Análisis de la autofagia en Penicillium chrysogenum Por la inanición Pads en combinación con microscopía de fluorescencia

Summary

Aquí se presenta un método conveniente y poderoso para estudiar la autofagia en Penicillium chrysogenum mediante el uso de almohadillas de inanición (mezclas de agarosa y agua del grifo en un portaobjetos de microscopio que contiene una cavidad central).

Abstract

El estudio de los sistemas de control de calidad celular se ha convertido en un campo altamente dinámico y relevante de la investigación contemporánea. Ha quedado claro que las células poseen varias líneas de defensa contra el daño a moléculas biológicamente relevantes como los ácidos nucleicos, los lípidos y las proteínas. Además de la dinámica de los orgánulos (fusión/fisión/motilidad/herencia) y la actividad de la proteasa estrictamente controlada, la degradación de orgánulos excedentes, dañados o comprometidos por la autofagia ("autoalimentación" celular) ha recibido mucha atención de la comunidad científica. La regulación de la autofagia es bastante compleja y depende de factores genéticos y ambientales, muchos de los cuales no se han dilucidado hasta ahora. Aquí se presenta un método novedoso que permite el conveniente estudio de la autofagia en el hongo filamentoso Penicillium chrysogenum. Se basa en el crecimiento del hongo en las llamadas "almohadillas de inanición" para la estimulación de la autofagia de forma reproducible. Las muestras se analizan directamente por microscopía y se evalúan para la inducción / progreso de la autofagia. El protocolo presentado aquí no se limita a su uso con P. chrysogenum y puede adaptarse fácilmente para su uso en otros hongos filamentosos.

Introduction

Los hongos filamentosos son excelentes sistemas modelo para el estudio de los procesos de desarrollo. Ofrecen varias ventajas experimentales como el cultivo barato, un alto número de progenie y accesibilidad genética. El último punto es de particular relevancia para la construcción de los transformantes que permiten investigar la importancia de los genes tan lejos no caracterizados por diversos mecanismos celulares. Los hongos filamentosos han sido instrumentales para el esclarecimiento de varios elementos y mecanismos de control de calidad de las vías celulares como actividad de la proteasa de la degradación de proteínas aberrantes, dinámica mitocondrial para manten....

Protocol

1. Preparación de P. chrysogenum para los experimentos de hambre

1. Si el P. chrysogenum cepa de interés se mantiene en el arroz ('arroz verde'), coloque 2-3 granos de arroz cubiertas con esporulación micelio en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Rellenar con 500 l YGG (10 g / l KCl, 20 g / l de glucosa, 10 g / l de base nitrogenada de levadura, 5 g / l K ₂ HPO _4, 20 g / l de extracto de levadura).
   1. Vortex el tubo durante 30 segundos de modo que las esporas pueden desprenderse del arroz de manera eficiente.
   2. Incubar el tubo durante 1 día a temperatura ambiente (por ejemplo, entre 20 ....

Results

Para demostrar la utilidad del protocolo detallado anteriormente degradación de peroxisomas en el P. Se analizó chrysogenum cepa Ws54-1255 (GFP-SKL). En esta cepa GFP-SKL generalmente se importa en los peroxisomas ^9. Esto da lugar a la aparición de múltiples formas esféricas cuando se analiza la muestra a través de microscopía de fluorescencia. Si se produce la autofagia, las vacuolas se agrandan. GFP-SKL se incorpora en vacuolas por autofagia (pexophagy). Debido al hecho de que la GFP es re.......

Discussion

El método aquí presentado permite el estudio conveniente y reproducible de la autofagia en P. chrysogenum. Por ejemplo, puede ser utilizado para el cribado de la eficacia de diversos compuestos si son capaces de modular la respuesta autofagia de este hongo o no. Los resultados con rapamicina demuestran que la inhibición de la señalización de TOR conduce a una inducción pronunciada de la autofagia en P. chrysogenum que también ha sido demostrado para otros organismos ^11.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Portaobjetos de microscopio con cavidad central	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania	H884.1	Se pueden utilizar varias veces después de la limpieza.
Perlas de vidrio	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania	A553.1	Diámetro: 0,25 - 0,50 mm