Biofuncionalizadas prusiana nanopartículas azul para Multimodal Molecular Aplicaciones de imágenes

Summary

Este protocolo describe la síntesis de nanopartículas biofuncionalizadas de azul de Prusia y su uso como agentes de imagen molecular multimodales. Las nanopartículas tienen un diseño de núcleo-carcasa en el que los iones de gadolinio o manganeso dentro del núcleo de la nanopartícula generan contraste de resonancia magnética. La cubierta biofuncional contiene fluoróforos para la obtención de imágenes de fluorescencia y ligandos dirigidos para la orientación molecular.

Abstract

Multimodal, la imagen molecular permite la visualización de los procesos biológicos a resoluciones celulares, subcelulares, ya nivel molecular utilizando múltiples técnicas de imagen complementarias. Estos agentes de formación de imágenes facilitan la evaluación en tiempo real de las vías y mecanismos in vivo, que mejoran tanto la eficacia diagnóstica y terapéutica. En este artículo se presenta el protocolo para la síntesis de nanopartículas azul de Prusia biofuncionalizadas (PB PN) - una nueva clase de agentes para su uso en aplicaciones de imágenes multimodales, molecular. Las técnicas de imagen incorporados en el nanopartículas, imágenes de fluorescencia y la resonancia magnética (MRI), tienen características complementarias. Los PN PB poseen un diseño de núcleo-corteza donde gadolinio y iones de manganeso incorporados dentro de los espacios intersticiales de la red PB generan contraste MRI, tanto en _T1 y _T2 y secuencias. Los PN PB están recubiertas con avidina fluorescente usando electrostática auto comoblea, que permite imágenes de fluorescencia. Las nanopartículas recubiertas con avidina se modifican con ligandos biotinilados que confieren posibilidades de marketing moleculares a las nanopartículas. La estabilidad y la toxicidad de las nanopartículas se miden, así como sus capacidades de relajación de MRI. Las capacidades de imágenes multimodales, moleculares de estas biofuncionalizadas PN PB luego se demostraron utilizándolos para imágenes de fluorescencia y resonancia magnética molecular in vitro.

Introduction

La imagen molecular es la visualización no invasiva y precisa de los procesos biológicos a nivel celular, subcelular, y los niveles moleculares ^1. La imagen molecular permite un espécimen a permanecer en su microambiente nativo mientras que sus vías y mecanismos endógenos son evaluados en tiempo real. Típicamente, la imagen molecular implica la administración de un agente de imagen exógeno en forma de una pequeña molécula, macromolécula, o nanopartículas para visualizar, objetivo, y trazar procesos fisiológicos pertinentes se está estudiando ^2. Las diversas modalidades de imagen que se han explorado en imagen molecular incluyen MRI, CT, PET, SPECT, ultrasonido, photoacoustics, espectroscopia Raman, la bioluminiscencia, la fluorescencia y microscopía intravital ^3. Multimodal de imágenes es la combinación de dos o más modalidades de imagen donde la combinación mejora la capacidad de visualizar y caracterizar diversos procesos y eventos ⁴ biológicos. Multimodal de imágenes explota las ventajas de las técnicas de formación de imágenes individuales, mientras que la compensación de sus limitaciones individuales ^3.

En este artículo se presenta el protocolo para la síntesis de nanopartículas azul de Prusia biofuncionalizadas (PB PN) - una nueva clase de agentes de imágenes multimodales, molecular. Los PN PB se utilizan para obtener imágenes de fluorescencia y resonancia magnética molecular. PB es un pigmento que consiste de la alternancia de hierro (II) y hierro (III) átomos en una red cúbica centrada en las caras (Figura 1). La celosía PB se compone de ligandos cianuro lineales en una Fe ^II - CN - vinculación Fe ^III que incorpora cationes para equilibrar las cargas dentro de su red tridimensional ^5. La capacidad de PB incorporar cationes en su celosía se explota mediante la carga por separado gadolinio y iones de manganeso en los PN PB para el contraste de resonancia magnética.

La razón fundamental para la consecución de un diseño de nanopartículas para el contraste RM es debidolas ventajas de este diseño ofrece en relación con los agentes de contraste MRI actuales. La gran mayoría de agentes de contraste MRI aprobados por la FDA de Estados Unidos son quelatos de gadolinio que son paramagnéticos en la naturaleza y proporcionan contraste positivo por el mecanismo de relajación ^6,7,8-spin celosía. En comparación con un solo gadolinio-quelato que proporciona baja intensidad de señal por sí mismo, la incorporación de múltiples iones de gadolinio dentro de la red PB de las nanopartículas proporciona una mayor intensidad de la señal (contraste positivo) ^3,9. Además, la presencia de múltiples iones de gadolinio dentro de la red PB aumenta la densidad de espín general y la magnitud de paramagnetismo de las nanopartículas, que perturba el campo magnético local en su vecindad, generando de ese modo contraste negativo por el mecanismo de relajación espín-espín. Así, las nanopartículas que contienen gadolinio funcionar tanto como T ₁ (positivo) y T ₂ agentes de contraste (negativo) ^10,11.

En un subgrupo de pacientes con insuficiencia renal, la administración de agentes de contraste con gadolinio se ha relacionado con el desarrollo de fibrosis sistémica nefrogénica ^{8,12, 13.} Esta observación ha llevado a investigaciones sobre el uso de iones paramagnéticos alternativos como agentes de contraste para MRI. Por lo tanto, el diseño versátil de las nanopartículas está adaptado para incorporar iones de manganeso dentro de la red PB. Similar a gadolinio quelatos, manganeso quelatos también son paramagnéticos y se utilizan normalmente para proporcionar una intensidad de señal positiva en la RM ^7,14. Al igual que con gadolinio PB PN, las PB PN contienen manganeso también funcionan como T ₁ (positivo) y T ₂ agentes de contraste (negativo).

Para incorporar capacidades de formación de imágenes de fluorescencia, la nanopartícula "núcleos" se recubren con una cáscara "biofuncional" que consiste en la avidina marcada con fluorescencia-glicoproteína (Figura 1). Avidina no sólo permite imágenes de fluorescencia, sino que también sirve como una plataforma de acoplamiento para ligandos biotinilados que se dirigen a las células y tejidos específicos. La unión de avidina-biotina es una de las más fuertes enlaces conocidos, no covalentes caracterizadas por extremadamente fuerte afinidad de unión entre avidina y biotina ^15. La unión de ligandos biotinilados a la avidina-revestido PB PN confiere posibilidades de marketing moleculares a los PN PB.

La motivación para la búsqueda de imágenes de fluorescencia y MR usando PB PN se debe a que estas técnicas de imagen poseen características complementarias. Imágenes de fluorescencia es una de las técnicas de imagen molecular óptica más utilizado, y permite la visualización simultánea de múltiples objetos a altas sensibilidades ^1,16,17. Imágenes de fluorescencia es una modalidad segura, no invasiva, pero se asocia con bajas profundidades de penetración y resoluciones espaciales ^1,3,16. Por otro lado, MRI genera un alto temporald resolución espacial de forma no invasiva y sin necesidad de radiación ionizante ^1,3,16. Sin embargo MRI sufre de baja sensibilidad. Por lo tanto, imágenes de fluorescencia y la RM fueron seleccionadas como las técnicas de imagen molecular, debido a sus características complementarias de penetración de profundidad, sensibilidad y resolución espacial.

En este artículo se presenta el protocolo para la síntesis y biofuncionalización de los PN PB, PB PN (GdPB), y que contiene gadolinio-PB PN (MnPB) ^10,11 que contiene manganeso. Los siguientes métodos se describen: 1) medición del tamaño, la carga y la estabilidad temporal de las nanopartículas, 2) Evaluación de la citotoxicidad de las nanopartículas, 3) de medición de relaxividades MRI, y 4) la utilización de las nanopartículas para la fluorescencia y la RM molecular de una población de células diana in vitro. Estos resultados demuestran el potencial de los NPs para uso como agentes de formación de imágenes multimodales, moleculares in vivo.

Protocol

1. Síntesis de PB PN, GdPB y MnPB

Síntesis de las nanopartículas (PB PN, GdPB o MnPB) se consigue utilizando un esquema de síntesis en un solo recipiente realizando los pasos que se detallan a continuación:

1. Prepare la solución de 'A' que contiene 5 ml de 5 hexacianoferrato de potasio mM (II) en agua desionizada (DI). Dependiendo del tipo de nanopartícula se sintetizaron - PB PN, GdPB o MnPB, prepare una solución "B" de la siguiente manera:
   1. Para PB NPs: Preparar 10 ml de una solución que contiene 2,5 mM de hierro (III) cloruro en agua DI.
   2. Para GdPB NPs: preparar 10 ml de una solución que contiene 2,5 mM de cada uno de gadolinio (III) nitrato y hierro (III) cloruro en agua DI
   3. Para MnPB NPs: preparar 10 ml de una solución que contiene 2,5 mM de cada uno de manganeso (II) cloruro y hierro (III) cloruro en agua DI.
2. Añadir solución "B" a un matraz de fondo redondo, y revolver el contenido del matraz a temperatura ambiente (RT) y1000 rpm. Añadir solución 'A' gota a gota en el fondo redondo frasco que contiene la solución 'B'. Controlar el caudal de la adición de la solución 'A' a 'B' por una bomba peristáltica establecido para dispensar aproximadamente 10 ml / h.
3. Continuar agitación a 1000 rpm a temperatura ambiente durante 30 minutos después de la adición de solución de 'A' a 'B' se ha completado. Detener la agitación y recoger la mezcla.
4. Transferir alícuotas de la mezcla en tubos de microcentrífuga para enjuagar las nanopartículas libre de componentes que no han reaccionado. Añadir NaCl 5 M (0,2 ml de NaCl mezcla de reacción / ml) a cada alícuota para ayudar en la recogida de partículas por centrifugación.
5. Centrífuga de cada alícuota de nanopartículas durante al menos 10 minutos a 20.000 x g. Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante.
6. Resuspender cada pastilla de nanopartículas en agua DI 1 ml a través de ultrasonidos utilizando una micropunta (pulso de ultrasonidos on / off = 1.1 seg, amplitud = 50%, duración =5 seg, potencia de ultrasonidos calificación = 125 W) para romper la pastilla.
7. Repetir los pasos 1.4 a 1.6 al menos 3 × para asegurar que las nanopartículas están libres de componentes de los subproductos de reacción y de reacción inicial. Después de la centrifugación final, resuspender las partículas en agua DI 1 ml.

2. Biofuncionalización de PB PN, GdPB y MnPB

Biofuncionalización de las nanopartículas consiste en el revestimiento de las nanopartículas "núcleos" con avidina y la adición de ligandos biotinilados como se describe a continuación:

1. Recubrimiento de las nanopartículas con avidina fluorescente
   Recubrimiento de las nanopartículas con avidina fluorescente se consigue utilizando auto-ensamblaje electrostática donde cargado positivamente avidina (pI ~ 10.5) está revestida en al cargado negativamente nanopartículas de la siguiente manera ^18:
   1. Preparar suspensiones de los PN PB, GdPB o MnPB en agua DI 1 ml. Filtra Alexa Fluor 488-etiquetados avidina (A488; reconstituido en agua DI)a través de un filtro de nylon de microcentrífuga de 0,2 micras, con 14.000 × g durante 10 min. Añadir ≤0.2 mg avidina / mg nanopartículas. Añadir los líquidos filtrados de A488 por separado a las alícuotas de PB PN, GdPB o MnPB.
   2. Póngase en contacto con las nanopartículas con A488 durante 2-4 horas con agitación suave o rotación a 4 ° C. Proteja las muestras de la luz utilizando papel de aluminio.
      NOTA: Este A488 rendimientos paso recubierto PB PN (PB-A488), GdPB (GdPB-A488), y MnPB (MnPB-A488).
2. La unión de anticuerpos con biotina
   La unión de los anticuerpos dirigidos biotina en el nanopartículas recubiertas con avidina se logra mediante interacciones avidina-biotina de la siguiente manera:
   1. Preparar suspensiones de los avidina recubierto las nanopartículas - PB-A488, GdPB-A488, y MnPB-A488 en agua DI 1 ml. Filtra anticuerpo biotinilado (suministrada por el fabricante) a través de un filtro de microcentrífuga de 0,2 micras nylon a 14.000 × g durante 10 min.
      NOTA: En este sentido, el presente estudio utiliza biotinylated anti-neurona-glía antígeno 2 (ANG2) que se dirige a NG2 sobreexpresa en las células y tejidos del sistema nervioso central y biotinilado eotaxina-3 anti-humana (Eot3) que se dirige a los receptores sobreexpresados ​​en los eosinófilos o líneas de células eosinófilas.
   2. Añadir cada alícuota filtrada de anticuerpo biotinilado por separado a las alícuotas de las nanopartículas recubiertas con avidina. Añadir ≤0.05 mg nanopartículas de anticuerpos / mg de avidina-revestido biotinilado. Póngase en contacto con las nanopartículas recubiertas con avidina con los anticuerpos con biotina (Ang2 o Eot3) para 2-4 horas con agitación suave o rotación a 4 ° C. Proteja las muestras de la luz utilizando papel de aluminio.
      NOTA: Este anticuerpo rendimientos paso nanopartículas recubiertas (por ejemplo GdPB-A488-Eot3 y MnPB-A488-Ang2).

3. Dimensionamiento, Potencial Zeta, y Temporal de estabilidad de las nanopartículas

La distribución de tamaño, carga, y la estabilidad de las nanopartículas se miden utilizando dinámicamétodos de dispersión de luz (DLS) como se describe a continuación:

1. Dimensionamiento de las nanopartículas
   Dimensionamiento de las nanopartículas se consigue utilizando dispersión dinámica de luz como sigue:
   1. Añadir 10 l de la muestra de nanopartículas (1 mg / ml) a 990 l de agua DI en una cubeta de plástico desechable.
      NOTA: Este es el valor representativo para una buena señal de DLS.
   2. Tapar la cubeta y agitar para mezclar bien. Colocar la cubeta en un sistema utilizado para analizar el tamaño de partícula con el fin de medir el tamaño de las nanopartículas. Realizar análisis de tamaño de partícula en un ángulo de medición de 173 °.
2. Potencial Zeta de las nanopartículas
   Zeta potencial de las nanopartículas se mide usando el análisis de fase de dispersión de luz como sigue:
   1. Añadir 100 l de la muestra de nanopartículas (1 mg / ml) a 900 l de agua DI en una célula capilar de plástico desechable. Este valor es representativo para una buena medición del potencial zeta.
   2. Coloque el capilary celular en un sistema utilizado para analizar el potencial zeta con el fin de medir el potencial zeta de las nanopartículas utilizando los parámetros por defecto a 25 ° C.
3. Estabilidad temporal de las nanopartículas
   La estabilidad temporal de las nanopartículas se mide utilizando dispersión dinámica de luz como sigue:
   1. Evaluar la estabilidad de las nanopartículas mediante la medición de los tamaños de las nanopartículas en agua DI, así como medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) como se describe en el apartado 3.1.
   2. Repetir las mediciones de tamaño en el agua DI y DMEM una vez / día durante un período de 5 días.

4. La citotoxicidad de las nanopartículas

La citotoxicidad de las nanopartículas se mide usando un ensayo de proliferación celular XTT como sigue:

1. Semilla 10.000-15.000 células / pocillo de cada tipo de células estudiadas (Neuro2a, BSG D10, EoL-1, y OE21) en una placa de 96 pocillos. Asegúrese de que el volumen total de células sembradas no EXceed 0,2 ml / pocillo. Incubar las células sembradas toda la noche a 37 ° C y 5% de CO _2.
2. Ponerse en contacto con las nanopartículas con las células:
   1. Se incuban las células con concentraciones variables de nanopartículas (0,01-0,5 mg / ml). Consulte la Tabla 1 como una mesa representativa que se describen las cantidades de las nanopartículas (de 50 l) a las células después de la eliminación de 50 l de medio / pocillo.
      1. Para tener en cuenta cualquier absorbancia interferir de las nanopartículas en el ensayo, agregar un espacio en blanco que consiste en la concentración adecuada de nanopartículas (0-0,5 mg / ml, en equivalencia a los importes añadidos a las células) a medio sin células.
   2. Se incuban las células con nanopartículas durante la noche a 37 ° C y 5% de CO _2. Aspirar los medios de comunicación de cada bien y enjuague con tampón de tinción compuesto por suero bovino fetal al 5% (FBS) en solución amortiguadora de fosfato (PBS). Añadir 100 l de medio sin rojo de fenol y se incuba a CO ₂

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Results

Usando el esquema de síntesis en un solo recipiente, las nanopartículas de Pb NPs (diámetro medio de 78,8 nm, índice de polidispersidad (PDI) = 0,230; calculada por el instrumento de dispersión de luz dinámica), GdPB, o MnPB (diámetro de 164,2 nm, PDI = 0,102 significa) ( diámetro medio 122,4 nm, PDI = 0,124) que son monodispersas (medido por DLS) se puede sintetizar constantemente (Figura 2A). Los potenciales zeta medidos de las nanopartículas sintetizadas están a menos de -30 mV (Figura 2B),

Discussion

Este artículo ha presentado los métodos para la síntesis de una nueva clase de agentes formadores de imágenes multimodales, moleculares basados ​​en nanopartículas azul de Prusia biofuncionalizadas. Las técnicas de imagen molecular incorporados en las nanopartículas son imágenes de fluorescencia y resonancia magnética molecular, debido a sus características complementarias. Las nanopartículas azul de Prusia biofuncionalizadas tienen un diseño de núcleo-corteza. Los pasos clave en la síntesis de estas nanopartículas son:...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hexacianoferrato de potasio (II) trihidrato (K4Fe(CN)6· 3H2O)	Sigma-Aldrich	P9387
Cloruro de manganeso (II) tetrahidratado (MnCl2· 4H2O)	Sigma-Aldrich	221279
hexahidrato de nitrato de gadolinio (III) (Gd(NO3)3· 6H2O)	Sigma-Aldrich	211591
Cloruro de hierro (III) hexahidratado (FeCl3· 6H2O)	Sigma-Aldrich	236489
Cloruro de sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
Anti-NG2 Proteoglicano de sulfato de condroitina, anticuerpo conjugado de biotina	Millipore	AB5320
Biotinilado Anti-Eotaxina-3	humano Peprotech	500-P156GBT
Línea celular Neuro-2a	ATCC	CCL-131
Línea celular BSG D10 Stock	laboratorio	---
OE21 Línea celular	Sigma-Aldrich	96062201
SUDIPG1 Neuroesferas Stock de	laboratorio	---
Eol-1 Línea celular	Sigma-Aldrich	94042252
Hidrobromuro de poli(L-lisina)	Sigma-Aldrich	P1399
Formaldehído	Sigma-Aldrich	F8775
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A2153
Aminoactinomicina D	Sigma-Aldrich	A9400
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
CellTrace Calceína Rojo-Naranja, AM	Life Technologies	C34851
Avidin-Alexa Fluor 488	Life Technologies	A21370
centrífuga	Eppendorf	5424
Bomba peristáltica	Instech	P270
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600
Sonicator	QSonica	Q125
Placa calefactora/agitador magnético	VWR	97042-642
Ultra Clean Papel de aluminio	VWR	89107-732
Vortex Mezclador	VWR	58816-121
Tubos de microcentrífuga cónicos de 1,7 ml	VWR	87003-295
Tubos de centrífuga cónicos de 15 ml	VWR	21008-918
tubo	VWR	82024-342
Cubetas de plástico desechables	VWR	7000-590 (/586)
Celda capilar Zetasizer	VWR	DTS1070
Filtros centrífugos, columna de centrifugación de 0,2 micrómetros	VWR	82031-356
bandeja de cultivo celular de 96 pocillos	VWR	29442-056
Solución de tripsina EDTA al 0,25 % 1x	JR Scientific	82702
PBS de grado de cultivo celular (1x)	Life Technologies	10010023
XTT Kit de ensayo de proliferación celular	Trevigen	4891-025-K
Frasco T75	89092-700	VWR
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowhitaker	12-604Q
Suero fetal bovino	Life Technologies	10437-010
Pen-Strep 1x	Life Technologies	15070063
Fluoview FV1200 Microscopio de barrido láser confocal	Olympus	FV1200
portaobjetos de microscopio con cámara	Thermo Scientific	154534
Micro cubreobjetos, cuadrados, n.º 1,5	VWR	48366-227
portaobjetos de microscopio	VWR	16004-368
RPMI	Sigma-Aldrich	R8758
Agarosa	Sigma-Aldrich	A9539
FACSCalibur Citómetro de flujo	BD Biosciences
resonancia magnética clínica	GE Healthcare
Matraz