Mosaico de pez cebra transgénesis de Análisis Genómica Funcional de candidatos genes cooperativos en la patogénesis del tumor

Resumen

El objetivo de este estudio es demostrar cómo se puede utilizar la estrategia de transgénesis en mosaico en pez cebra para evaluar rápida y eficientemente las contribuciones relativas de múltiples oncogenes en la iniciación y progresión tumoral in vivo.

Resumen

análisis genómico exhaustivo ha descubierto un número sorprendentemente grande de alteraciones genéticas en varios tipos de cáncer. Identificar de manera robusta y eficiente los "impulsores" oncogénicos entre estos tumores y definir sus complejas relaciones con las alteraciones genéticas concurrentes durante la patogénesis tumoral sigue siendo una tarea abrumadora. Recientemente, el pez cebra se ha convertido en un importante modelo animal para el estudio de las enfermedades humanas, en gran parte debido a su facilidad de mantenimiento, alta fecundidad, ventajas evidentes para la obtención de imágenes in vivo, alta conservación de los oncogenes y sus vías moleculares, susceptibilidad a la tumorigénesis y, lo que es más importante, la disponibilidad de técnicas transgénicas adecuadas para su uso en los peces. Los modelos de cáncer de pez cebra transgénico se han utilizado ampliamente para diseccionar las vías oncogénicas en diversos tipos de tumores. Sin embargo, el desarrollo de un modelo de peces transgénicos estables es tedioso y requiere mucho tiempo, y es aún más difícil y requiere más tiempo diseccionar la cooperación de múltiples genes en la patogénesis de la enfermedad utilizando este enfoque, que requiere la generación de múltiples líneas transgénicas con sobreexpresión de los genes individuales de interés, seguida de un mejoramiento complicado de estas líneas transgénicas estables. Por lo tanto, el uso de un enfoque transgénico transitorio en mosaico en pez cebra ofrece ventajas únicas para el análisis genómico funcional in vivo. En resumen, los transgenes candidatos pueden ser coinyectados en embriones de pez cebra transgénicos o de tipo salvaje en una etapa celular y se les puede permitir integrarse juntos en cada célula somática en un patrón de mosaico que conduce a genotipos mixtos en el mismo animal inyectado principalmente. Esto permite investigar de una manera más rápida y menos costosa si los genes candidatos pueden colaborar entre sí para impulsar la tumorigénesis y cómo lo hacen. Mediante la sobreexpresión transitoria de ALK activado en los peces transgénicos que sobreexpresan MYCN, demostramos aquí la cooperación de estos dos oncogenes en la patogénesis de un cáncer pediátrico, el neuroblastoma, que ha resistido la mayoría de las formas de tratamiento contemporáneo.

Introducción

Los cánceres son enfermedades progresivas marcados por la acumulación de mutaciones patológicas, deleciones y ganancias cromosómicas con el tiempo. Estas anomalías genéticas pueden afectar a múltiples procesos celulares que van desde el ciclo celular, la muerte celular, el metabolismo energético y el montaje del citoesqueleto a respuestas de estrés tales como hipoxia. Por lo tanto, la tumorigénesis refleja las acciones colectivas de múltiples aberraciones genéticas a través de un espectro de procesos biológicos. Los recientes esfuerzos de integración genómica de investigación, incluyendo la secuenciación de todo el genoma, la secuenciación del exoma, secuenciación di....

Protocolo

NOTA: Todos los estudios de pez cebra y el mantenimiento de los animales se realizaron de acuerdo con el protocolo aprobado por el IACUC Clínica Mayo Institute # A41213.

1. Construcciones de DNA para la transgénesis

1. Amplificar una 5,2-kb beta hidroxilasa de dopamina (d βh) región promotora ⁸ usando el clon BAC CH211-270H11 (desde el centro de recursos BACPAC (BPRC)) como plantilla de ADN. Utilice una los programas de ciclos siguientes para la PCR PCR sistema apropiado para larga y precisa amplificación por PCR de plantillas de ADN largos y: 94 ° C durante 2 min, 10 ciclos de (94 ° C, 15 seg, 50 ° C, 30 seg, ....

Resultados

Para investigar si la sobreexpresión de F1174L ALK mutationally activado o de tipo salvaje ALK podría colaborar con MYCN en la inducción de neuroblastoma, overexpressed ya sea ALK activada humana o de tipo salvaje ALK humano bajo el control del promotor d βh en el PSNS de peces transgénicos que sobreexpresan MYCN. Cualquiera de las siguientes construcciones, dβh - ALKF1174L o dβh - ALKWT, fueron coinjected con dβh.......

Discusión

En este estudio representativo, se utilizó coinyección transitoria y coexpresión de ALK activado con el gen reportero mCherry en MYCN expresando peces transgénicos para mostrar que estos genes cooperan para acelerar notablemente la aparición de neuroblastoma, coherente con nuestra conclusión anterior en el compuesto estable que coexpresan los peces transgénicos tanto ALK y MYCN ⁸ activado. Este enfoque transgénico mosaico posee varias ventajas sobre el método conve.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Expandir sistema de PCR de plantilla larga	Roche Applied Science, IN	11681834001
vector pCR-TOPO	Invitrogen, CA 451641
T4 ADN ligasa	New England Biolabs, MA	M0202M
Gateway LR Clonasa II enzima Mix	Invitrogen, CA	11791-100
Gateway® BP Clonase® II mezcla de enzimas	Invitrogen, CA	11789-020
GC-RICH PCR System	Roche Applied Science, IN	12 140 306 001
Meganucleasa I-SceI	New England Biolabs, MA	R0694S
Microscopio de fluorescencia estereoscópica Nikon SMZ-1500	Nikon, NY
Cámara DS-U1 con mira digital Nikon	Nikon, NY