad de tiempo necesario para que un medicamento produzca el resultado óptimo deseado. En este caso, el resultado deseado es una reducción de la proliferación celular en comparación con el control.
- Utilice las siguientes concentraciones: 0,216 mM de tamoxifeno, 0,216 mM de curcumina y 10 mM de metformina.
- Divida las células MMT de la placa de 10 cm en una placa de 24 pocillos a una concentración de 3,6 x 106 células/cm2. Determine la concentración inicial de células mediante ambos métodos de recuento de células (Paso 2). Llame a esta nueva placa de celdas de 24 pocillos "Day Split".
- 24 horas después de la siembra celular, trate las células MMT con cada uno de los agentes terapéuticos antiproliferativos, tamoxifeno, curcumina, metformina y aspirina, a las concentraciones óptimas identificadas en el paso 3.2. Refiérase a esto como "Día 0".
- Dado que cada pocillo puede contener un máximo de 500 μl de medio, utilice micropipetas con puntas de micropipeta estériles y una nueva punta cada vez que se trate un nuevo pocillo para evitar la contaminación cruzada.
- Utilice dos pocillos como controles: células cultivadas en ausencia de cualquier tratamiento farmacológico (control negativo) y células cultivadas en presencia de etanol al 100% (control con disolventes).
- Tratar las células MMT con los tres agentes terapéuticos antiproliferativos (tamoxifeno, curcumina y metformina) a una concentración fija durante períodos de tiempo variables. Utilice la concentración óptima identificada a través de los experimentos de Dosis-Respuesta (ver Paso 3.2).
- Cultive células y vuelva a administrar los fármacos en la concentración seleccionada cuando las células se alimenten cada dos días (ver Paso 1.2) durante 96 horas (hasta el día 4). En los días 1 a 4 de tratamiento, observe las células bajo el microscopio y cuente utilizando el método del paso 2.2 (véase la figura 4).
- Repite el experimento al menos tres veces.
- Determinar el tiempo óptimo de exposición de las células MMT a cada fármaco graficando la relación entre la viabilidad celular y la duración (tiempo) del tratamiento farmacológico a la concentración seleccionada (véase la Figura 6).
4. El Módulo de Laboratorio
Nota: El siguiente es un horario de laboratorio de 5 días para el módulo de laboratorio. La Figura 7 es un diagrama de flujo de lo que implicaría el cronograma dentro de los 5 días. Para que esta actividad se complete en cinco días, se genera un curso de tiempo o una curva de respuesta a la dosis. No hay tiempo suficiente para generar ambas curvas. A continuación se describe un experimento de dosis-respuesta. Un experimento de curso de tiempo se puede intercambiar fácilmente
- Divida la clase en grupos: haga que un grupo establezca una dosis-respuesta y el otro un curso de tiempo eligiendo una concentración en el medio de las concentraciones de dosis-respuesta propuestas.
- Mantener suficientes cultivos y reservas de drogas en concentraciones apropiadas. A menos que se indique lo contrario, realice todo el trabajo bajo el BSC.
- Día 1
- Indique a los estudiantes que hagan medios y cultiven células (como en el paso 1).
- A medida que los estudiantes obtengan un stock de células MMT en una placa de 10 cm, indique a los estudiantes que preparen los medios de cultivo celular y dé un tutorial sobre el uso del hemocitómetro, la microscopía digital y el software de microscopía con cámara digital (como en el paso 2).
- Calibre el software a los objetivos utilizados en el microscopio (por ejemplo, 4X, 10X, 20X) ahora utilizando el protocolo del fabricante.
- Día 2
- Pida a los alumnos que confirmen el número total de células y la viabilidad de las células (como en el paso 2).
- Pida a los estudiantes que cuenten las células en el plato de 100 mm utilizando el software de microscopía y los métodos del hemocitómetro, para confirmar que se obtienen resultados similares.
- Indique a los estudiantes que obtengan una placa de 24 pocillos y divida las celdas de la placa de 100 mm a las placas de 24 pocillos hasta la densidad de recubrimiento de celdas inicial deseada (como en el paso 1). Esto se considera Day Split. Coloque la placa de 24 pocillos en una incubadora de cultivo celular durante 24 horas.
- Día 3
- Cultive células MMT durante 24 horas en una placa de 24 pocillos. Pida a los estudiantes que observen las células bajo el microscopio y las cuenten usando un software de microscopía (como en el paso 2).
- Entregue al estudiante o al equipo muestras de existencias de medicamentos para el tratamiento del cáncer. Pídales que preparen y diluyan la solución madre original (como en el paso 3). Agregue las diversas concentraciones de los medicamentos a sus células para establecer una curva de respuesta a la dosis. A esto se le llama Día 0.
- Incubar las células (paso 1.2) con los fármacos durante un máximo de 48 horas.
- Día 4
- Pida a los estudiantes que observen las células tratadas después de 24 horas. Este es el Día 1.
- Cuente cada pocillo con un software de microscopía. Registre fotografías de cada pocillo para que el conteo se pueda realizar fuera del laboratorio (como en el paso 2).
- Incubar las células (paso 1.2) con los fármacos durante otras 24 horas
Nota: El instructor proporciona tutoriales adicionales y revisiones de análisis de datos y presentación gráfica. Los estudiantes aprenden a crear figuras, gráficos y análisis estadísticos para el día siguiente de la recopilación de datos.
- Día 5
- Hacer que los estudiantes traten las células después de 48 horas, Día 2.
- Cuente cada pocillo con un software de microscopía. Registre fotografías de cada pocillo para que el conteo se pueda realizar fuera del laboratorio (como en el paso 2).
- Recolectar y recolectar células para el conteo por el método tradicional del hemocitómetro como un medio para verificar la capacidad del estudiante para usar efectivamente el método del software de microscopía (como en el paso 2).
Nota: Recopile datos y saque conclusiones o revise hipótesis, según corresponda.
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Resultados
Cultivo de células MMT y comparación de métodos de conteo.
Las células de tumor mamario de ratón se cultivaron y caracterizaron con éxito (Figura 1) y se desarrolló un nuevo método de conteo celular utilizando el software Motic, un programa informático asociado a una cámara digital para microscopio. Este nuevo método de conteo celular se comparó con un método tradicional que emplea un hemocitómetro (Figura 2) y demostró ser igualmente preciso para det...
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Discusión
Se presenta un módulo de laboratorio que tiene como objetivo enseñar una variedad de temas en biología celular a través de las técnicas avanzadas de cultivo de células animales. El módulo logra esto mediante el análisis de los efectos de una serie de sustancias químicas antiproliferativas en la replicación de las células que modelan el cáncer de mama humano. El ensayo primario se basa en la técnica fundamental del recuento de células e introduce una forma novedosa de contar células utilizando software de microscopía. Las...
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Divulgaciones
Los autores no recibieron apoyo financiero o comparable de Motic.
Agradecimientos
Este trabajo cuenta con el apoyo de la Fundación Joseph Alexander, el Premio de Investigación de Pregrado de la ASBMB, 2013-2014, y una Beca del Premio de Ciencias, Marymount Manhattan College, 2012-2013.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Campana de cultivo de tejidos ESCO | Labculture Reliant | Clase II Tipo A2 Cabina de seguridad biológica | |
| Waterjactor CO2 Incubadora | CEDCO | Modelo 1510 | |
| Hemocitómetro de línea brillante | American Optical | con dos rejillas separadas | |
| Motic Images Plus | Mac OSX Versión 2.0 o superior | ||
| Gilson Pipetman | Rainin instrument co. inc | P-20D, P-200D, P-1000D | |
| CK30/CK40 Microscopio | de cultivo Microscopio de luz invertida de objetivo | Olympus | |
| 200 μ l Puntas de pipeta | MidSci | 40200C | |
| 1,000 μ l Puntas de pipeta | MidSci | AVR4 | |
| 10 ml Pipetas Seriológicas | TPP | TP94010 | |
| placas de 24 pocillos | CoStar- Tissue Culture Cluster | 3524 | 24 pocillos, 16 mm de diámetro de pocillo, esterilizados por radiación |
| Solución de azul de tripano 0,4% | Sigma | T8154 | 100 ml, cultivo celular probado sin haz |
| . | |||
| Células de tumor mamario de ratón (MMT) | ATCC | CCL-51 | |
| Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | 500 ml |
| Suero Fetal Bovino | Sigma | F0926 | 500 ml |
| Clorhidrato de Metformina | Sigma | PHR1084 | 500 mg |
| Tamoxifeno | Sigma | T5648 | polvo blanco o blanco-amarillo |
| Curmumin | Sigma | C1386 | polvo amarillo-naranja |
| Aspirina | Sigma | A2093 | cumple con las especificaciones de prueba de la USP |
Referencias
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