Artículo de método

Las pruebas para detectar olor Discriminación y habituación en ratones

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DOI:

10.3791/52615

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5 de mayo de 2015

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1Institute of Biomedical Studies, Baylor University, 2Department of Psychology and Neuroscience, Baylor University

En este artículo

Resumen

Este manuscrito describe un protocolo para examinar el sistema olfativo de los roedores. La prueba de habituación/deshabituación olfativa permitirá a los investigadores determinar si un ratón se habitúa a un olor presentado repetidamente y si el ratón demuestra deshabituación cuando se le presenta un olor nuevo.

Resumen

Este video muestra una técnica para establecer la presencia de un sistema olfativo que funciona normalmente en un ratón. La prueba ayuda a determinar si el ratón puede discriminar entre olores no sociales y olores sociales, si el ratón se habitúa a un olor presentado repetidamente y si el ratón demuestra deshabituación cuando se le presenta un olor nuevo. Dado que muchas pruebas de comportamiento social miden la respuesta del animal de experimentación a un ratón conocido o nuevo, los falsos positivos pueden evitarse estableciendo que los animales pueden detectar y discriminar entre olores sociales. Existen consideraciones similares en las pruebas de aprendizaje, como el condicionamiento del miedo, que utiliza el olor para crear un entorno novedoso o las señales olfativas como estímulo asociativo. Los déficits en el sistema olfativo afectarían la capacidad de distinguir entre contextos y de formar una asociación con una señal olfativa durante el condicionamiento del miedo.

En la prueba de habitación/deshabituación de olores, al ratón se le presentan repetidamente varios olores. Cada olor se presenta tres veces durante dos minutos. El investigador registra el tiempo de olfateo dirigido hacia el olor como medida de la respuesta olfativa. Un ratón típico muestra una disminución en la respuesta al olor a lo largo de presentaciones repetidas (habituación). A continuación, el experimentador presenta un nuevo olor que provoca un aumento del olfato hacia el nuevo olor (deshabituación). Después de la presentación repetida del nuevo olor, el animal vuelve a mostrar habituación. Este protocolo implica la presentación de agua, dos o más olores no sociales y dos olores sociales. Además de reducir los factores de confusión experimentales, esta prueba puede proporcionar información sobre la función de los sistemas olfativos de las nuevas líneas de ratones knockout, knock-in y knockout condicionales.

Introducción

Los ratones son dependientes de olfato para navegar nuevos entornos, la búsqueda de alimentos, para el reconocimiento de otras personas, y el comportamiento sexual 1-3. Es esencial que los investigadores determinar si o no los animales experimentales tienen un sentido del olfato funcionamiento antes de la administración de las pruebas de comportamiento que implican la comida, la interacción social, o cualquier olor destinadas a provocar una respuesta desde el ratón. La anosmia o la incapacidad para distinguir entre diferentes olores, podría dar lugar a falsos positivos o negativos en una amplia variedad de paradigmas de comportamiento, por lo que la capacidad de un ratón para detectar y distinguir los olores se deben establecer antes de realizar otros tipos de pruebas de comportamiento.

La prueba de habituación / deshabituación olfativa fue descrita por primera vez en la década de 1980 4. La prueba ha sido adaptado para su uso en los ratones por los Dres. Mu Yang y Jacqueline Crawley 5. Esta es una prueba sencilla y de bajo costo que permite al investigador thisblecer que un ratón puede detectar y diferenciar entre los olores. Además de probar el olfato, esta prueba permite al investigador para observar el comportamiento general del ratón y debe hacerse temprano en un régimen de pruebas. Observaciones cualitativas respecto a la locomoción del ratón, los signos de ansiedad, nivel de actividad, y la respuesta a los olores sociales frente a los olores de los alimentos puede ser señal de nuevas áreas en las que la prueba podría llevarse a cabo.

En esta prueba, hisopos de algodón humedecido en varios olores se presentan a un ratón de tres veces seguidas. Con cada presentación repetida de un olor, el ratón se habitúan a la esponja de algodón, gastando menos tiempo a investigar con cada presentación posterior. Cuando se presenta un nuevo olor, deshabituación ocurre, y un ratón típico pasar más tiempo investigando el hisopo, lo que indica que puede discriminar entre los olores actuales y los anteriores 5. Esta prueba se administra a un ratón en un momento e incluye un acc 45 minperiodo limation seguido por 45 min de la prueba.

Aunque esta prueba es fácil de llevar a cabo que se puede utilizar para investigar cuestiones sofisticadas sobre el sistema olfativo del ratón. Otras pruebas populares del olfato, como la prueba de alimentos enterrados, simplemente establecer la presencia o ausencia de la anosmia. Sin embargo, la prueba de discriminación y la habituación olfativa permite al investigador determinar que un ratón no sólo tiene la capacidad de detectar olores pero puede discriminar entre diferentes olores. El patrón de habituación y deshabituación se ha utilizado para establecer que los nuevos mutantes pueden discriminar entre los olores 6,7. En un estudio sorprendente, Fadool y sus colegas utilizaron mezclas complejas de olores para mostrar que los ratones con deleción del gen de orientación del canal Kv1.3 son "súper smellers" que pueden discriminar olores muy similares mejor que los ratones normales 8.

Al examinar un nuevo modelo de ratón knockout es útil establish la presencia de un comportamiento normal para tareas sensoriales básicos. Cuando se hace temprano en un régimen de pruebas, la discriminación de olores y prueba de habituación da un investigador la oportunidad de observar cualquier comportamiento inusual. Estas observaciones podrían evitar resultados positivos o falsos negativos en las pruebas posteriores que son atribuibles a la confusión características del mutante. Como investigadores continúan investigando el comportamiento social la necesidad de verificar la función olfativa básico será cada vez más importante. Además de examinar el olfato en líneas mutantes, esta prueba se puede utilizar para abordar cuestiones específicas, como si un tratamiento farmacológico aumenta específicamente la respuesta de un animal a los estímulos de olor sociales o si aumenta su respuesta a todos los estímulos de olor.

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Protocolo

Los ratones machos adultos utilizados en el experimento siguiente se generaron y se alojaron en la Universidad de Baylor en una temperatura ambiente de 22 ° C, con una luz de 14 horas y 10 horas oscuridad (20:00-6:00 hr) ciclo diurno. Los ratones tuvieron acceso ad libitum a comida y agua. Todos los procedimientos a los ratones estaban en el cumplimiento de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y el protocolo de animales fue aprobado por la Universidad de Baylor Cuidado de Animales y el empleo Comisión. Los ratones se pusieron a prueba en el final de la mañana / tarde. Para todos los procedimientos a continuación el investigador debe usar guantes para eliminar olores y evitar la contaminación.

1. Preparación de olores no sociales

  1. Preparar los olores no sociales frescas cada día de la prueba.
    Nota: El investigador debe utilizar guantes para preparar los olores.
    1. Rellene 3 tubos de centrífuga con 10 ml de agua cada uno.
    2. Pipetear 100 l de extracto de plátano en un 15 ml & #160; tubo cónico y 100 l de extracto de almendra en un segundo tubo cónico de 15 ml para una dilución 1: 100.
      Nota: El tercer tubo 15 ml sólo contendrá agua.

2. Preparación de los olores Sociales

  1. Preparar olores sociales frescas en las pruebas de la mañana va a producir. Obtener olores sociales a partir de dos jaulas que no han sido limpiados por lo menos durante tres días, y contener un número igual de ratones. Obtener olores sociales de los ratones del mismo sexo que el sujeto de la prueba.
    Nota: Estos son para ser almacenado a temperatura ambiente y se deben utilizar dentro de 4-6 horas para mantener el olor fuerte y consistente.
    1. Determinar cuántos se va a crear el olor sociales hisopos de algodón necesitan: cada ratón está probando se presentará con tres hisopos de olor sociales 1, y tres de olor sociales 2.
    2. Preparar olores sociales frotando un hisopo de algodón en forma de zigzag a través de la parte inferior de una jaula sucia. Agitar el exceso de ropa de cama de aferrarse a la punta.
    3. Hisopos de las tiendas en grandes frascos de vidrio con tapa o en vasos cubiertos con parafilm. Designar un contenedor para el olor sociales 1 y un segundo para el olor sociales 2.
  2. Mantener las jaulas de origen olor fuera de la sala de pruebas experimentales.

3. Aclimatación del ratón de prueba

  1. Póngase los guantes y pesar el ratón para ser probado y colocar individualmente en una jaula limpia con una tapa de alambre en la parte superior y la botella de agua eliminada.
  2. Deje que el ratón para aclimatarse a la nueva jaula durante 45 minutos en una habitación aparte de la sala de pruebas. Asegúrese de que no hay olores extraños o ruidos en la habitación.
  3. Como prueba dura aproximadamente 45 minutos, escalonar los tiempos de aclimatación al poner el ratón junto a ensayar en una jaula limpia para aclimatarse a la derecha antes de probar el ratón actual.

4. Preparación de la sala de pruebas

  1. Coloque los hisopos de algodón fresco, cinta de laboratorio, las botellas que contienen hisopos de olores sociales, los tubos de nin sociales olores, una micropipeta, dos temporizadores, y una botella de residuos con una tapa en la sala de pruebas.
  2. Asegúrese de que la sala de pruebas está razonablemente libre de olores, ruidos fuertes, y de luz brillante. No use colonias o lociones perfumadas.
    Nota: El observador no debe ser la goma de mascar o caramelos durante el período de pruebas y debe tratar de limitar su exposición a fuertes alimentos de olor.

5. Procedimiento de prueba

  1. Traiga el ratón ambientada en su jaula en la sala de pruebas y colocar la jaula en el mostrador a una altura que sea cómoda para su visualización mientras está sentado.
  2. Presentar cada olor 3 veces seguidas durante 2 minutos cada vez. Utilice el orden de presentación que se pueden encontrar en la Tabla 1.
    1. Pipeta 50 l de odorizante en el olor a ensayar a la punta del hisopo de algodón y re-cap la fuente de olor. Levante la parte superior de la jaula de alambre e inserte el extremo sin perfume, de madera de la torunda en la abertura de la botella de agua, empujandog la longitud a través de la parte inferior del cable a la parte superior. Evite tocar la punta de algodón para cualquier cosa, incluyendo los dedos, de modo que se evite la contaminación de olores.
    2. Continuar para dibujar el hisopo a través de la abertura de la botella de agua hasta aproximadamente 1 pulgada del extremo de algodón cuelga hacia abajo en la jaula. Colocar el extremo de madera de la torunda hacia un lado de la jaula usando cinta de laboratorio.
      Nota: Tenga cuidado de no dejar caer la tapa de nuevo en la jaula, provocando un fuerte ruido que perturbe el ratón prueba.
    3. Inmediatamente comenzará la sincronización durante 2 min. Use un temporizador para medir el tiempo de la presentación de 2 minutos. Registre el tiempo acumulado pasado oler el olor durante el juicio 2 min. Cuente comportamiento inhalación del animal utilizando un cronómetro separado. Sniffing activo se define cuando la nariz del animal se orienta hacia la punta de algodón con su nariz ~ 2 cm o más cerca de la punta.
    4. Tras la finalización de cada ensayo, levantar la tapa de alambre y retire el hisopo de algodón tirando de él hacia abajo a través de la ONUlado inferior de la tapa (esto evita la contaminación de olores mediante la prevención de la punta de algodón de tocar el cable). Sellar el hisopo utilizado en botella de residuos de 500 ml.
    5. Preparar e insertar la siguiente hisopo y comenzar la sincronización. Deje aproximadamente 1 minuto entre cada intervalo entre ensayos. Continúe hasta que cada aroma se ha presentado tres veces seguidas, durante 2 minutos cada vez.
  3. Una vez que el ratón se ha completado todos los ensayos, vaciar la botella de residuos que contienen los hisopos de algodón usados ​​en un bote de basura fuera de la sala de ensayo. Devuelva el ratón a su jaula.

6. Análisis

  1. Analizar los datos para cada grupo por condición olor usando ANOVA de dos vías seguido de Newman-Keuls o una prueba post hoc similar para determinar la habituación significativa (menos tiempo olfateando sucesivas mismos olores), y dishabitutation (más tiempo olfateando un nuevo olor).

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Resultados

Siguiendo el protocolo descrito, los resultados se registraron utilizando diez adultos (día postnatal 90-120) macho C57BL / 6J y ocho macho cepa FVB mixta de fondo (día postnatal 50-70). La prueba se llevó a cabo por un solo investigador a través de múltiples días. Cada punto en los gráficos representa el tiempo medio dedicado a investigar un olor.

Cuando el hisopo de algodón humedecido en agua se introdujo por primera vez, los ratones pasan una gran cantidad de tiempo investigando esta nove...

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Discusión

Los resultados proporcionados en este documento son óptimas para los ratones. Los ratones muestran una fuerte respuesta a un nuevo olor, a continuación, se habitúan rápidamente. Uno de los pasos clave en este método es la preparación de los olores. El investigador tiene que tener mucho cuidado para aislar los olores entre sí para evitar la contaminación. Otro aspecto clave es la presentación de la esponja de algodón. El investigador tiene que solucionar la mejor ubicación de la punta de algodón por lo que el ratón puede...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo está respaldado por una beca del Consejo de Investigación de la Universidad de Baylor y por una beca de investigación de la Fundación para la Epilepsia.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Jaula para ratonesAllentownJaula
Tapa de alambreAllentownBCU Mouse WBL 2500
Ropa de camaHarlan7090 Sani-Chips
Bastoncillos de algodónVWR89031-270Mango de madera de 6"
Extracto de plátanoMcCormick
Extracto de almendraMcCormick
Cinta de laboratorioVWR89098-062
CronómetroVWR62374-000
Guantes de nitriloVWR82026
Dispositivo de cronometrajeVWR61161-350
Tubos cónicos de 15 mlVWR89003-294
Vasos de precipitados de 2 L Pyrex1003
ParafilmParafilmPM-9924" x 250'
Botella de 1 L con tapónVWR89000-240
para ratones estándar

Referencias

  1. Doty, R. L. Odor-guided behavior in mammals. Experientia. 42, 257-271 (1986).
  2. Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm Behav. 46, 247-256 (2004).
  3. Keverne, E. B. Importance of olfactory and vomeronasal systems for male sexual function. Physiol Behav. 83, 177-187 (2004).
  4. Gregg, B., Thiessen, D. D. A simple method of olfactory discrimination of urines for the Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. Physiol Behav. 26, 1133-1136 (1981).
  5. Yang, M., Crawley, J. N. Simple behavioral assessment of mouse olfaction. Curr Protoc Neurosci. Chapter 8 (Unit 8 24), (2009).
  6. Pan, Y. W., Kuo, C. T., Storm, D. R., Xia, Z. Inducible and targeted deletion of the ERK5 MAP kinase in adult neurogenic regions impairs adult neurogenesis in the olfactory bulb and several forms of olfactory behavior. PLoS ONE. 7, e49622(2012).
  7. Wesson, D. W., Levy, E., Nixon, R. A., Wilson, D. A. Olfactory dysfunction correlates with amyloid-beta burden in an Alzheimer's disease mouse model. J Neurosci. 30, 505-514 (2010).
  8. Fadool, D. A., et al. Kv1.3 channel gene-targeted deletion produces 'Super-Smeller Mice' with altered glomeruli, interacting scaffolding proteins, and biophysics. Neuron. 41, 389-404 (2004).
  9. Arakawa, H., Arakawa, K., Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Scent marking behavior in male C57BL/6J mice: sexual and developmental determination. Behav Brain Res. 182, 73-79 (2007).
  10. Baum, M. J. Sexual differentiation of pheromone processing: links to male-typical mating behavior and partner preference. Horm Behav. 55, 579-588 (2009).
  11. Ferguson, J. N., et al. Social amnesia in mice lacking the oxytocin gene. Nat Genet. 25, 284-288 (2000).
  12. Yang, M., et al. Low sociability in BTBR T+tf/J mice is independent of partner strain. Physiol Behav. 107, 649-662 (2012).
  13. Best, J. D., et al. Non-associative learning in larval zebrafish. Neuropsychopharmacology. 33, 1206-1215 (2008).
  14. Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2011).
  15. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nat Methods. 11, 629-632 (2014).

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