Imagen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dinámica de Terminales cono fotorreceptor axón de la retina del ratón

Resumen

Se describe un protocolo para supervisar Ca ²⁺ dinámica en los terminales de los axones de los conos utilizando una preparación rebanada ex-vivo de la retina del ratón. Este protocolo permite estudios completos sobre los conos de señalización de Ca2 ⁺ en un importante sistema modelo de mamífero, el ratón.

Resumen

Los conos de la retina (conos) sirven visión diurna y son la base de la discriminación de color. Están sujetos a la degeneración, a menudo conduce a la ceguera en muchas enfermedades de la retina. El calcio (Ca ^2+), un segundo mensajero clave en la señalización de los fotorreceptores y el metabolismo, se ha propuesto para ser indirectamente vinculado con degeneración de los fotorreceptores en diversos modelos animales. Estudiar sistemáticamente estos aspectos de la fisiología y patofisiología de cono ha sido obstaculizado por las dificultades de grabación eléctricamente de estas pequeñas células, en particular en el ratón, donde la retina está dominado por fotorreceptores de los bastones. Para evitar este problema, se estableció una de dos fotones Ca ²⁺ protocolo de imágenes utilizando una línea de ratón transgénico que expresa la codificada genéticamente Ca ²⁺ biosensor TN-XL exclusivamente en conos y puede ser cruzado con modelos de ratón de la degeneración de los fotorreceptores. El protocolo descrito aquí implica la preparación de secciones verticales (R20; rebanadas ") de las retinas de ratones y de imágenes ópticas de los cambios de estímulo-evocó ligeras en cono de Ca ²⁺ nivel. El protocolo también permite "medir durante el corte" de absolutos Ca ²⁺ concentraciones; como las grabaciones pueden ser seguidos por calibración. Este protocolo permite a los estudios sobre las propiedades funcionales de cono y se espera que contribuya a la comprensión de cono de Ca2 ⁺ de señalización, así como la posible participación de Ca ²⁺ en la muerte de los fotorreceptores y la degeneración de la retina.

Introducción

Visión inicia con la activación inducida por la luz de la cascada de fototransducción en los fotorreceptores de la retina. Fotorreceptores de varilla permiten la visión a bajos niveles de luz, mientras que los conos median color y de alta resolución de la visión diurna. Muchos genes específicos-fotorreceptoras son susceptibles a mutaciones que conducen a la degeneración de estas células. Un número de marcadores moleculares asociados con la pérdida de fotorreceptores se han identificado ^1, pero hasta ahora los mecanismos moleculares detallados y la secuencia de eventos siguen sin estar claros. Altered Ca ^{2 +} homeostasis se especuló a ser un desencadenante de la muerte celular de fotorreceptores, una hipótesis apoyada por la sobre regulación de la actividad de Ca ²⁺ proteasas de tipo calpaína dependientes durante el proceso de degeneración ^2,3. Sin embargo, hasta la fecha, esta hipótesis no está respaldada por medidas fisiológicas de Ca ^2+. Las inconsistencias en varios estudios sobre el efecto de los bloqueadores de los canales de Ca ²⁺ en reenfermedades intes- desafiaron aún más la participación de Ca ²⁺ en la muerte celular ^4-6, llamando a métodos para evaluar directamente Ca ²⁺ en los conos de mamíferos.

Anteriormente, la mayoría de la grabación eléctrica y estudios de imágenes de Ca ²⁺ se han realizado en modelos de anfibios y reptiles, debido a la facilidad de acceso a los conos de ^7-9. Sin embargo, la fisiología de los mamíferos fotorreceptor puede ser diferente de la de los no mamíferos ¹⁰ y especialmente, en el contexto de la degeneración de la retina hereditaria humana, una mejor comprensión de la fisiología de los fotorreceptores de mamífero es una clave para el desarrollo de tratamientos innovadores. Muchos modelos de ratones que imitan enfermedades de la retina humanos están disponibles, pero se sabe poco sobre la dinámica de Ca2 ⁺ en los conos de ratones ^11. Técnicas eléctricos no son adecuados para grabaciones de alto rendimiento de conos, en particular, no en ratones, donde varillas (~ 97%) superan en número significativamente conos (~ 3%) ¹² . Por otra parte, las técnicas electrofisiológicas sensibles como la de células enteras patch-clamp grabaciones perturban el medio intracelular y proporcionan datos sobre las corrientes ^de Ca2 ^+, pero no en absoluto intracelulares ^de Ca ^{2 +} concentraciones. Por lo tanto, a pesar de la resolución temporal inferior, la imagen es el método de elección al abordar preguntas sobre cono Ca ²⁺ dinámica. La cuestión clave con imágenes es cómo etiquetar selectivamente los conos con una Ca ^{2 +} colorante indicador fluorescente. Compartimentación adecuada y especificidad celular es difícil de lograr para el "mayor carga" sintético Ca ²⁺ colorantes indicadores en el tejido. Como consecuencia, los conos etiquetados, varillas ^13,14, y las células gliales de Müller no se pueden distinguir de forma fiable. Además, los colorantes sintéticos tienden a filtrarse fuera de las células, impidiendo grabaciones prolongadas en condiciones compatibles. Además, cargando sintéticos Ca ²⁺ indicadores en su forma AM-éster es problemático, ya que requiere dedetergentes (por ejemplo, DMSO) y genera formaldehído ^15. Para absolutos Ca ²⁺ mediciones, indicadores ratiometric son obligatorios. Sin embargo, el mejor indicador radiométrica sintético actualmente disponible Fura-2 requiere luz de excitación en el rango de 700 a 760 nm (para la excitación de dos fotones), que, dependiendo de su intensidad, puede en sí mismo estimular los conos, y así impedir los estudios de cono de Ca ²⁺ dinámica en condiciones de iluminación fisiológicas.

A diferencia de los tintes sintéticos, genéticamente codificados Ca ²⁺ indicadores pueden expresarse de una manera selectiva de tipo celular. Que no se derramen fuera de las células, y por lo tanto, si se evita el blanqueado, mediciones ratiometric prolongados y fiables son posibles. Tipo selectivo celular expresión de Ca ²⁺ biosensores, cuando se combina con la microscopía de dos fotones, representa una poderosa herramienta para evaluar y estudiar subcelular Ca2 ⁺ en condiciones fisiológicas en gran medida ^13,16,17 . Aquí se describe un protocolo para estudiar la luz de estímulo-evocó cono Ca ²⁺ dinámica en un transgénico Ca ²⁺ línea biosensor ratón (HR2.1: TN-XL), que expresa la basada en FRET Ca ²⁺ biosensor TN-XL ¹⁸ selectivamente en conos, bajo la opsina roja promotor HR2.1 humana ^19. Para acceder a los terminales de cono, se empleó una preparación rebanada ex vivo ^20. El protocolo ya fue utilizado con éxito en tres estudios sobre la función de cono en ratones sanos ^10,21,22. Por otra parte, el protocolo permite el estudio de Ca ²⁺ cono de señalización en condiciones genéticas específicas, por ejemplo, mediante el cruzamiento modelos de ratón para la degeneración retiniana hereditaria con HR2.1: ratones TN-XL.

Protocolo

Todos los animales procedimientos se llevaron a cabo la adhesión a las directrices y leyes para la protección de los animales que determine el Gobierno Federal alemán y aprobados por el comité de bienestar de los animales institucional de la Universidad de Tübingen.

1. Modelos Animales

1. HR2.1: TN-XL Ca ²⁺ biosensor ratón
   1. Utilice la HR2.1 transgénico: línea de ratones TN-XL expresar el Ca ²⁺ biosensor TN-XL selectivamente en los conos ^10. Utilice 3-6 semanas de edad ratones de ambos sexos planteado con un estándar de 12 horas día / noche ritmo.

2. Disección de retina

1. Solución fisiológica
   1. Preparar recién 2 L de solución extracelular, que contiene NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, 1 mM _MgCl2, 1,25 mM NaH ₂ PO _4, 26 mM de _NaHCO3, 0,5 mM L-glutamina, y 20 mM (+) glucosa. Mezclar hasta que todos los ingredientes se disuelven.
   2. Solución extracelular "burbuja"con carboxygen (95% O _2, 5% de CO ₂₎ 5 - 10 min. Añadir CaCl ₂ para alcanzar una concentración de 2 mM.
   3. Después de burbujear la solución extracelular, medir su pH. El pH debe ser 7,4, de lo contrario es probable que se han cometido errores durante la preparación de la solución. Mantenga burbujeante tasa y solución a temperatura constante durante todo el experimento para garantizar un pH constante.
   4. Separar el caldo en 2 frascos, uno para la disección de retina y una para la configuración de la grabación (perfusión).
2. Enucleación del ojo y el aislamiento de la retina (5-10 min)
   1. Mantener una iluminación roja tenue en el área de trabajo de enucleación. Utilice LEDs con una longitud de onda máxima de 650 nm (o más) para evitar la decoloración de los conos durante la disección.
   2. Dark-adaptar el ratón durante 2 horas al poner la jaula en una caja a prueba de luz y bien ventilado para asegurar que los conos estén plenamente sensibilizados en el momento de las grabaciones.
   3. Anestesiar el ratón bajo un Laboratocampana ry con isoflurano (5%) usando un vaporizador y un recipiente hermético a los gases que contiene una jaula de ratón estándar. Siga cuidadosamente las instrucciones del fabricante al manipular el vaporizador. Use guantes y mascarilla para reducir la exposición a los alérgenos.
   4. Utilice un microscopio binocular con un 10 - magnificación de 40X para la disección.
   5. Sacrificar el ratón anestesiado por decapitación.
   6. Para orientación, marque la parte superior de cada ojo (= dorsal) con un lápiz resistente al agua. Lleve un registro de si el uso del ojo izquierdo o derecho.
   7. Retire el ojo cuidadosamente usando tijeras curvas cortando el nervio óptico detrás del globo ocular. Para la disección, transferir el globo ocular de una placa de Petri que contiene la solución extracelular recién carboxygenated. Para transferir el globo ocular, sujételo por el tronco del nervio óptico.
   8. Perforar el ojo en cualquier punto a lo largo de la frontera entre la córnea y la esclerótica (es decir, en la ora serrata) con una aguja de inyección agudo.
   9. Sostenga el correoye en la esclerótica con un par de pinzas y suavemente inserte uno tijeras cuchilla en el agujero hecho en el paso anterior. Corte a lo largo de la ora serrata para separar la parte anterior del ojo (córnea, cristalino, el cuerpo vítreo) de la parte posterior (ocular). Cortar la ojera radial (hacia el disco óptico) en la posición de la marca de la pluma para indicar la posición dorsal en la retina.
      Nota: Preparado de esta forma, las ojeras se pueden mantener en solución constantemente carboxygenated para su uso posterior.
   10. Gire el ocular en la placa de Petri tal que el dorsal cortada puntos de distancia de uno mismo. Coge la esclerótica en el lado derecho de la ojera con un par de pinzas izquierda y cada uno mediante la inserción de las puntas de las pinzas entre la retina y la esclerótica.
   11. Separe la retina invirtiendo suavemente la parte escleral del ocular. Finalmente, cortar el nervio óptico utilizando micro tijeras de disección para liberar la retina de la esclerótica.
       Nota: Este es un paso crítico. Evitar daños en la retina (por ejemplo, portocar y apretándolo con pinzas).
   12. Mantenga uno de los bordes de la retina con un par de pinzas y suavemente eliminar los desechos y el cuerpo vítreo de la superficie de la retina utilizando un segundo par de pinzas. Cuando la superficie de la retina está limpio, utilice micro disección tijeras para hacer tres, cortes radiales cortos adicionales (aproximadamente cada 90 °). Estos cortes permiten que uno para aplanar cuidadosamente la retina con la cara hacia abajo de los fotorreceptores en la placa de Petri (Figura 1A).
3. Preparación rebanada (10 - 15 min)
   1. Preparar membranas filtrantes de nitrocelulosa de antemano para la retina rebanar y vidrio cubres de rebanadas de montaje y su transferencia a la cámara de grabación. Cortar la membrana de filtro de nitrocelulosa en aproximadamente 10 x 5 mm piezas rectangulares de tamaño utilizando tijeras. Cortar en trozos rectangulares cubreobjetos aproximadamente 10 x 5 mm de tamaño usando un glasscutter.
   2. Lentamente sumerja un portaobjetos de vidrio en la solución extracelular cercatejido. Con cuidado, tire de la retina en el portaobjetos de vidrio con el lado de las células ganglionares por el acaparamiento de que en el mismo borde usando un par de pinzas. Este proceso reduce el daño mecánico y plegado de tejido.
   3. Elija la región de la retina que se relaciona con la respectiva pregunta de investigación (véase también Discusión). Recuerde, el largo corte hecho en el paso 2.2.9 marca el medio de la retina dorsal (Figura 1A). Cortar un rectangular, aproximadamente 1 x 2 mm de tamaño pedazo fuera de la región de la retina seleccionada utilizando una hoja de bisturí curvo. Limpie el exceso de solución alrededor del tejido.
   4. Coloque la membrana de filtro en la parte superior de la pieza de retina tal que el lado de las células ganglionares se adhiere a la membrana. Inmediatamente, añadir una gota de medio extracelular sobre la membrana para sujetar firmemente el tejido a la membrana.
   5. Transferir el tejido de la retina membrana montado a la cámara de corte que contiene la solución extracelular fresco.
   6. Cortar en rodajas retina verticales de 200 micrasespesor (Figura 1B) usando una cuchilla de afeitar fresco unido a un cortador de tejidos ^23. Cambie la hoja para cada pieza de la retina.
      Nota: La hoja de afeitar necesita ser perfectamente alineada con la superficie del fondo de la cámara de corte de tal manera que toda la membrana se divide simultáneamente, como se indica por un "clic" cuando corte - de lo contrario la cuchilla puede doblar y dañar la rebanada.
   7. Pegue una sola rebanada de membrana montado a un cubre de vidrio mediante la aplicación de grasa de alto vacío a la membrana termina solamente (Figura 1C). Mantenga la superficie del vidrio por debajo de la retina sin grasa.
   8. Mantenga rebanadas cubreobjetos montados en cubiertas por una gota de solución extracelular en la cámara de retención - un recipiente cerrado y a prueba de luz, por ejemplo, una placa de Petri con la tapa cubierta con papel de aluminio - bajo una atmósfera de carboxygen a TA. Introducir carboxygen burbujeando un pequeño depósito de agua para mantener la atmósfera en la celebracióncámara húmeda; esto evita que las rodajas se sequen.
   9. Permitir rebanadas para descansar en la cámara de retención durante 10 - 15 min antes de ellos (uno por uno) que se mueve a la cámara de grabación. Las rebanadas se pueden mantener hasta 4-5 horas en la celebración de la cámara a temperatura ambiente (~ 21 ° C).

3. De dos fotones Ca ²⁺ Imaging

1. Microscopía de dos fotones
   1. Utilice un microscopio Objetivo Movable (MOM) de tipo microscopio de dos fotones. Ambas diseño e imagen procedimientos MAMÁ se describieron anteriormente ^24, para más detalles véase también ^10,21,25 (para fuentes y empresas, véase el cuadro ^1).
      Nota: Cualquier vertical microscopio de dos fotones que cumple los siguientes requisitos mínimos pueden ser utilizados: Tiene que estar equipado con (a) un láser de impulsos sintonizable a ~ 860 nm, (b) un mínimo de dos canales de fluorescencia adquiridas simultáneamente, (c ) Filtros para ECFP y fluorescencia citrino, (d)un estimulador de la luz (para posibles diseños, consulte ^24,26), y (e) de software que permite la grabación de secuencias de imágenes en el tiempo transcurrido a una velocidad suficiente para resolver el Ca ^{2 +} señales de interés.
   2. Iniciar el sistema de imágenes de dos fotones según lo indicado por el fabricante. Se deben seguir estrictamente las pautas de seguridad de láser de la instalación. Inicie el láser y ajustarlo a ~ 860 nm.
   3. Transferir una porción de la cámara de retención de la cámara de grabación y comenzar de inmediato la perfusión con solución extracelular carboxygenated. Mantener una velocidad de flujo de perfusión de 2 ml / min y una temperatura de 37 ° C en la cámara de grabación.
   4. Use un NA objetivo de inmersión en agua 20X 0.95. Si está disponible, utilice una cámara CCD en combinación con un LED debajo cámara de grabación de infrarrojos para localizar el trozo de la retina (Figura 2). De lo contrario localizar rebanada utilizando imágenes de dos fotones (ver 3.1.5).
   5. Cambie a la imagen de dos fotones para ver la expresión de biosensor. Encenderlos dos canales de detección de imágenes de fluorescencia de ECFP y citrino.
   6. Utilice el software de adquisición de imágenes que controla el microscopio de dos fotones para escanear y seleccionar una fila de terminales de cono para la grabación (Figura 3A). Adquisición de imágenes Set de 128 x 16 píxeles (imágenes 31,25 Hz) o una configuración similar. Restringir el área de escaneado a los terminales de cono para evitar el blanqueo de fotopigmentos en segmentos externos.
      Nota: Para el TN-XL sensor de calcio (τ = ~ 0,6 seg para el Ca ^{2 +} vinculante, τ = ~ 0,2 seg para Ca ²⁺ unbinding, véase ¹⁶⁾ una velocidad de fotogramas mínima de ~ 8 Hz se recomienda.
2. Estimulación de luz y grabación
   1. Utilice una subetapa de campo completo estimulador luz como se describe en otro lugar ^10,21,26 para realizar los siguientes pasos.
      Nota: Una solución sencilla para un estimulador luz de campo completo es utilizar dos LEDs filtrada paso-banda (por ejemplo, "azul": 360 BP 12, "verde": 578 BP 10)que coincide con la sensibilidad de longitud de onda de los conos de ratones, pero al mismo tiempo no se solapan con los filtros utilizados para la detección de fluorescencia (cf. 3.2.4). La luz de los LED es enfocada por el condensador a través de la parte inferior de la cámara de grabación (Figura 2). Para más detalles sobre este diseño estimulador, su calibración, las intensidades de luz utilizadas y los conos de fotos tarifas isomerización evocados, ver ^10,21,26.
   2. Encienda el láser y permiten conos para adaptarse al láser de barrido y la luz de fondo de estímulo (20 - 30 seg, consulta peligros potenciales), antes de la presentación de los estímulos de luz (ver 3.2.3) o la aplicación de agentes farmacológicos.
   3. Iniciar presentación de estímulos arbitrarios (por ejemplo, destellos de luz, como se muestra en la Figura 3B, C). En el caso del estimulador descrito en el paso 3.2.1, generar los estímulos mediante la modulación de la intensidad de los dos LEDs en el tiempo utilizando una placa de microprocesador controlado por software personalizado (paradetalles, ver ^10,21,26).
   4. Comience a grabar los dos canales de fluorescencia (por ejemplo, en 483 nm para "azul" FRET donantes ECFP y a 535 nm para "amarillo" FRET-aceptor;. Para las especificaciones ver Tabla 1) al mismo tiempo usando el software de adquisición de imágenes respectiva (véase también 3.1 0.6). Por ejemplo, en el caso de la luz parpadea (Figura 3 B, C), ficha al menos 8 - 10 presentaciones de estímulo (ensayos).
3. Calibración "En-slice" Ca ²⁺
   1. Grabar Ca ^{2 +} señales en terminales de cono (como se describe en 3.1.6 y 3.2.4) y el extracto de la línea de base nivel del Ca2 ⁺ en un conjunto de conos (como se describe en 3.4).
   2. Cambie a "Ca ²⁺ libre" medio extracelular con 5 ionomycin M (disuelto en DMSO) y 10 mM EGTA (o, alternativamente, BAPTA) agregó. Terminales de cono Record de nuevo cada 5 min para determinar la relación de fluorescencia mínima (R _min), es decir, la relación en el (casi) ausencia de Ca2 ⁺ intracelular. Esto puede tomar entre 15 - 30 min.
      Nota: Se requiere un sistema de perfusión que permite cambiar entre los diferentes reservorios.
   3. Cambiar al medio extracelular con 5 ionomycin M (disuelto en DMSO) y 2,5 mM Ca ^2+. Después de un tiempo de incubación de 5 min, conos grabar de nuevo cada 5 min para medir la relación de fluorescencia máxima (R _max), es decir, la relación en presencia de concentraciones de saturación de Ca2 ⁺ intracelular. Después de la aplicación ionomycin, puede tardar entre 3 - 15 min para la relación de Ca ²⁺ a estabilizarse.
      Nota: La exposición de las rodajas a alta Ca ²⁺ y ionomicina durante un período más largo eventualmente dañar las células. Incluir sólo las células en el análisis que conservan su morfología normal. Las concentraciones (es decir, EGTA, ionomicina) pueden necesitar ser adaptados. Para más detalles sobre la calibración de Ca2 ⁺protocolo, consulte ^13,17.
4. Análisis de los datos
   Nota: Utilice un paquete de software de procesamiento de imágenes y análisis de datos compatible con el software de microscopio respectiva y capaz de ejecutar secuencias de comandos de análisis personalizados.
   1. Carga de un archivo de datos de imagen y dibujar regiones de interés (ROI) alrededor de cada terminal de cono (Figura 3A). Para cada trama, la intensidad media de fluorescencia dentro de la ROI y restar la fluorescencia de fondo, antes de calcular la relación (R) entre FRET-aceptor (citrino) y donante (ECFP) de fluorescencia (R = F _A / F _D; Figura 3B, C). Esta relación se suele utilizar como sustituto de la relativa concentración intracelular de Ca2 ^+, pero después de la calibración (véase 3.3), también concentraciones absolutas puede estimarse (ver 3.4.3).
      Nota: Los pedículos pueden ser reconocidos por su ubicación en la capa plexiforme externa y su morfología (algo aplanada "manchas" más pequeño que el conosomata, situado en el extremo del axón cono).
   2. Ensayos de estímulo Promedio (Figura 4a). Extraer parámetros de respuesta de los rastros promediados (Figura 4B), tales como ^{2 +} nivel básico Ca _(base R) antes de la estimulación de luz, amplitud máxima (R _amp), y el área bajo la curva (R _A) como medidas para el tamaño de la respuesta. Además, extraer cinética de la respuesta de las trazas promediados, tales como aumento de respuesta (t _subida) y tiempo de decaimiento (t _decaimiento) (= respectivos intervalos de tiempo entre 20% y 80% de R _amp; véase la ilustración en la Figura 4B). Para más detalles sobre cómo determinar estos parámetros, consulte ^10.
   3. Calcular una estimación de la concentración de Ca2 ⁺ cono absoluta basada en las mediciones de los pasos 3.3.1-3.3.3. Utilice las proporciones de mínima y máxima concentración de Ca2 ^+, R y R _{max min,} respectivamente, la fluorescencia de los donantes en el Ca ²⁺ -bound (F _{D, ligado-Ca)} y -unbound (F _{D, Ca-libre)} del estado, así como la vivo en constante de disociación (K _d = 0,77, ver ¹⁶⁾ para TN-XL con el siguiente la ecuación (análogo a ^27):

Resultados

Al combinar las rebanadas verticales (Figura 1) preparado a partir de HR2.1: TN-XL retina del ratón con la imagen de dos fotones (Figura 2), hemos sido capaces de realizar mediciones radiométricas de luz Ca ^{2 +} señales de estímulo-evocó en terminales de los axones fotorreceptoras cono . Este enfoque representa una mejora significativa en el acceso y la visualización de los conos de ratón sobre los métodos de formación de imágenes ópticas pre-existentes con sintéticos Ca ²⁺ indicadores. Por ejemplo, la expresión de cono específica del Ca radiométrica genéticamente ^{codificado-2+} biosensor TN-XL facilita en gran medida la identificación de terminales de los axones de cono (ver ROIs en la Figura 3A). Por lo tanto, nuestro protocolo elimina el riesgo de señales de grabación de origen poco claro, como por ejemplo las señales "mixtas" con las contribuciones de ambos terminales del cono y axones varilla.

Nuestro enfoque permite la resolución de las respuestas de una sola prueba en el nivel de la individual axón terminal de cono. Extrusión-Light evocado de Ca ²⁺ desde el terminal de cono está marcada por un aumento y una disminución de donante y aceptor de fluorescencia, respectivamente (Figura 3B). Disminución de la relación de fluorescencia (R) corresponde a la extrusión de Ca ²⁺ desde el terminal de cono (Figura 3C), causada por la hiperpolarización inducida por la luz del cono y el posterior cierre de canales de Ca2 ⁺ dependientes de voltaje. Debido a que varios terminales de los axones de cono se pueden monitorizar simultáneamente (Figura 3A), la adquisición de datos es muy eficiente y cientos de respuestas cono Ca ²⁺ puede ser recogido en un solo experimento. Mediante la evaluación de estas respuestas cuantitativamente (Figura 4), ​​de cono Ca ^{2 +} señales pueden ser comparados y evaluados en una gama de condiciones (ver Discusión).

A menudo es suficiente para utilizar la relación entre FRET-aceptor (citrino) y -donor (ECFP) de fluorescencia(F _/ F _D; para más detalles, véase 3.4) como una medida relativa del nivel de Ca2 ⁺ intracelular. Sin embargo, siempre que sea necesario, la relación puede ser calibrado para obtener absolutos intracelulares ^de Ca ^{2 +} concentraciones ([Ca2 ^+]) (Figura 5). En la iluminación de fondo utilizado en este protocolo (para más detalles, véase ¹⁰ y la Figura 3 la leyenda), calibración arrojó una estimación de absoluto reposo [Ca ^2+] en "tipo salvaje" HR2.1: TN-XL terminales del cono de ratón de 243 ± 159 nM (media ± DE), que se encuentra dentro del rango reportado para ratones en la literatura ^11.

Figura 1. Preparación de rodajas de la retina verticales. (A) Aislada y aplanado retina preparado para rebanar. (B) el pedazo rectangular de retina (see cuadro rojo en A) montado en la membrana de papel de filtro (gris oscuro) después de rebanar. (C) Vista superior de la rebanada de la retina membrana montado en fijo sobre un cubreobjetos de vidrio con grasa. (D) Dibujo esquemático de una parte de una porción de la retina (véase el recuadro rojo en C). Fotorreceptores del cono se indican en verde. V ventral,; D, dorsal; N, nasal; T, temporal; OS, segmento externo; ONL, capa nuclear externa; OPL, la capa plexiforme externa; INL, capa nuclear interna; IPL, la capa plexiforme interna; GCL, capa de células ganglionares. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. De dos fotones de imágenes de rebanadas de retina: Ilustración de la configuración de grabación superior:. Agua-inmersión lente objetivo centrar el seram del láser de barrido (flecha hacia abajo de color rojo) en la retina, y la recolección de la fluorescencia emitida (flechas hacia arriba). El objetivo también recoge transmite la luz infrarroja de un LED de iluminación montada debajo del condensador cuando imágenes de la rebanada utilizando una cámara CCD del centro:.. Rebanada de retina montado en la cámara de grabación y perfundido con solución extracelular inferior: lente de condensador enfocar la luz de los LEDs de estimulación (y el LED de infrarrojos para obtener imágenes de la cámara CCD) a través de la parte inferior transparente de la cámara de grabación en el tejido de la retina. IR LED, diodo emisor de luz infrarroja; CCD, dispositivo de carga acoplada; BP, de paso de banda. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Luz-evocarrespuestas d Ca ²⁺ en terminales de los axones de los conos del ratón. (A) Izquierda: Las grabaciones se centró en los terminales sinápticos (caja roja) de los conos (verde) en rebanadas de retina derecha:. Ejemplo para una región grabada con 7 terminales individuales. La fluorescencia se registró utilizando dos canales:. Una para el citrino FRET-aceptor (arriba; 535 BP 50) y uno para el FRET donantes ECFP (abajo; 480 BP 32) (B) los cambios de luz-evocado en citrino (F _A) y ECFP (F _D) registró la fluorescencia en un solo ROI. respuestas (C) Ca ²⁺ (como la relación F _A / F _D) de un terminal de cono a una serie de 1 seg brillantes destellos de luz en intervalos de 5 seg. ROI, región de interés; BP, filtro de paso de banda; F, la intensidad de fluorescencia; au, unidades arbitrarias; FRET, Förster transferencia de energía de resonancia; ECFP, mayor proteína fluorescente cian. La intensidad del estímulo (como ptasa oto-isomerización en 10 ³ · P · s ^-1 por cono.): 13,0 y 12,8 por M y S-opsinas, respectivamente, añadiendo a un nivel de fondo (= LED apagado, escaneo láser de excitación) de ~ 10 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Ejemplar análisis cuantitativo de cono de luz-evocó Ca ^{2 +} respuestas (A) ^de Ca ^{2 +} respuestas-Luz evocado (como? R) de un solo terminal de cono (ensayos individuales: rastros de color gris, n = 16; media:. Rastro negro ) (B) Los parámetros determinados para la media de Ca ^{2 +} respuesta:. Descansar nivel del Ca2 ⁺ _(base R) que representa la línea de base antes de la estimulación de la luz, el tamaño de la respuesta no es area-bajo-la-curva (R _A) y amplitud de pico (R _amp), la cinética de la aparición de la respuesta (t _subida, intervalo de tiempo desde 20% a 80% de R _amp) y el desplazamiento (t _decaimiento, intervalo de tiempo desde 80% al 20% de R _amp). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Estimación de absoluta concentración de Ca ^2+. Descansar concentración de Ca2 ⁺ ([Ca ^{2 +],} como la relación F _A / F _D) registrados en terminales de los axones 8 cono en un ratón TN-XL (círculos, con una media ± DE) para diferentes soluciones extracelulares: dos veces en medio extracelular estándar (Ctrl 1 y 2), a continuación, con un mínimo ("cero") [Ca ^{2 +]} (mM EGTA 10) und con alta [Ca ^{2 +]} (2,5 mM), las dos últimas condiciones en presencia de 5 mM ionomycin equilibrar extracelular e intracelular de Ca ^2+. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Protocolos preexistentes utilizando grabaciones unicelulares electrofisiológicos o Ca ^{2 +} de imágenes con indicadores fluorescentes sintéticos luchan para grabar los Ca ²⁺ dinámica en los conos de ratones por un número de razones técnicas (véase la Introducción). El protocolo descrito aquí permite la medición de Ca ^{2 +} señales e incluso absolutos niveles de Ca2 ⁺ en las terminales individuales, identificadas cono ratón en una forma eficiente y relativamente simple.

Este protocolo ya ha sido utilizado con éxito en tres estudios abordar diferentes aspectos de la función de cono en la retina del ratón sano. En el primer estudio ^10, el HR2.1: ratón TN-XL se caracterizó mediante inmunohistoquímica, grabaciones ERG, de dos fotones de Ca ^{2 +} de imágenes, y la farmacología, demostrando que la expresión de cono específica del Ca ²⁺ biosensor no entorpezca la anatomía y función de cono. En el segundo estudio ^21, cromáticoy propiedades de respuesta acromáticos de conos de ratones fueron asignadas a través de la retina, lo que demuestra las diferencias notables en función del cono entre el dorsal "verde" opsina dominada y el "azul" retina del ratón ventral opsina dominada. Estas diferencias regionales en las propiedades de cono acertaron la distribución diferencial de contraste en el medio ambiente natural (es decir, cielo vs. suelo), lo que sugiere que los diferentes tipos espectrales de los conos de ratón proporcionan para (cerca) de muestreo óptimo de contrastes acromáticos y, por tanto, puede ofrecer una ventaja evolutiva. En el tercer estudio ²² la retroalimentación recíproca que terminales de los axones cono reciben de células horizontales se investigó. Como todos los mecanismos de retroalimentación celular horizontal propuestas actúan sobre canales de Ca2 ⁺ dependientes de voltaje en los terminales de los axones de cono ^28, terminal de cono de Ca2 ⁺ puede servir como sustituto de la horizontal interacciones célula a cono. El estudio de Kemmler y compañeros de trabajo ²² soportesla opinión de que las células horizontales utilizan un sistema de retroalimentación complejo que comprende varios mecanismos para controlar la liberación de glutamato fotorreceptor.

Estos estudios ilustran la versatilidad del protocolo descrito y muestran que se puede adaptar a una amplia gama de cuestiones relativas a la función de cono y sus circuitos sinápticos. Además, el protocolo permite el estudio de la señalización local de Ca ²⁺ en los diferentes compartimentos de cono, hacia una mejor comprensión de la fisiología de cono. Tal conocimiento es importante entender los procesos fisiopatológicos en los conos en degeneración, para permitir finalmente para el desarrollo racional de los enfoques terapéuticos potenciales, en particular para las enfermedades degenerativas que afectan a los conos.

En el HR2.1: línea de ratón TN-XL, el Ca ²⁺ biosensor se expresa en todo el cono, con la excepción del segmento exterior. Esto proporciona una oportunidad para la evaluación directa y radiométrica de Ca ²⁺ dinámicas en diferentes compartimentos de cono. Dado que los cambios en Ca ²⁺ corrientes en el segmento exterior se reflejan en los terminales a través del potencial de membrana y la activación resultante de canales de Ca2 ⁺ dependientes de voltaje, los procesos en el segmento exterior se pueden observar indirectamente.

Peligros potenciales:

La disección de la retina es un paso crítico: En el ratón, la retina se separa de la ojera por lo general entre los segmentos externos de los fotorreceptores y el epitelio pigmentario. Por lo tanto, los segmentos externos de los fotorreceptores sensible a la luz de la retina aislada se exponen y extremadamente sensibles a los daños mecánicos. Gran cuidado se debe tomar para no dañar al tocar el lado de los fotorreceptores con herramientas o moviendo el tejido de lado sobre una superficie adhesiva (por ejemplo, una membrana de filtro).

Rebanadas de retina de alta calidad pueden ser reconocidos bajo el microscopio por su superficie de corte limpio ypor una capa de fotorreceptores bien organizado con segmentos externos claramente definidos. Valoración funcional de la calidad rebanada se puede hacer rápidamente mediante el parpadeo luminoso estímulos luminosos y determinar el porcentaje de conos sensibles (por ejemplo, en un campo de visión con 10-20 conos). Aquí, la calidad de respuesta debe ser evaluada mediante el cálculo de la relación señal-ruido (S / N) (amplitud del ruido de la línea de base antes de que el estímulo de luz frente a la amplitud de la respuesta de la luz); un S / N 2 - 3, debería considerarse como el umbral mínimo. Típicamente, descartamos rebanadas con menos de 50% conos sensibles. También rebanadas con conos que muestran el comportamiento clavar espontánea excesiva (vea la Figura 4 en ¹⁰⁾ debe ser descartado.

Rebanadas de la cámara de registro que cumplan los criterios anatómicos y funcionales antes mencionados muestran respuestas consistentes para 1 - 2 horas (para más detalles sobre la consistencia de respuesta, consulte ^10). Debido a que las rebanadas sobreviven por hnuestra en la cámara de contención, un experimento exitoso puede durar hasta 6 horas. Es de destacar que hay algunas restricciones con respecto a estudiar a largo van interacciones espaciales entre conos y células horizontales, como rebanar rompe inevitablemente conexiones laterales en las redes de la retina. Sin embargo, aumentar el espesor de las rebanadas de la retina a 300 micras aminora esta cuestión ^22.

El uso de las rebanadas de la retina verticales evita la exploración de los segmentos externos de cono sensible a la luz por el láser de excitación y, por lo tanto, impide en gran medida de blanqueo opsina (para una extensa discusión, ver ^10,21). Sin embargo, los grabados de Ca ^{2 +} señales no sólo dependen de los estímulos de luz, sino que también se vea afectado por un componente de iluminación de fondo generado por el láser de excitación de exploración. De hecho, la efectiva iluminación de fondo en este tipo de experimentos de imagen de dos fotones es una combinación de luz láser dispersa, luz fluorescente emitida por la oficina registradalls, y cualquier componente del fondo de estímulo LED. Por lo tanto, los conos se debe permitir que adaptarse durante al menos 20 - 30 s a de escaneo láser (con el componente de fondo del estímulo luminoso activado) antes de la grabación.

Ventajas y aplicaciones:

Mientras que algunas aplicaciones para este cono Ca ²⁺ protocolo -Imagenología se han descrito anteriormente ^10,21,22, otras aplicaciones pueden preverse: Los estudios farmacológicos en combinación con el cono Ca ^{2 +} de imágenes puede validar Ca ²⁺ vías de señalización en los conos y podrían ser utilizado para probar la eficacia y la potencia de las drogas dirigidas a los diferentes actores en el Ca ²⁺ para señalización ^10. Sin embargo, una aplicación de clave puede ser para estudiar las enfermedades que afectan la función de cono. Muchos modelos de la degeneración de la retina de ratones que imitan enfermedades humanas están disponibles. Por ejemplo, la pérdida de fotorreceptores del cono 1 (CPFL 1) ratón es un cono principal modelo de degeneración sufrimientode una mutación Pde6c ^29. Por el contrario, la degeneración de la barra 1 (rd 1) ratón sufre una mutación PDE6B. Si bien esto hace que la barra principal de fotorreceptores degeneración ^30, una vez que se completa rd 1 derrota varilla, juegos de degeneración de cono secundaria en ^1. Cruzamiento estos animales con el HR2.1: Línea TN-XL permitirá que el estudio y la comparación de Ca2 ⁺ dinámica tanto en la degeneración cono de primaria y secundaria y es probable que proporcione información valiosa sobre el papel de Ca ²⁺ durante la muerte celular cono. También, inducida farmacológicamente degeneración cono - por ejemplo el uso de inhibidores selectivos de la PDE6 - puede servir para identificar los mecanismos intermedios de ^10,29,31 degeneración cono.

En resumen, el protocolo descrito aquí permite la medición de Ca ²⁺ en compartimentos subcelulares de conos fotorreceptores ratón y presenta grandes oportunidades para descubrir la fisiología cono bajo una amplia gamade las condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. Adicionalmente, este protocolo puede utilizarse para el cribado de agentes farmacológicos diseñados para interferir con el cono Ca ^{2 +} -señalización y así ayudar a establecer nuevas terapias para las enfermedades de cono.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Grasa de alto vacío	Dow Corning	1018817	http://www.dowcorning.com
Cubreobjetos	R. Langenbrinck		24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com
Portaobjetos de vidrio	R. Langenbrinck		76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com
Cuchillas para picadora de tisú	MARTOR KG	ARGENTAX Nº 1044	0,25 mm; http://www.martor.de
Picadora de pañuelos	Hecho a medida Basado		en un diseño de F. Werblin23, adaptado por T. Schubert
Membrana filtrante de nitrocelulosa rejilla	Merck Millipore	AABG01300	Tipo de filtro: 0,8 y micro; m; http://www.emdmillipore.com
Isoflurano CP	CP pharma	AP/DRUGS/220/96	http://www.cp-pharma.de
UV/verde Estimulador de campo completo basado en LED	Hecho		a medida para más detalles, ver10
Placa de microprocesador de código abierto	Arduino		http://www.arduino.cc
Software de imagen CfNT	Escrito		a medida desarrollado por Michael Mü ller, MPI para la Investigación Médica, Heidelberg, Alemania
IgorPro	Wavemetrics		http://www.wavemetrics.com
VC3-4 Sistema de perfusión focal	ALA Instrumento Científico		con 100 μ colector de punta de diámetro m; http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Láser de zafiro)	Newport Spectra-Physics		http://www.spectra-physics.com
Microscopio de objetivo móvil (MOM), Diseñado por W. Denk, MPImF, Heidelberg, Alemania	Sutter Instruments		http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
[header]
XLUMPlanFL 20X/0.95w objetivo	Olympus		http://www.olympusamerica.com
Vaporizador 100 series	Surgivet		http://www.surgivet.com
Ionomicina, Sal de calcio	Life technologies	I24222	http://www.lifetechnologies.com
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	https://www.sigmaaldrich.com
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	101191250	http://www.sigmaaldrich.com
Leica MZ95	leica microsystems		http://www.leica-microsystems.com/