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Artículo de método

Oro nanorod asistida estimulación óptica de las células neuronales

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DOI:

10.3791/52566

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27 de abril de 2015

 ,  , 
1Biotactical Engineering, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe cómo utilizar el calentamiento transitorio asociado con la absorción óptica de nanovarillas de oro para estimular la diferenciación y la actividad del calcio intracelular en las células neuronales. Estos resultados abren potencialmente nuevas aplicaciones en prótesis neurales y estudios fundamentales en neurociencia.

Resumen

Estudios recientes han demostrado que los nervios pueden ser estimulados de diversas maneras por el calentamiento transitorio asociado con la absorción de luz infrarroja por el agua en el tejido neuronal. Esta técnica tiene un gran potencial para reemplazar o complementar las técnicas de estimulación estándar, debido al potencial para aumentar la localización del estímulo y minimizar el contacto mecánico con el tejido. Sin embargo, los enfoques ópticos están limitados por la incapacidad de la luz visible para penetrar profundamente en los tejidos. Además, la modelización térmica sugiere que los efectos acumulativos del calentamiento podrían ser potencialmente peligrosos cuando se utilizan múltiples sitios de estímulo o altas tasas de repetición del láser. El protocolo que se describe a continuación describe un enfoque mejorado para la estimulación infrarroja de las células neuronales. El mecanismo subyacente se basa en el calentamiento transitorio asociado con la absorción óptica de nanovarillas de oro, que puede causar el desencadenamiento de la diferenciación de las células neuronales y el aumento de los niveles de actividad de calcio intracelular. Estos resultados demuestran que los absorbentes de nanopartículas pueden mejorar y/o sustituir el proceso de estimulación neuronal infrarroja basado en la absorción de agua, con potencial para futuras aplicaciones en prótesis neurales y terapias celulares.

Introducción

Estudios recientes han demostrado que el calentamiento transitorio asociado con la absorción de luz infrarroja por el agua (longitud de onda> 1400 nm) se puede utilizar para inducir potenciales de acción en el tejido nervioso 1 y transitorios de calcio intracelular en cardiomiocitos 2. El uso de luz infrarroja ha planteado un gran interés para aplicaciones en prótesis neurales, debido al potencial de resolución espacial más fina, la falta de contacto directo con el tejido, la reducción al mínimo de artefactos de estimulación, y la eliminación de la necesidad de modificar genéticamente las células antes de la estimulación ( como se requiere en la optogenética) 1. A pesar de todos estos beneficios, modelos térmicos desarrollados recientemente sugirieron que los tejidos / células diana pueden verse afectados por efectos de calentamiento y acumulativos, cuando se utilizan múltiples sitios de estímulo y / o altas tasas de repetición 3,4.

En respuesta a estos desafíos, los investigadores han reconocido el potencial de utilizar ABSOR extrínsecabros de la estimulación del nervio para producir efectos de calentamiento más localizadas en el tejido. Huang et al. Demostró este principio mediante el uso de nanopartículas de ferrita superparamagnéticas para activar remotamente los canales TRPV1 sensibles a la temperatura en las células HEK 293 con una radio-frecuencia del campo magnético 5. Aunque esta técnica puede permitir una penetración más profunda (campos magnéticos interactúan relativamente débilmente con el tejido), las respuestas sólo se registraron durante períodos de segundos, en lugar de las duraciones de milisegundos requeridos en los dispositivos biónicos 5. Del mismo modo, Farah et al. Estimulación eléctrica demostrada de neuronas corticales de rata con micro-partículas negras en vitro. Mostraron precisión a nivel celular en la estimulación utilizando duraciones de pulso del orden de cientos de microsegundo y energías en el rango de mu J, permitiendo potencialmente las tasas de repetición más rápidas 6.

El uso de absorbentes de extrínsecos también se ha aplicado para inducircambios morfológicos in vitro. Ciofani et al. Mostraron un aumento de ~ 40% en el crecimiento externo celular neuronal utilizando piezoeléctricos nitruro de boro nanotubos excitados por ultrasonido 7. Del mismo modo, se ha informado de nanopartículas de óxido de hierro endocitosis en las células PC12 para mejorar la diferenciación de neuritas en una manera dependiente de la dosis, debido a la activación de moléculas de adhesión celular con el óxido de hierro 8.

Recientemente, el interés en absorbedores extrínsecos para ayudar a la estimulación neural también se ha centrado en el uso de nanopartículas de oro (Au NPs). Au NPs tienen la capacidad de absorber de manera eficiente la luz láser en el pico plasmónica y para disipar en el ambiente circundante en forma de calor 9. Entre todas las formas de las partículas disponibles, la absorción óptica de nanorods oro (Au NRS) convenientemente coincide con la ventana terapéutica de tejidos biológicos (infrarrojo cercano - NIR, longitud de onda entre 750-1,400 nm) 10. Además, en el context de estimulación neural, el uso de Au NR proporciona biocompatibilidad relativamente favorable y una amplia gama de opciones de funcionalización de la superficie 11. Estudios recientes han demostrado que un efecto estimulador en la diferenciación puede ser inducida después de exposiciones láser continuo de Au NR en NG108-15 células neuronales 12. Del mismo modo, los transitorios de calcio intracelulares se registraron en las células neuronales cultivadas con Au NR después de la irradiación láser modulada con frecuencias variables y longitudes de pulso 13. Despolarización de la membrana celular también se registró después de NIR láser de iluminación de Au NR en cultivos primarios de neuronas del ganglio espiral 14. La primera aplicación in vivo con irradiado Au NR se ha demostrado recientemente. Eom y compañeros de trabajo expuestos Au rupias en su pico plasmónica y registraron un aumento de seis veces en la amplitud de los potenciales de acción del nervio compuesto (CNaPS) y una disminución de tres veces en el umbral de estimulación en ratas nervios ciáticos. Los cuartosrespuesta hanced se atribuyó a los efectos de calentamiento locales que resultan de la excitación del pico plasmónica NR 15.

En el presente trabajo, se especifican los protocolos para la investigación de los efectos de la estimulación con láser en NG108-15 células neuronales cultivadas con Au rupias. Estos métodos proporcionan una simple, pero potente, forma de irradiar poblaciones celulares in vitro utilizando técnicas y materiales biológicos estándar. El protocolo se basa en un diodo láser de fibra acoplada (LD) que permite un funcionamiento seguro y la alineación repetible. La preparación de la muestra y los métodos de irradiación láser Au NR se pueden ampliar a diferentes formas de partículas y cultivos de células neuronales, siempre que los protocolos de síntesis y cultura específicas son conocidas, respectivamente.

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Protocolo

1. Preparación Au rupias

Nota: Au NR se puede sintetizar por una serie de recetas 16, o comprados de vendedores comerciales.

  1. Medir la densidad óptica inicial (OD) de la solución de Au NR través de espectroscopía de UV-Vis, mediante el registro de los valores de absorción de 300 nm a 1000 nm con una resolución de 0,5-2 nm. Variar el volumen de la solución a ser utilizado con la cubeta disponible.
  2. Evaluar la concentración molar inicial NP con una técnica 17 adecuado (por ejemplo, la espectroscopia UV-Vis, partícula única espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente, microscopía electrónica de transmisión) o utilizar los valores de concentración proporcionados por el vendedor.
  3. Preparar una solución madre de 5 ml por dilución de la muestra inicial Au NR llegar a un OD = 1. Para el mejor repetibilidad, mantener constante la OD para todas las muestras ensayadas. Siga el protocolo del proveedor comercial para la composición del disolvente de dilución. Si no está seguro, Use agua destilada.
  4. Centrifugar 1 ml de la solución de Au NR dos veces durante 15 minutos a 7800 xg para eliminar cualquier exceso de sustancia química de la solución. Ciclos de centrifugación pueden variar en fuerza y el tiempo (por ejemplo, 20 min a 5600 × g) 18.
  5. Eliminar el sobrenadante y volver a suspender los NR en agua desionizada. Como partículas resuspendidas podrían formar agregados en solución, prepararlos diariamente para tener los mejores resultados. Alternativamente, almacenar en un refrigerador por no más de 1 semana. No lo congele.
  6. Antes de usar en condiciones de cultivo celular, sonicar la solución Au NR durante 5 min y luego esterilizar con luz UV durante 30 min (intensidad de la radiación UV no menos de 400 mW ∙ m -2 a 254 nm).

2. NG108-15 célula neuronal Línea Cultura y Diferenciación

  1. Para el medio de cultivo celular, preparar 500 ml de medio estéril de Dulbecco modificado Eagle (DMEM) que contiene 10% (w / v) de suero de ternera fetal (FCS), 1% (w / v) L-glutamina, 1%(W / v) de penicilina / estreptomicina y 0,5% (w / v) de anfotericina B.
    Nota: Los suplementos pueden ser alicuotaron, almacenado a -20 ° C y se añaden a los medios de comunicación en el día requerido. Medio de cultivo celular se puede refrigerar en una condición estéril para un máximo de 1 mes.
  2. Para el medio de diferenciación celular, preparar 50 ml de DMEM estéril que contenía 1% (w / v) L-glutamina, 1% (w / v) de penicilina / estreptomicina y 0,5% (w / v) de anfotericina B.
  3. Crecer NG108-15 células neuronales en 10 ml de medio de cultivo de células en matraces T75 de poliestireno en una incubadora con atmósfera humidificada (5% de CO2 a 37 ° C). Normalmente, las semillas 1.5-2 × 10 5 células de cada matraz para estar listo en 3-4 días. Cambio de medio de cultivo de células cada dos días.
    Nota: Para evitar derivas genéticas o variación, no utilice células mayores de paso 21 para los experimentos.
  4. Cuando el 70-80% de confluencia en la cultura, cambie el medio con una cálida medio de cultivo celular fresco. Mecánicamente separar las células suavemente knocrey el fondo del matraz confluente. No utilice la tripsina.
  5. Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 600 xg y volver a suspender el sedimento celular en 2 ml de medio de diferenciación celular caliente.
  6. Seed 2 × 10 4 células / cm 2 en una placa de cultivo de tejidos de poliestireno de 96 con 200 l de medio de diferenciación celular. Incubar el experimento durante 1 día a 5% de CO 2/37 ° C.
  7. Añadir entre 3,2 × 10 9 -4,2 × 1 0 10 partículas / ml de solución de Au NR en el día 2 y se incuba durante 24 h adicionales. No agregue las partículas para los experimentos de control.
    Nota: A modo de control alternativo, Au NPs con una longitud de onda de absorción máxima bien diferenciado puede ser utilizado para propósitos de comparación 14. Para un comportamiento celular más consistente, mantener la densidad celular constante y de no modificar la superficie bien antes de la siembra de células.

3. neuritas Enhancement

  1. Parejael láser con una fibra óptica monomodo (apertura numérica = 0,13) y terminar con un conector de fibra (FC conectores son convenientes y comúnmente disponibles). Medir la potencia del láser de salida con un medidor de potencia estándar. Para obtener los resultados más eficaces, que coincida con la longitud de onda máxima del láser al pico de resonancia de plasmón de los NR.
  2. En el día 3 después de la incubación NR, fijar el conector FC al pozo. Irradiar muestras y los controles a TA durante 1 min en onda continua, para diferentes potencias de láser. Deje que la cultura de proceder durante 3 días adicionales en el 5% de CO 2/37 ° C. Repetir la irradiación con láser durante un mínimo de 3 mediciones independientes.
    Nota: Los diferentes tiempos de irradiación y frecuencias de impulsos se pueden seleccionar, dependiendo de la aplicación.
  3. Caracterizar el láser en términos de diámetro del haz y la irradiación láser (W ∙ cm -2).
    1. Para una fibra monomodo estándar, utilice NA = n ∙ pecado θ,donde n es el índice de refracción del medio en el uso y θ es el medio-ángulo del cono de luz que sale de la fibra (ver Figura 1A). De trigonometría, r = tan θ ∙ d, donde r es el radio del haz y d es la distancia entre la fibra y la muestra. El conector FC coincida con el diámetro del pozo, por lo tanto, la iluminación de la muestra a una distancia d = 2,70 ± 0,20 mm. Luz sale de la fibra en el agua (n = 1.33), lo que r = tan (sin-1 (NA / n)) ∙ d.
    2. Usando la última ecuación, calcular el radio del haz láser, el área del haz correspondiente y la irradiancia media de láser (láser de potencia dividida por el área del haz) en el objetivo (véase el ejemplo gráfico de la Figura 1B). Estos valores representan la irradiancia media de la zona iluminada.
    3. Evaluar los errores de las mediciones con la teoría general de la propagación de errores.
      Nota: La distancia bntre el conector FC y la muestra se pueden medir por las fotografías de la disposición experimental y post-procesamiento de la imagen utilizando el software apropiado (por ejemplo ImageJ).
  4. En el día 5, retire medio de diferenciación celular a partir de los experimentos y fijar las muestras con 3,7% (v / v), solución de formaldehído durante 10 min, a continuación, permeabilizar las células con 0,1% (v / v) de Triton X-100 durante 20 min.
  5. Añadir 3% (w / v) de albúmina de suero bovino (BSA) a las muestras durante 60 minutos para bloquear los sitios de unión de proteína sin reaccionar. Etiquetar las muestras durante la noche anti-βIII-tubulina (5 mg / ml en PBS suplementado con 1% de BSA) a 4 ° C.
  6. Se incuban las células durante 90 min en la oscuridad con un anticuerpo secundario apropiado (ratón anti-anticuerpo conjugado con TRITC por ejemplo IgG) utilizando una concentración de 0,4-2 mg / ml en 1% de BSA en PBS. Etiquetar los núcleos celulares con DAPI (0,1 mg / ml en agua desionizada) durante 10 min.
    Nota: la conjugación de anticuerpos y MIG concentraciónht puede variar de acuerdo con el protocolo de empresa. Lávese las muestras con PBS dos veces durante 5 minutos después de cada etapa de tinción.
    figure-protocol-1
  7. Muestras Imagen de epifluorescencia o microscopía confocal utilizando al menos un 20 × objetivo. Elige el microscopio filtra en consecuencia para el anticuerpo secundario. Seleccionar un filtro DAPI (λ EX = 358 nm; EM λ = 488 nm) para visualizar los núcleos celulares.
  8. Analizar las imágenes mediante la evaluación de: i) la longitud de las neuritas máximo (registro de la longitud desde la punta de la neurita hasta el comienzo del cuerpo celular), ii) el número de neuritas por célula neuronal (resumir todas las neuritas por célula) y iii) el porcentaje de células con neuritas (dividir el número total de células que expresan βIII-tubulina por el número total de células con un núcleo con tinción positiva) 19.

Inducida por láser 4. intracelular de Ca2 + Imaging

  1. Preparar un 20% (w / v) solución madre de Pluronic F-127 por disolución de 2 g de soluto en 10 ml de sulfóxido de dimetilo anhidro (DMSO). Calentar la solución de Pluronic F-127 a 40 ° C durante aproximadamente 20 min para aumentar la solubilidad. Preparar con antelación si se almacena a temperatura ambiente.
  2. En el día 3 después de la incubación NR, preparar una solución salina equilibrada (BSS; NaCl 135 mM, 4,5 mM KCl, 1,5 mM CaCl 2, 0,5 mM MgCl 2, glucosa 5,6 mM, y HEPES 10 mM, pH 7,4) y suplementado con 5 M de Fluo-4 a.m. en DMSO y 0,1% (w / v) de Pluronic F-127 solución.
    Nota: La solución de BSS puede ser preparado de antemano y se refrigeró durante un máximo de 1 mes. Añadir los suplementos (Fluo-4 de la mañana y Pluronic F-127) en el día del experimento.
  3. Retire medio de diferenciación celular y reemplazarla con la solución BSS complementado. Para obtener los mejores resultados con un microscopio confocal invertido, incubar las células en un micro-pocillos del portaobjetos.
  4. Cargar NG108-15 células con Fluo-04 a.m.durante 30 minutos en la oscuridad a 5% de CO 2/37 ° C. Tras el tiempo de incubación, lavar las muestras dos veces con BSS para eliminar cualquier fluoróforo descargada extracelular.
  5. Pareja el láser con una fibra óptica monomodo y escindir la punta usando técnicas estándar. Observar la punta resultante bajo un microscopio óptico, para asegurar una superficie de alta calidad (es decir, la punta debe ser perpendicular al eje de la fibra y plana después de una inspección microscopía).
    1. Medir la potencia del láser de salida con un medidor de potencia estándar. Inserte la fibra de distribución de luz en un soporte de fibra óptica y pegarla en un microposicionador. Consulte Brown et al. 20 para más detalles sobre la preparación de la fibra óptica y posicionamiento.
      Precaución: Siga las normas generales de seguridad del láser durante la medición de la potencia del láser (por ejemplo, no mire directamente al rayo láser, Usar gafas de protección láser durante la manipulación, evitar la exposición a la luz parásita otros usuarios del laboratorio) <./ Li>
  6. Conectar un osciloscopio al láser portátil para controlar la modulación óptica. Utilice una señal binaria con frecuencias variables (0,5-2 Hz) y longitudes de pulso (20-100 ms). Conecte el láser utilizando la señal de modulación como la lógica transistor-transistor (TTL) de entrada para el microscopio, a raíz de la configuración se muestra en Paviolo et al. 13.
    1. Colocar las células bajo un microscopio confocal invertido y la posición de la fibra de suministro de luz 250 ± 50 m de distancia de la célula diana en el modo de iluminación de transmisión. A esta distancia, utilizar las ecuaciones presentadas en 3.3.1 para calcular el radio del haz en el blanco.
  7. Usa un láser de iones de argón (488 nm) para excitar el Fluo-4 a.m. colorante internalizado (λ EX = 494 nm; λ EM = 516 nm) y la LD sincronizado para la excitación de los NR endocitosis. Realice la imagen a RT de muestras y controles utilizando al menos un objetivo de 40 × recogiendo las exploraciones de series de tiempocon 256 x 256 píxeles / resolución de fotograma en el modo de ida y vuelta con una frecuencia de al menos 4 Hz. Realice una grabación sin ninguna excitación LD para identificar cualquier interferencia láser de argón-ion (ruido de línea de base).
  8. Quitar el fondo de los datos utilizando algoritmos penalizados mínimos cuadrados ponderados de forma adaptativa 21. Representar gráficamente los inducidos Ca 2+ variaciones como una función del tiempo. Analizar los picos transitorios en la intensidad de fluorescencia con software de post-procesamiento por umbral en un nivel tres veces la desviación estándar del ruido de línea de base (3σ).

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Resultados

Mediante el uso de los Protocolos 1, 2 y 3 descritos aquí, se observó un efecto estimulador en la diferenciación en células NG108-15 neuronales cultivadas con Au NP (Au rupias, poli (estirenosulfonato) presenta el revestimiento Au rupias y revestido con sílice Au NR) después de láser exposiciones entre 1,25 y 7,5 W · cm de -2. Las imágenes confocales de marcado con rhodamineB Au NR demostraron que las partículas se interiorizaron de 1 día de incubación 12. La localización se observó predominantemen...

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Discusión

Los protocolos descritos en esta presentación se describe cómo la cultura, diferenciar y ópticamente a estimular las células neuronales utilizando absorbentes extrínsecos. Las características NR (por ejemplo, dimensiones, forma, longitud de onda de resonancia de plasmón y química de la superficie) y los parámetros de estimulación láser (tales como longitud de onda, longitud de pulso, frecuencia de repetición, etc.) se pueden variar para que coincida con diferentes necesidades experimentales. Los efecto...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses contrapuestos que divulgar.

Agradecimientos

Los autores desean reconocer NanoVentures Australia para el apoyo financiero de viajes y el Prof. John Haycock por haber acogido parcialmente esta investigación en la Universidad de Sheffield y la Sra Jaimee Mayne por su ayuda durante el rodaje.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Au NRSigma Aldrich716812
NG108-15Sigma Aldrich8811230
DMEMSigma AldrichD6546
FCSLife Technologies10100147
L-glutaminaSigma AldrichG7513
Penicilina/estreptomicinaLife Technologies15140122
Anfotericina BLife Technologies15290018
formaldehídoSigma AldrichF8775
Triton X-100BDHT8532
BSASigma AldrichA2058
Anti-β III-tubulinaPromegaG7121
Anticuerpo IgG anti-ratón conjugado con TRITCSigma AldrichT5393
DAPIInvitrogenD1306
Fluo-4 AMInvitrogenF14201
DMSOSigma Aldrich 472301
Pluronic F-127InvitrogenP6867
UV-Vis espectrómetroVarian Medical Systems Inc.Cary 50 Bio
Mini centrífugaEppendorfMini Spin
Baño sónicoUnisonics AustraliaFPX 10D
Incubadora de cultivo celularKendroHera Cell 150
Centrífuga de cultivo celularHettichRotofix 32A
Diodo láserOptotech780 nm fibra monomodo - acoplada LD
Fibra ópticaThorlabs780 HP
Medidor de potenciaChequeocoherente
ImageJhttp://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
Microscopio epifluorescenteAxon InstrumentsImageX-press 5000A
μ-pozo de deslizamientoIbidi80826
Microscopio confocal invertidoCarl Microscopía Zeiss Ltd.LSM 510 microscopio
OsciloscopioTektronixTDS210
láser meta-confocal

Referencias

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