La inmunohistoquímica y Etiquetado múltiple con anticuerpos de la misma especie anfitrión para adultos estudio del hipocampo neurogénesis

Resumen

Este artículo de video ilustra un protocolo completo para detectar y cuantificar todas las etapas de la neurogénesis del hipocampo adulto dentro de la misma sección de tejido. Elaboramos un método para superar las limitaciones de la inmunofluorescencia múltiple indirecta que surgen cuando no se dispone de anticuerpos adecuados de diferentes especies de huéspedes.

Resumen

Neurogénesis adulta es un proceso multi-etapa altamente regulado en el que las nuevas neuronas se generan a partir de una célula madre neural activado a través de cada vez más comprometida subtipos progenitoras intermedias. Cada uno de estos subtipos expresa un conjunto de marcadores moleculares específicos que, junto con los criterios morfológicos específicos, pueden ser utilizados para su identificación. Por lo general, las técnicas de inmunofluorescencia se aplican implica anticuerpos específicos de subtipo en combinación con marcadores de proliferación exo o endógenos. Nosotros describimos en la presente memoria métodos para la detección y cuantificación de todas las etapas de neurogénesis en el hipocampo adulto immunolabeling. Estos comprenden la aplicación de los análogos de timidina, perfusión transcardial, procesamiento de tejido, de recuperación de epítopo inducida por calor, ABC de inmunohistoquímica, inmunofluorescencia indirecta múltiple, microscopía confocal y cuantificación de células. Además se presenta un protocolo de inmunofluorescencia secuencial múltiple que evita problemas usually que surge de la necesidad de la utilización de anticuerpos primarios planteados en la misma especie hospedadora. Se permite una identificación precisa de todos los subtipos progenitoras del hipocampo, junto con un marcador de proliferación dentro de una sola sección. Estas técnicas son una poderosa herramienta para estudiar la regulación de los diferentes subtipos progenitoras en paralelo, su implicación en patologías cerebrales y su papel en las funciones específicas del cerebro.

Introducción

Dos regiones del cerebro generar nuevas neuronas constitutivamente largo de la vida, la zona subventricular de los ventrículos laterales y la zona subgranular (SGZ) del giro dentado del hipocampo (DG). Las neuronas recién nacidas se derivan de las células progenitoras neurales y pasan por diferentes etapas de desarrollo morfológico y fisiológico antes de alcanzar la madurez ^1,2. Desde un dividiendo lentamente-glía radial como células madre (tipo 1) etapas consecutivas de tránsito amplificar surgen células progenitoras intermedias. Los subtipos más indiferenciados (tipo 2a y 2b tipo) tienen una forma irregular con cortos, procesos tangenciales. Generan neuroblastos (tipo 3) que salen gradualmente del ciclo celular para convertirse en neuronas inmaduras (con dendritas extienden hacia la capa molecular) y finalmente integrar en la red del hipocampo células granulares como maduros. Debido a sus características fisiológicas estas células proporcionan los circuitos con una mejora de la plasticidad ³ sugeting un papel único en la función del hipocampo. En realidad, los estudios de la última década generado evidencia sustancial de que la neurogénesis adulta contribuye a la memoria espacial, la separación patrón de comportamiento emocional y ^4,5.

Neurogénesis adulta se puede estudiar utilizando diferentes enfoques. Análogos de timidina incorporan en el ADN durante la fase S del ciclo celular y permiten nacimiento de citas, la cuantificación y el destino análisis de las células recién nacidos ^6-8. La aplicación secuencial de los diferentes análogos de timidina (por ejemplo, CldU, EdU o IDU) puede ser usado para estudiar la renovación celular o poblaciones de células nacidos en diferentes puntos de tiempo durante el curso de un experimento ^9. Una alternativa, marcador endógeno para la proliferación celular es Ki67. Se expresa en las células en división durante todas las fases del ciclo celular (G1, S, G2, M) excepto la fase de reposo (G0) y el comienzo de G1 ^10,11. Para analizar el fenotipo de las poblaciones de células recién nacidas en el adulto dentate gyrus varios marcadores moleculares específicos de la etapa se pueden utilizar como GFAP, nestina, DCX y NeuN ^1,6. GFAP es un marcador de astrocitos maduros pero también se expresa en células gliales-como radiales en el cerebro anterior adulto. Nestin es un filamento intermedio específico para células gliales como radiales y células progenitoras intermedios tempranos. DCX es una proteína asociada a microtúbulos expresado en progenitores intermedios, los neuroblastos y las neuronas inmaduras. Sobre la base de la (co) expresión de estos tres marcadores y las características morfológicas de las células marcadas cuatro subtipos de células progenitoras se pueden identificar diferentes: tipo 1 (GFAP ^+, nestina ^+, DCX ^-), tipo 2a (GFAP ^-, nestina ⁺ , DCX ^-), el tipo 2b (GFAP ^-, nestina ^+, DCX ⁺⁾ y tipo 3 (GFAP ^-, nestina ^-, DCX ^{+) 1.} Co-etiquetado de DCX junto con NeuN, que se expresa en las neuronas postmitóticas, permite la diferenciación de immature (DCX ^+, NeuN ⁺⁾ y maduros (DCX ^-, NeuN ⁺⁾ neuronas granulares.

Los marcadores mencionados anteriormente se utilizan con frecuencia para inmunofluorescencia co-etiquetado y microscopía confocal posterior para analizar el número y la identidad de las células recién nacidos. Esto requiere típicamente anticuerpos de diferentes especies huésped para evitar anticuerpo no deseado reactividad cruzada. Sin embargo, la mayoría de los anticuerpos primarios adecuados para la investigación neurogénesis resucitan ya sea en conejos o ratones (por ejemplo, ratón α-BrdU, ratón α-NeuN, conejo α-Ki67, conejo α-GFAP). Esto conduce a graves limitaciones en el número y la combinación de antígenos que se pudieron evaluar en una sola porción. Esto a su vez no sólo aumenta el esfuerzo de tinción, como múltiples coloraciones tienen que ser realizadas, pero también podría comprometer la fiabilidad de los resultados. Además, algunos antígenos son susceptibles a la formalina enmascaramiento epítopo inducida por la fijación (por ejemplo, Ki67, Nestina). Esta revisión se describen las modificaciones de los protocolos immunolabeling múltiple y simple clásicos (por ejemplo, la recuperación de epítopo, inmunotinción secuencial múltiple, uso de nestin-GFP ratones transgénicos ¹²⁾ que superar muchas de estas cuestiones. En particular, el protocolo de inmunofluorescencia secuencial múltiple permite tinción contra un máximo de cuatro antígenos diferentes, incluso si una parte de los anticuerpos se deriva de la misma máquina. Esto permite la detección simultánea de tipo 1, tipo 2a, tipo 2b y tipo de células progenitoras 3, así como su actividad proliferativa dentro de una sola sección.

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos con animales vivos se llevaron a cabo de acuerdo con la directiva de la CE 86/609 / CEE directrices sobre el cuidado y uso de animales de laboratorio y aprobado por el comité de ética local (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).

1. inyección intraperitoneal de la timidina análogos

1. Pesar los animales el día antes de la inyección. Calcular la cantidad de análogo de timidina requerido para todas las inyecciones previstas en el día siguiente, así como los volúmenes de inyección en función del peso individuales de una solución madre de 10 mg / ml.
2. Preparar 10 mg / ml solución timidina valores. (NOTA: Los análogos de timidina son tóxicos. Siga las hojas de seguridad específicas (MSDS) proporcionadas por los proveedores, es decir, usar bata de laboratorio y guantes, use una campana química).
   1. Tome análogo de la timidina del congelador y llevarlo a RT, aprox. 21 ° C. Pesar 10 mg y añadirsolución salina estéril (para BrdU y CldU) o 0,04 N NaOH (en solución salina estéril; para IDU), vórtice. Durante, por lo menos 10 - 15 minutos en un baño de agua a 50 ° C y agitar cada 2 - 3 minutos para disolver el polvo.
      NOTA: Utilice las soluciones para un máximo de 24 horas cuando se almacena a temperatura ambiente y durante varias semanas a -20 ° C. Proteja las soluciones de la luz (cubierta con papel de aluminio). Siempre verifique precipitados y volver a disolver si es necesario.
3. Restringir el ratón por la piel y por vía intraperitoneal inyectar un volumen apropiado, ajustada al peso de la solución madre (a temperatura ambiente) con una jeringa de dosificación fina con una aguja de 30 G.
   NOTA: En caso de CldU e IDU tienen que ser administrados secuencialmente en el mismo animal, consideran para inyectar concentraciones equimolares (por ejemplo, 42,5 mg / kg CldU y 57,5 mg / kg IdU, que corresponden a 50 mg / kg de BrdU). Por lo tanto, ajustar los volúmenes de inyección de las soluciones de 10 mg / ml de solución madre en consecuencia.

2. Preparación del tejido

1. Prepare formaldehído al 4% en 0,1 M tampón fosfato pH 7,4 en el día antes de la perfusión. Almacenar a 4 ° C.
2. Transcardially perfundir los ratones profundamente anestesiados (3,5% de isoflurano) a través del ventrículo izquierdo con PBS 10 ml de hielo-frío, luego con 40 ml de formaldehído enfriada con hielo (tasa de flujo de 5 ml / min). Diseccionar el cerebro y post-fix en el mismo fijador durante 24 horas a 4 ° C.
3. Transferir los cerebros consecutivamente en 10% (24 horas a 4 ° C) y 30% de sacarosa (hasta que los sumideros cerebrales, aprox. 48 h). Para la congelación, sumergir lentamente los cerebros crioprotegidas en -25 ° C hasta que no queden burbujas de isopentano emergen del tejido. Almacenar a -80 ° C.
4. Los cortes de secciones coronales de 40 m de espesor en un micrótomo de congelación (temperatura del bloque a -25 hasta -16 ° C). Secciones de transferencia secuencialmente en solución anticongelante que contiene los pocillos de una placa de cultivo celular de 24 pocillos (véase la Figura 1). Almacenar a -20 ° C.

Figura 1. Esquema de transferencia de rebanadas de microtomo en una placa de 24 pocillos. Comienza en A1 y ​​colocar rodajas posteriores en la fila A, después A6 ir a la siguiente fila B y así sucesivamente. Al llegar a D6, volver a A1 y continuar. Esta disposición de las rebanadas permite para la cuantificación de cada ^n-ésima sección de todo un cerebro. Para la cuantificación de células recién nacidas tomar cada ⁶ th sección cerebro (equivalente al contenido de una columna), por el fenotipo de inmunofluorescencia tomar cada sección ^12ª (equivalente al contenido de 2 filas alternas de una columna).

3. La inmunotinción

NOTA: Las secciones se procesan de flotación libre, generalmente en placas de 6 pocillos equipadas con placa de apoyo e inserciones de malla. Como excepción, el bloqueo, las incubaciones de anticuerpos y la reacción ABC se hacen en 12 ó 24 pocillos sin inserciones de malla (de 0,5 a 1 ml por well es suficiente, en función del número de rebanadas que tienen que ser manchado). Durante estos pasos, transferir secciones con la ayuda de un pincel fino (enjuagar con cada nueva solución). Todas las incubaciones se realizan con agitación continua (max 150 rpm).

1. La inmunohistoquímica (método ABC)
   1. Traslado secciones de anticongelante en TBS y enjuagar bien (una vez O / N a 4 ° C, 5 veces a temperatura ambiente durante 10 minutos cada uno) para eliminar por completo el anticongelante.
   2. Incubar durante 30 min en 1,5% de H ₂ O ₂ en TBS-T para apagar la actividad de la peroxidasa endógena. Preste atención a la formación de burbujas y volver a sumergirse secciones si fuera necesario. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno.
   3. Opcional: Mientras tanto precalentar un armario de calefacción y de 2 N HCl a 37 ° C. Incubar las secciones durante 30 min a 37 ° C en 2 N HCl para desnaturalizar el ADN. Gently secciones separadas con la ayuda de un pincel.
   4. Opcional: Neutralizar secciones durante 10 minutos en 0,1 M de borato de pH del tampón8,5, RT. Durante la transferencia, limpie brevemente las inserciones de malla que contienen las secciones sobre una toalla de papel para eliminar las sobras HCl. Enjuague 2 veces en TBS durante 15 minutos cada uno.
   5. Incubar en TBSplus para permeabilizar el tejido y para bloquear los sitios de unión de anticuerpos inespecíficos, 1 hr a RT.
   6. Incubar en anticuerpo primario diluido en TBSplus, O / N a 4 ° C. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno.
   7. Incubar en anticuerpo secundario biotinilado diluido en TBSplus, 3 horas a temperatura ambiente. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno. Mientras tanto ...
   8. Preparar complejo ABC según el protocolo del fabricante (1% A + B al 1% en TBS-T). Dejar reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de su uso. Incubar las secciones de reactivo AB durante 1 hora a RT. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno.
   9. Preparar 50 ml 0.5 mg / ml DAB en TBS-T por 6 ó 12 pocillos placa, dividido en dos mitades y pipetas 4 ml o 2 ml por pocillo, respectivamente. Secciones de transferencia en solución DAB (PRECAUCIÓN! DAB es tóxico. Siga el específic MSDS proporcionados por el proveedor, es decir, usar bata de laboratorio y guantes, use una campana química).
   10. Añadir 0,5 ml 1% H ₂ O ₂ a la solución DAB 25 ml restantes, mezclar y volúmenes de pipeta equivalentes como anteriormente a cada pocillo para iniciar la reacción de la peroxidasa. Incubar durante 12 min. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno.
   11. Mount secciones a las diapositivas de la gelatina, secar al aire O / N. Cubreobjetos con medio de montaje permanente.
   12. Opcional: Contratinción antes de colocar el cubreobjetos (ver sección 3.5).
       NOTA: Si la relación señal-ruido es bajo debido a la alta fondo, repita H ₂ O ₂ de tratamiento después de la incubación con AB reactivo (paso 3.1.8).
2. Multiple-inmunofluorescencia
   1. Individual o simultánea inmunofluorescencia múltiple
      1. Traslado secciones de anticongelante en TBS y enjuagar bien (una vez O / N a 4 ° C, 5 veces a temperatura ambiente durante 10 minutos cada uno) para eliminar completamente unanticongelante.
      2. Opcional: que en los pasos 3.1.3 - 3.1.4.
      3. Incubar en TBSplus para permeabilizar el tejido y bloquear los sitios de unión de anticuerpos inespecíficos, 1 hr a RT.
      4. Incubar en cóctel primaria de anticuerpos (por ejemplo, α-BrdU rata, cobaya α-DCX, cabra α-GFP) diluidas en TBSplus, O / N a 4 ° C. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno.
      5. Incubar en cóctel de anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromo (por ejemplo, Rodamina Red α-rata, Alexa-647 α-cobaya, Alexa-488 α-cabra, todo derivado en burro) diluido en TBSplus, 3 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. De ahora en proteger las secciones de la luz. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno.
      6. Mount secciones a las diapositivas de la gelatina, secar al aire O / N. Cubreobjetos con medio de montaje acuoso.
   2. Inmunofluorescencia múltiple secuencial con anticuerpos primarios de misma especie hospedadora
      1. Como pasos 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
      2. Incubar en fiprimer anticuerpo primario (por ejemplo, conejo α-antígeno A), O / N a 4 ° C. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno.
      3. Incubar en primer anticuerpo conjugado a un fluorocromo secundaria (por ejemplo, Rodamina Red-conj. Burro α-conejo), 3 horas RT. De ahora en proteger las secciones de la luz. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno.
      4. Incubar en 10% de suero normal de mismo host que los anticuerpos primarios (por ejemplo, suero de conejo) para RT 3 horas para saturar paratopos abiertas en el primer anticuerpo secundario. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno.
      5. Incubar en TBSplus con 50 g / ml fragmentos Fab monovalentes no conjugado dirigido contra el anfitrión de los anticuerpos primarios (por ejemplo, α-conejo IgG (H + L)) para cubrir epítopos que podrían ser reconocidos por el segundo anticuerpo secundario, O / N en 4 ° C.
      6. Enjuague al menos 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 min cada uno. Durante la transferencia, la SWA brevementeb las inserciones de malla que contienen las secciones sobre una toalla de papel para eliminar las sobras Fab.
      7. Incubar en segundo anticuerpo primario (por ejemplo, conejo α-antígeno B), O / N a 4 ° C. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno.
      8. Incubar en segundo anticuerpo conjugado a un fluorocromo secundaria (por ejemplo, Alexa-488-conj. Burro α-conejo), 3 hr RT. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 min cada uno, montar y el cubreobjetos como anteriormente.
         NOTA: Para etiquetar antígenos con anticuerpos de diferentes especies huésped que añadir al paso 3.2.2.2 y los respectivos anticuerpos secundarios al paso 3.2.2.3.
   3. Uno de los anticuerpos secundarios a partir de una misma especie como uno de los anticuerpos primarios
      NOTA: Este protocolo es adecuado para cuádruple tinción contra BrdU o Ki67 junto con GFAP, nestin-GFP y DCX.
      1. Siga estrictamente el protocolo pasos 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Hasta este punto, utilizar sólo suero burro en TBSplus.
      2. Incubar en TBSplus que contiene 3% de suero de cabra durante 1 hora a RT. Esto cubre paratopos abiertas en el anticuerpo secundario-α de cabra. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno.
      3. Incubar en AMCA-conj. cabra α-conejo diluido en TBSplus, RT 3 hr o O / N 4 ° C. Enjuague tres veces en TBS durante 15 min cada uno, montar y el cubreobjetos como anteriormente.
   4. CldU, IdU co-tinción
      1. Enjuague, desnaturaliza y neutralizar secciones como se describe en la sección 3.2.1 (pasos 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
      2. Incubar con 20 g / ml fragmentos Fab no conjugados α-ratón IgG (H + L) en TBSplus, 1 hr a RT. Enjuague 4 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno.
      3. Incubar en cóctel de anticuerpos primario que contiene α-BrdU de rata (1: 400; purificado IgG2) y α-BrdU de ratón (1: 350) diluido en TBSplus, O / N a 4 ° C. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno.
      4. Incubar en cóctel de anticuerpo secundario que contiene burro biotinilados α-rata (1: 500) y FITC-conj. burro α-ratón fragmentos Fab (1: 100). Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno.
      5. Incubar en Rodamina Red-conj. Estreptavidina, 2 horas a RT. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 min cada uno, montar y el cubreobjetos como anteriormente.
   5. La amplificación de señal de fluorescencia en ratones nestin-GFP
      1. Añadir cabra α-GFP al cóctel de anticuerpo primario.
      2. Añadir un anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo con propiedades espectrales similares a GFP (como Alexa 488 conj. Burro α-cabra) al cóctel de anticuerpo secundario.
3. Recuperación del epítopo
   1. Llevar a cabo la recuperación de epítopo después de aclarar el anticongelante. Precalentar el vapor con 6 ó 12 pocillos que contenían tampón 0,1 M de citrato de pH de 6,0 a 95 a 99 ° C (aproximadamente 25 min).
   2. Transferir las secciones en el tampón de citrato caliente y vapor durante 30 minutos (cubrir las placas con papel de aluminio como el plástico lIDs no se calientan-resistente).
   3. Inmediatamente colocar las placas en un baño de hielo para refrescarse. Esto ayuda a proteger la morfología del tejido, lo cual es de particular importancia cuando se trabaja con secciones de cerebro de animales postnatales.
   4. Enjuagar 3 veces en TBS durante 10 minutos cada uno para enjuagar y neutralizar el citrato y continuar tinción.
4. Ratón anticuerpos en tejido de ratón
   1. Añadir 20 g / ml fragmentos Fab monovalentes α-ratón IgG (H + L; mismo host-especies que anticuerpo secundario) para la primera etapa de bloqueo (por ejemplo, paso 3.1.5 o 3.2.1.3).
   2. Enjuague 4 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno, y proceda con el protocolo respectivo.
5. Cresil violeta counterstaining
   1. Solución de Precalienta cresil violeta a 60 ° C (en frasco de vidrio). Incubar los portaobjetos en la solución caliente durante 3 minutos.
   2. Enjuague en ac. dest. y deshidratar 2 veces durante 1 min cada uno en 70%, 96% y 100% de isopropanol.
   Borrar para 5 - 6 min en xileno o un sustituto de xileno y el cubreobjetos con un medio de montaje permanente compatible.

Análisis 4. Datos

1. Contar las células recién nacidos peroxidasa teñidas en cada sección ^6º a lo largo de toda la extensión rostrocaudal del giro dentado. Utilice un microscopio de luz con un aumento de 400X.
2. Multiplicar el número de células resultantes con el intervalo de intersección para obtener una estimación del número total de células recién nacidos.
3. Imagen de la fluorescencia etiquetada secciones con un microscopio láser confocal equipado con láseres y sistemas de filtros adecuados. Tome pilas de imágenes en posiciones aleatorias a lo largo de toda la extensión de la circunvolución dentada con una ampliación de 400X y analizar al menos 50 celdas seleccionadas al azar de interés por hemisferio para co-etiquetado con otros marcadores.
4. Multiplique los porcentajes resultantes de las células co-etiquetado (% / 100) con el número total de células recién nacidas para calcular absolutanúmero de poblaciones específicas de células recién nacidas.

Resultados

Se aplicaron los métodos descritos anteriormente para cuantificar y caracterizar las células recién nacidas en el hipocampo postnatal y adulto. Por lo tanto, hemos utilizado de tipo salvaje y la neurogénesis deficiente ciclina D2 knock out (KO) CCND2 ratones alojados en condiciones conocidas por afectar la tasa de neurogénesis (es decir, el medio ambiente enriquecido, EE) ^13,14. Tinción inmunohistoquímica DAB contra cualquiera de Ki67, BrdU, CldU o IdU reveló consistentemente diferencias en ...

Discusión

La cuantificación e identificación de las subpoblaciones de células recién nacidas es un tema central en la investigación neurogénesis adulta. Combinando marcadores de proliferación y anticuerpos contra las proteínas expresadas durante etapas específicas de la neurogénesis adulta permite la detección inmunohistoquímica de estas subpoblaciones. Algunos de los anticuerpos o combinaciones de anticuerpos requieren condiciones de tinción específicas.

Etiquetado de células que se dividen con análo...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Administración de análogos de timidina
5-Bromo-2′-desoxiuridina, BrdU	Sigma-Aldrich	B9285	tóxico (mutagénico, teratogénico)
5-Chloro-2′-desoxiuridina, CldU	Sigma-Aldrich	C6891	tóxico (mutagénico, teratogénico)
5-Chloro-2′-desoxiuridina, CldU	MP Biomedicals	2105478	tóxico (mutagénico, teratogénico)
5-Iodo-2′-desoxiuridina, IdU	MP Biomedicals	2100357	tóxicos (mutagénicos, teratogénicos)
Preparación de tejidos
Isoflurano-Actavis	Piramal Healthcare	700211
Paraformaldehído en polvo (PFA)	Riedel-De Hä EN	16005	tóxico, inflamable
Bomba de perfusión PD5206	Heidolph Instruments	523-52060-00
Masterflex Tygon Tubo de laboratorio, Ø 0,8 mm	Thermo Fischer Scientific	06409-13
Aguja de alimentación, recta, 21 G, 1,75 mm punta de aceituna, 40 mm	Agnthos	1036
micrótomo de congelación Microm HM 400	Thermo Fischer Scientific
Placas multipocillas de cultivo celular de 24 pocillos	Greiner Bio-One	662160
Immunohistochemistry
Tefal Vaporera Vitacuisine	Tefal	VS 4001
Netwell Insertos de membrana de malla de poliéster de 24 mm	Corning	3479	precargado en placas de cultivo de 6 pocillos Netwell
Inserciones de membrana de malla de poliéster de	15 mmCorning	3477	precargado en placas de cultivo de 12 pocillos Kit
de soporte de plástico Netwell para 6 pocillos	Corning	3521	para insertos de membrana de malla de poliéster de 24 mm Kit
de soporte de plástico Netwell para 12 pocillos	Corning	3520	para insertos de membrana de malla de poliéster de 15 mm
Kit Vectastain Elite ABC	Vector Laboratories	PK-6100
DAB (3,3′-Hidrato de tetraclorhidrato de diaminobenzidina)	Sigma-Aldrich	D-5637	cancerígeno, sensible a la luz
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Anticuerpos primarios
Conejo IgG1 α-Ki67	Novocastra/ Leica Biosystems	NCL-L-Ki67MM1	DAB 1:400/IF 1:100; requiere recuperación de epítopos
Conejo α-GFAP, AS-3-GF	Sistemas sinápticos	173 002	1:500
IgG de cabra (H+L) α-GFP	Acris Anticuerpos	R1091P	1:300
Ratón IgG1 α-nestina	Abcam	ab6142	1:200; requiere recuperación de epítopos conejillo
indias IgG (H+L) α-Doublecortin	Merck Millipore	AB2253	1:500
Rata IgG2a α- BrdU (ascitis)	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030CX	para la detección de BrdU; DAB 1:500/IF 1:400
Rata IgG2a α-BrdU (purificado)	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030	para la detección de CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
Ratón IgG1 α-NeuN	Merck Millipore	MAB377	1:500
ratón IgG1κ α-BrdU	BD Biosciences	347580	Para la detección de IdU; DAB 1:500/IF 1:350
Anticuerpos secundarios
burro &alfa;-cobaya IgG (H+L)-Biotina	Dianova	711-065-152	1:500
Burro α-rata IgG (H+L)-Biotina	Dianova	712-065-150	1:500
Burro α-ratón IgG (H+L)-Biotina	Dianova	715-065-151	1:500
cabra &alfa;-rata IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Sondas Moleculares	A11006	1:250
Burro α-cabra IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Sondas Moleculares	A11055	1:250
Burro α-ratón IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment	Dianova	715-097-003	1:100
Burro α-ratón IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	715-605-151	1:250
Burro &alfa;-cobaya IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	706-605-148	1:250
Burro &alfa;-rata IgG (H+L)-Rodamina Rojo-X	Dianova	712-295-150	1:250
Burro &alfa;-conejo IgG (H+L)-Rodamina Rojo-X	Dianova	711-295-152	1:250
Burro α-cobaya IgG (H+L)-Rodamina Rojo-X	Dianova	706-296-148	1:250
Estreptavidina-rodamina Red-X	Dianova	016-290-084	1:500
Cabra α-conejo IgG (H+L)-AMCA	Dianova	111-155-144	1:250, funciona solo con conejo α-GFAP
Hoechst 33342	Sondas Moleculares	H3570	1:1000
DAPI	Sondas Moleculares	D1306	1:1000
Bloqueo
Burro con fragmento de fabuloso α-ratón IgG (H+L)	Dianova	715-007-003	1:20
Burro con fragmento de fab α-conejo IgG (H+L)	Dianova	711-007-003	1:20
Suero de burro normal	Merck Millipore	S30
Suero de conejo normal	Dianova	011-000-010
Suero de cabra normal	Dianova	005-000-001
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A7906
Histology
Cresyl violet	Sigma-Aldrich	C5042
Neo-Clear	Merck Millipore	109843	sustituto no tóxico del xileno
Neo-Mount	Merck Millipore	109016	medio
Microscopía
Microscopía			Axioskop 2
LSM 710	Microscopía