Electrospun nanofibras andamios con gradaciones en Organización de fibra

Resumen

A continuación, presentamos un protocolo para fabricar nanofibras andamios electrospun con organización gradated de fibras y explorar sus aplicaciones en la regulación de la morfología celular / orientación. Gradientes con respecto a las propiedades físicas y químicas de las nanofibras andamios ofrecen una amplia variedad de aplicaciones en el campo biomédico.

Resumen

El objetivo de este protocolo es informar sobre un método simple para generar andamios de nanofibras con gradaciones en la organización de las fibras y probar sus posibles aplicaciones en el control de la morfología/orientación celular. La organización de las nanofibras se controla con un nuevo aparato de fabricación que permite la disminución gradual de la organización de las fibras en un andamio. El cambio de la alineación de las fibras se logra mediante la disminución del tiempo de deposición de las fibras electrohiladas aleatorias en una estera de fibra alineada uniaxialmente. Al cubrir el colector con una barrera/máscara móvil, a lo largo del mismo eje que la deposición de fibras, la estructura organizativa se controla fácilmente. Con fines de ingeniería de tejidos, las células madre derivadas del tejido adiposo se pueden sembrar en estos andamios. Las células madre experimentan cambios morfológicos como resultado de su posición en la variada estructura organizacional, y potencialmente pueden diferenciarse en diferentes tipos de células dependiendo de sus ubicaciones. Además, la organización graduada de las fibras mejora la biomímesis de los andamios de nanofibras para que se parezcan más a las orientaciones naturales de las nanofibras de colágeno en el sitio de inserción del tendón al hueso en comparación con los andamios tradicionales. A través de la nanoencapsulación, las fibras graduadas también ofrecen la posibilidad de construir gradientes químicos en andamios de fibra y, por lo tanto, fortalecer aún más sus aplicaciones potenciales en el cribado rápido de la interacción célula-materiales y la regeneración de tejidos interfaciales. Esta técnica permite la producción de andamios de gradiente continuo, pero también puede producir fibras en pasos discretos controlando el movimiento de la barrera/máscara móvil de manera discreta.

Introducción

Las nanofibras son una utilidad popular para la ingeniería de tejidos debido a su capacidad para imitar la matriz extracelular en su estructura y tamaño relativo ^1. Sin embargo, algunas interfaces de tejidos nativos, tales como el sitio de inserción del tendón en el hueso, contienen fibras de colágeno, que exhiben una estructura organizativa variable que aumenta en alineación hacia el tendón y disminuye en el sitio de hueso ^2-5. Por lo tanto, para la regeneración de tejidos eficaz hay una necesidad de fabricar un andamio que podrían imitar eficazmente este gradiente estructural.

Anteriormente, ha habido una investigación llevada a cabo sobre los cambios graduales en la composición de la fibra, concretamente, el contenido mineral ^6. Sin embargo, volver a crear el componente estructural de los tejidos conectivos sigue siendo en gran parte inexplorado. Un estudio anterior examinó gradientes morfológicos mediante el estudio del efecto de la densidad de las partículas de sílice superficie sobre la proliferación de los osteoblastos de calota de rata y se encontró un Inverrelación entre la densidad se partícula de sílice y la proliferación celular ^7. Pero los cambios morfológicos que mediaron la proliferación celular en trabajos anteriores fueron en su mayoría relacionados con la rugosidad superficial que carecen de la capacidad en la imitación de los cambios organizativos de fibra de ^7,8. Un estudio reciente intentó fabricar un andamio que imitaba las orientaciones únicas fibras de colágeno mediante el uso de una novela colector para electrospinning ^9. Si bien este estudio logró producir un andamio con fibras tanto alineados y aleatorios, no logró imitar los cambios graduales que se exhiben en los tejidos nativos. También, en la producción de componentes separados, con un cambio inmediato de alineado con orientación aleatoria, las propiedades biomecánicas de este andamio disminuyeron significativamente. Sin el trabajo previo ha sido capaz de producir nanofibras andamios aplicables con gradaciones continuas en orientaciones de las fibras de alineado y al azar. Nuestro estudio reciente ha demostrado la recreación exitosa de nanofibras andamioscon gradaciones en la organización de fibra que potencialmente pueden imitar la organización de colágeno nativo en la inserción del tendón al hueso ^10. Este trabajo tiene como objetivo presentar los protocolos utilizados para la producción de nanofibras andamios con una estructura que se asemeja mucho a la de organización de las fibras en la interfaz nativa del tejido del tendón al hueso.

Estructuras de nanofibras Gradient han potencialmente aplicaciones en una variedad de campos de gran alcance. Nos centramos en las aplicaciones a la ingeniería de tejidos de la zona de inserción del tendón al hueso mediante la combinación de nuestros andamios con células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) que ya se utilizan para la regeneración de tejidos en varios sustratos ^11-14. Además, ADSC son de naturaleza muy similar a las células madre de médula ósea en términos de multipotencia y su recurso es abundante que puede ser cosechada usando un simple ^15,16 procedimiento de liposucción. Siembra de estas células a los andamios nanofibras graduadas mejora aún más su tisdemandar aplicaciones de ingeniería al permitir la distribución controlada de las células que potencialmente pueden diferenciarse en diversos tejidos. Además de la siembra de células madre, las nanofibras se pueden encapsular con moléculas de señalización para la regulación de la respuesta celular. El acoplamiento de nanoencapsulación con el gradiente de la organización de estos andamios permite el estudio del comportamiento celular o posibles diseños de implantes y recubrimientos. La encapsulación de moléculas funcionales como la proteína morfogenética ósea 2 (BMP2), que se ha demostrado que induce la diferenciación de osteoblastos ^15,16, podría mejorar aún más las aplicaciones de ingeniería de tejidos de estos andamios ^10.

Protocolo

1. Preparación de la Solución

1. Preparar una solución de poli (ε-caprolactona) (PCL) (M _w = 80.000 g / mol) a una concentración aproximada de 100 mg / ml. Disolver PCL en una mezcla de diclorometano (DCM) y N, N-dimethlyformamide (DMF) en una proporción de 4: 1 (v / v) con una concentración de 10% (w / v).
2. Colocar la solución en un tubo de vidrio de 20 ml para la mezcla. Coloque el tubo de vidrio en limpiador ultrasónico durante 30 minutos, o hasta que la solución es transparente.

2. Aparato Preparación

1. Añadir la solución de PCL preparado en una jeringa de 5 ml con una aguja roma de calibre 21 adjunta.
2. Coloque bomba de jeringa en una posición electrospinning vertical, según la figura 1.
3. Utilice un colector de acero inoxidable hueco con un espacio abierto de 2 cm x 5 cm para el sustrato de fibra alineados. Coloque el colector de 12 cm desde la punta de la aguja.
4. Conecte la fuente de la corriente continua (DC) de suministro de alta tensión a laaguja y tierra el colector. Asegúrese de que el colector está conectado a tierra de forma individual, sin contacto con el otro equipo de laboratorio.

3. electrospinning

1. Conjunto bomba de jeringa a 1,50 ml / hora, hasta que las gotas que forman en la punta de la aguja se reemplazan inmediatamente cuando se retiran. A continuación, establezca el caudal de 0,50 ml / hr.
2. Gire el operador de tensión a 12 kV.
3. Electrospin hasta que las fibras uniaxialmente alineadas cubrir completamente la brecha en el colector.
4. Aplique el pegamento a los bordes de una placa de vidrio pequeño y transferir las fibras desde el colector de vacío a la placa de vidrio. Coloque la placa de vidrio en la parte superior de una pieza de papel de aluminio que tiene el mismo tamaño que la placa de vidrio y se pone a tierra.
5. Coloque el segundo colector de jeringa de acuerdo con la Figura 3.
6. Coloque la máscara de plástico a la segunda bomba de jeringa y colocarla 2 mm por encima del colector.
7. Añadir cumarina 6 al 1% (w / w) a la solución de PCL-nan sioencapsulation es desear, y mezclar hasta que la solución esté transparente.
8. Cargue el PCL o PCL / cumarina solución 6 en una aguja de 5 ml con una aguja roma de calibre 21. Establecer bomba vertical a 0,50 ml / hr y horizontal para tirar a las 9 ml / ho a una velocidad aproximada de 1 mm / min.
9. Electrospin hasta que la máscara se ha movido casi completamente fuera del colector, pero con la zona de borde todavía bajo la máscara.

4. Caracterización de fibra

1. Colocar las muestras de cinta conductora de doble cara para el perno metálico y la capa de platino durante 40 segundos usando un revestidor por bombardeo iónico a 40 mA.
   1. Examinar fibras a través de microscopio electrónico de barrido (SEM) de acuerdo con nuestros estudios anteriores ^17,18.
   2. Recoger imágenes a un voltaje de aceleración de 15 kV.
2. Realizar un análisis rápido transformada de Fourier (FFT) en una muestra de fibra separada para medir la alineación de la fibra. La información detallada sobre la medición de alineación de la fibra por FFT puede referirse to estudios previos ^19,20.

5. Las células madre de la siembra.

1. Esterilizar las muestras de fibras por inmersión en una solución de etanol al 70% durante 2 horas. A continuación, lavar las fibras con agua destilada para eliminar cualquier contaminante.
2. Obtener ADSC humanos y células de cultivo en un matraz de 25 ^cm2 a 37 ° C en una atmósfera de 95% de aire / 5% de CO _2. Cambiar el medio de cultivo celular cada otro día ^10.
3. Tripsinizar las células y contar el número de células. Específicamente, eliminar todo el medio de cultivo del matraz de cultivo celular y se lavan las células con tampón fosfato salino (PBS) dos veces. A continuación, añadir 1 m ^l de una solución 0,25% de tripsina-EDTA (pre-calentamiento en baño de agua a 37 ° C) para cubrir la monocapa de células y se incuba el matraz en la incubadora de cultivo celular durante 2-3 minutos. Añadir 4 ml de medio de cultivo y lavar todas las células de la superficie pipeteando el medio en toda la superficie. º Centrifugar la suspensión de células y re-dispersasedimento celular e en el medio de cultivo. Contar las células a través de hemocitómetro. Semilla de alrededor de 1 × 10 ⁴ células a la estructura de nanofibras se coloca en un plato -cultura 35 mm e incubar durante 3 y 7 días.
4. Células manchas usando diacetato de fluoresceína (5 mg / ml en acetona) (FDA), entonces la imagen de las muestras usando un microscopio de fluorescencia. Específicamente, añadir 100 l de solución de la FDA para la placa de cultivo y se incuba durante 30 min. Lavar las células con PBS tres veces antes de imágenes fluorescentes. Analizar la orientación celular mediante un programa mat-laboratorio personalizado basado en nuestros estudios previos ^10.

Resultados

Usando este protocolo, se formó una estera de fibra con un gradiente de organización. La Figura 3 muestra las imágenes SEM tomadas en varios lugares de la estructura de nanofibras. Cualitativamente, se puede determinar que hay una progresión de las fibras uniaxialmente alineadas en 0 mm (Figura 3A) para una variedad de fibra al azar en 6 mm (Figura 3D). La FFT da un valor cuantitativo a la alineación de la fibra, detalles sobre los procesos cuantitativos se detallan aqu...

Discusión

La parte más crítica del protocolo es la generación del andamio de gradiente. Es imperativo que la máscara que cubre el colector se mueva a una velocidad constante para que haya un cambio gradual dentro del andamio de fibra. La preparación correcta de la solución PCL también es importante para garantizar el éxito del electrohilado. Es recomendable verificar la morfología de la fibra antes del electrohilado, especialmente después de la encapsulación de Cumarina-6, que puede requerir un voltaje más alto para electrohilar c...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Policaprolactona	Sigma-Aldrich	440744
N,N-dimetliformamida	Fisher Chemical	D-119-1
Diclorometano	Fisher Chemical	AC61093-1000
Cumarina 6	Sigma-Aldrich	546283
Células madre derivadas del tejido adiposo Tecnologías	ingeniería celular	HMSC. AD-100
Suero fetal bovino	Technologies	26140-111
Diacetato de fluoresceína	Sigma-Aldrich	F7378
Etanol	Sigma-Aldrich	E7023
Tripsina-EDTA	Invitrogen	25300-054
α-Medio de águila modificado	Invitrogen	A10490-01
Acetona	Fisher Scientific	s25120a
10010023		solución salina tamponada con fosfato
	VWR international, LLC	101412-842
Bomba de jeringa	Fisher Scientific	14-831-200	jeringa
	única Branson	1510
Fuente	de alimentación de CC de alto voltajeMicroscopio electrónico de barrido Gamma High Voltage Research	ES30
Microscopio de	FEI	Nova 2300
	Zeiss	Axio Imager 2

de Life Deslizamiento de vidrio de Limpiador ultrasónico de fluorescencia