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Artículo de método

Derivación de cardiomiocitos altamente purificada de células madre humanas pluripotentes inducidas Uso Pequeño Diferenciación molécula modulada y posterior glucosa inanición

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DOI:

10.3791/52628

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18 de marzo de 2015

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1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Institute of Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Cardiovascular Medicine Division, Department of Medicine, Child Health Research Institute, Stanford University School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos un protocolo robusto para la derivación de cardiomiocitos humanos que combina la diferenciación cardíaca modulada por moléculas pequeñas y la purificación de cardiomiocitos mediada por privación de glucosa, lo que permite la producción de cardiomiocitos purificados para fines de modelado de enfermedades cardiovasculares y detección de fármacos.

Resumen

Madre pluripotentes cardiomiocitos derivados de células de origen humano (hiPSC-CM) se han convertido en una fuente de células importantes para abordar la falta de cardiomiocitos primarios disponibles para aplicaciones de investigación básica y traslacional. Para diferenciar hiPSCs en cardiomiocitos, diversos protocolos, incluyendo el cuerpo embrioide (EB) con base en la diferenciación y factor de crecimiento de inducción se han desarrollado. Sin embargo, estos protocolos son ineficientes y muy variable en su capacidad de generar cardiomiocitos purificados. Recientemente, un pequeño protocolo que utiliza la modulación basada en la molécula de la señalización de Wnt / β-catenina se muestra para promover la diferenciación cardiaca con alta eficiencia. Con este protocolo, mayor que 50% -60% de las células diferenciadas se cardiomiocitos de troponina-positivo cardiacas se observaron consistentemente. Para aumentar aún más la pureza de los cardiomiocitos, las células diferenciadas fueron sometidos a la glucosa inanición para eliminar específicamente no cardiomiocitos basado en la diferencia metabólicas entre los cardiomiocitos y los no cardiomiocitos. Usando esta estrategia de selección, se obtuvieron consistentemente un incremento mayor que 30% en la relación de los cardiomiocitos a los no cardiomiocitos en una población de células diferenciadas. Estos cardiomiocitos altamente purificadas deben mejorar la fiabilidad de los resultados de humano a base de IPSC en estudios de modelos de la enfermedad in vitro y ensayos de cribado de fármacos.

Introducción

Cardiomiocitos humanos primarios son difíciles de obtener debido a la necesidad de biopsias cardíacas invasivas, dificultad de disociar a las células individuales, y debido a la mala supervivencia celular a largo plazo en la cultura. Dada esta falta de cardiomiocitos humanos primarios, células madre pluripotentes inducidas humanas cardiomiocitos derivados de células específicos para cada paciente tecnología (hiPSC-CM) ha sido considerada como una poderosa fuente de cardiomiocitos alternativa para la investigación básica, así como aplicaciones clínicas y de traducción, tales como el modelado de la enfermedad y la droga descubrimiento 1. Los primeros esfuerzos en la diferenciación de células madre pluripotentes en cardiomiocitos emplean protocolos de diferenciación utilizando cuerpos embrioides (EBS), pero este método es ineficiente en cardiomiocitos producen porque a menudo menos de 25% de las células en un EB están latiendo cardiomiocitos 2,3. Comparativamente, un protocolo de diferenciación basada en monocapa utilizando las citoquinas activina A y BMP4 muestra una eficiencia superior a EBS, peroeste protocolo es todavía relativamente ineficiente, requiere factores de crecimiento caro, y sólo funciona en un número limitado de pluripotentes humano líneas de células madre 4. Recientemente, un protocolo de diferenciación de cardiomiocitos altamente eficiente basado monocapa-hiPSC fue desarrollado por la modulación de Wnt / β-catenina señalización 5. Estos hiPSC-CM expresar troponina T cardiaca y actinina alfa, dos proteínas sarcoméricas que son marcadores estándar de cardiomiocitos 6. El protocolo describe aquí es una adaptación de este pequeño basado en la molécula, libre de células de alimentación, la diferenciación monocapa método 5,7. Estamos en condiciones de obtener superando los cardiomiocitos de hiPSCs después de 7-10 días (Figura 1). Sin embargo, tras una diferenciación de los cardiomiocitos que resulta en 50% de células de latir, la inmunotinción consistentemente muestra la existencia de una población de los no cardiomiocitos que son negativos para los marcadores-cardiomiocitos específica como la troponina-T cardíaca específica y alfa-actinina. Para further purificar cardiomiocitos y eliminar los no cardiomiocitos, las poblaciones heterogéneas de células diferenciadas fueron sometidos a la glucosa inanición tratándolos con un medio de cultivo de glucosa extremadamente bajo para múltiples días (Figura 2). Este tratamiento elimina selectivamente los no cardiomiocitos debido a la capacidad de los cardiomiocitos, pero no los no cardiomiocitos, para metabolizar el lactato como fuente de energía primaria con el fin de sobrevivir en un entorno de baja glucosa 8. Después de esta etapa de purificación, se observa un aumento del 40% en la relación de los cardiomiocitos a los no cardiomiocitos, (Figura 3, Figura 4) y estas células se puede utilizar para el análisis de la expresión génica aguas abajo, el modelado de la enfermedad, y los ensayos de cribado de fármacos.

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Protocolo

NOTA: La información de proveedor para todos los reactivos utilizados en este protocolo ha sido incluido en la Tabla 1 y Lista de Materiales. Todas las soluciones y equipos que entren en contacto con las células deben ser estériles, y una técnica aséptica se deben utilizar en consecuencia. Realice todas las incubaciones de cultivo en un humidificado 37 ° C, 5% de CO2 menos que se especifique lo contrario. En este protocolo, todas las diferenciaciones se realizaron en placas de 6 pocillos, en el que los hiPSCs se siembran. Después de la diferenciación y la purificación, las células se pueden disociar y se volvieron a sembrar para su uso aguas abajo.

1. Preparación Medio

  1. Para el medio E8, hacer una solución madre para cada componente del medio (NaHCO 3, ácido L-ascórbico 2-fosfato, selenito de sodio, transferrina, insulina, FGF2, TGFB1) y almacenar las soluciones a -20 ° C. Añadir la cantidad apropiada de soluciones madre a la botella de DMEM / F12 y filtrar para esterilizar. El concentr soluciónación y configuración de la reacción para los componentes de las poblaciones y el medio E8 se pueden encontrar en la Tabla 1.
  2. Para la solución de la matriz extracelular, descongelar la matriz de la membrana basal (comúnmente suministrado en 10 mg / ml) a 4 ° CO / N. Matrigel se utiliza comúnmente para el cultivo de células madre pluripotentes porque las células madre pluripotentes humanos pueden adherirse bien a este material utilizando la alfa-6-beta-1 integrina 9. Una vez descongelado, hacen 2,25 mg (250 l) alícuotas en el hielo utilizando hielo puntas de pipeta y tubos frío y almacenar las alícuotas a -80 ° C.
    1. Cuando un revestimiento previo de placas con CEEM, descongelar y alícuota de la solución de la matriz extracelular (CEEM) en hielo. Mezclar el CEEM y medio DMEM / F12 enfriado en hielo en una proporción de 1: 200 en hielo. Mantener en lugar fresco para evitar la solidificación prematura CEEM.
  3. Para el RPMI / B27 sin medio de la insulina, añadir 10 ml de B27 Minus insulina en 500 ml de medio RPMI.
  4. Para el RPMI / B27 (con insulina) medio, agregue 10 ml de suplemento B27 (con insulin) y 5 ml de antibiótico Pen-strep en 500 ml de medio RPMI.
  5. Para el medio bajo de glucosa, añadir 10 ml de suplemento B27 y 5 ml de antibiótico Pen-estreptocócica en 500 ml de medio RPMI libres de glucosa.
  6. Para el medio / criopreservación de congelación, la mezcla de suero fetal bovino, junto con dimetilsulfóxido (DMSO) a una proporción de 9: 1. El medio de congelación se puede almacenar hasta 1 mes a 4 ° C.
    NOTA: Todos los medios de comunicación deben ser filtrados y se almacenan en 4 ° C y utilizarse dentro de 2 semanas a menos que se especifique lo contrario. Todos los volúmenes de reactivo / solución utilizados a continuación están destinadas a un solo pozo en una placa de 6 pocillos, a menos que se especifique lo contrario.

2. Pre-recubrimiento de placas de 6 pocillos con CEEM

  1. Hacer CEEM mediante la mezcla de matriz de membrana basal (por ejemplo, Matrigel) con medio DMEM / F12 enfriado en hielo en una proporción de 1: 200, a continuación, aplicar 2 ml de recién hecho CEEM a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Cada pocillo en una placa de 6 pocillos recibirán aproximadamente 90 mg CEEM.
  2. Incubar la ECMPlacas S recubierto durante 1 hora a 37 ° C. Inmediatamente antes de placas células, aspirado DMEM solución / F12 de cada pocillo. Las placas estarán listos para recibir las células.

3. descongelación La hiPSCs congelados

NOTA: Seguir de cerca este procedimiento, ya que puede conducir a cultivo óptimo y diferenciación aguas abajo de hiPSCs en hiPSC-CM siguiendo el ciclo de congelación / descongelación.

  1. Descongelar un vial de hiPSCs para cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Preparar un tubo cónico de 15 ml con 9 ml de medio de E8 fría con inhibidor de roca (10 mM) para cada vial. Inhibidor ROCA mejora la supervivencia después de la crioconservación hiPSCs 10. Conservar los viales en 37 ° C baño de agua para descongelar las células hasta que un cristal de hielo diámetro aproximadamente 5 mm se deja.
  2. Pulverizar el exterior de los viales con etanol al 70%. Limpie los viales con un pañuelo de papel antes de moverlos a la campana laminar estéril.
  3. Transferencia de las células en el tubo cónico preparado. Enjuague tque el vial una vez con 500 l de medio de E8 y transferir el medio que contiene las células descongeladas a la misma tubo cónico. Centrifugar a TA durante 4 min a 200 x g.
  4. Aspirar el sobrenadante después de la centrifugación y resuspender suavemente el sedimento celular con 2 ml de medio E8 con inhibidor de roca (10 mM). Transferir las células resuspendidas a un pocillo de una placa de 6 pocillos pre-recubierto con CEEM.
  5. Sustituya el medio con medio E8 sin inhibidor ROCA después de 24 horas de cultivo. Las células deben se han adherido a esta hora.

4. pases de hiPSCs

  1. Típicamente, hiPSCs paso después de alcanzar el 75% y el 80% de confluencia en una placa de 6 pocillos. Aspirar el medio de cultivo. Lavarse rápidamente pozos con 1 ml de estéril, RT PBS. Aspirar PBS.
    1. Añadir 500 l de EDTA 0,5 mM o solución desprendimiento celular 1x (por ejemplo, Accutase) e incubar durante 1-7 minutos a temperatura ambiente. Momento adecuado para la incubación EDTA varía con la línea hiPSC. Esperar a ver visible de curling or engrosamiento de colonias alrededor de los bordes, ya que esto indicará que la solución de EDTA o desprendimiento de las células está listo para ser eliminado.
  2. Aspirar el EDTA o la solución de desprendimiento de las células. Añadir 1 ml de medio suplementado con inhibidor de E8 Rock 10 mM. Plegar colonias hiPSC en el pozo pipeteando repetidamente arriba y hacia abajo y la pulverización de colonias con una pipeta P1000. Las colonias deben romperse en 5-10 grupos de células después de la finalización.
  3. Transferir las colonias que están suspendidas en 1 ml de medio E8 con inhibidor ROCA en un tubo cónico de 15 ml.
  4. Interrumpir los grandes grupos de células en pequeños grupos en el medio E8. Añadir un volumen apropiado de los medios de comunicación E8 con el inhibidor a la suspensión celular para diluir las células. El volumen de los medios para agregar para la dilución depende de la densidad celular y el número de pozos que se sembró. Lo ideal sería que una sola, el 80% así confluente de hiPSCs debe diluirse 01:12.
    1. Añadir 11 ml de medio E8 con inhibidor de roca a la 1 ml de ce existentesll en solución antes mencionado tubo cónico de 15 ml para obtener una dilución 01:12.
  5. Triturar Además los grupos de células en fragmentos de células pequeñas (alrededor de 50 a 200 células en cada fragmento es el mejor). Evitar el exceso de trituración ya que esto reduce la supervivencia celular.
  6. Aspirar CEEM de las placas pre-recubierto y añadir 2 ml de células resuspendidas en cada pocillo. Aproximadamente 100.000 células por pocillo de una placa de 6 pocillos es ideal. Objetivo para dispensar las células uniformemente alrededor del pozo para evitar la agrupación de células en el centro del pozo.
  7. Después de 24 horas de cultivo, sustituir el medio con medio E8 sin inhibidor ROCA. Cambiar el medio de cultivo cada 24 horas hasta que las células se convierten en 80% de confluencia. Entonces, las células están listas para pasaje de nuevo. Tarda generalmente 3-6 días entre pasajes para llegar a 80% de confluencia.

5. hiPSCs Congelación

NOTA: Estrechamente siga este procedimiento, ya que puede conducir a cultivo óptimo y diferenciación aguas abajo de la caderaSC en hiPSC-CM siguiendo el ciclo de congelación / descongelación.

  1. Etiquetar los tubos criogénicos con el nombre de la línea de células, tipo de célula, número de pases, y la fecha de congelación. Como pauta general, utilizar un vial para cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Preparar un tubo cónico de 15 ml llena con 9 ml de medio de E8 con inhibidor de roca (10 mM). Preparar medio de congelación con 90% de FBS y 10% de DMSO, y mantener el medio a 4 ° C hasta su utilización.
  2. Aspirar los medios de cultivo, añadir 500 l de EDTA 0,5 mM o solución desprendimiento celular 1x y se incuba durante 2-7 minutos a temperatura ambiente. La duración de la exposición solución de EDTA o desprendimiento de las células varía de línea celular a línea celular.
  3. Aspirar EDTA o solución desprendimiento de las células. Añadir 1 ml de medio de E8.
  4. Plegar colonias hiPSC en el pozo pipeteando arriba y abajo y rociar colonias con una pipeta P1000. Las colonias no deben romperse en partes más pequeñas de 100 grupos de células. Transferir las células suspendidas en el tubo cónico preparado que contiene E8. Centrifugar a RT durante 4 min a 200 x g.
  5. Aspirar el sobrenadante y añadir 500 l de medio de congelación frío al sedimento. Resuspender el precipitado pipeteando una a dos veces. La supervivencia celular se mejora manteniendo las células en grandes grupos.
  6. Transferencia de las células resuspendidas en un tubo criogénico etiquetado. Mover rápidamente los viales en un recipiente que contiene isopropanol congelación, lo que permitirá un enfriamiento gradual. Mantener el envase con las células a -80 ° C durante 24 h, a continuación, transferir las células a nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.

6. cardíaca Diferenciación de IPSC Humano

NOTA: Todos los medios deben estar al menos a temperatura ambiente cuando se añade.

  1. Después de la disociación con solución de EDTA o desprendimiento celular 1x, semilla de aproximadamente 100.000 iPSCs humanos en CEEM recubiertas placas de cultivo de 6 pocillos para la diferenciación (mismos pasos que los procedimientos de pases de células). Cuando las células alcanzan 85% de confluencia, cambiar el medio a RPMI / B27 sin medio de la insulina con 6mM CHIR99021 inhibidor de GSK3-beta (CHIR) y mantener durante 48 horas.
  2. Después de 48 horas, sustituya el medio de cultivo que contiene CHIR con RPMI / B27 sin medio de la insulina y la dejara en paz durante 24 horas (hasta el día 3).
  3. En el día 3, cambiar el medio a RPMI / B27 sin insulina con 5 mM Wnt inhibidor IWR1 y mantener durante 48 horas (hasta el día 5).
    NOTA: Wnt inhibición también se puede intentar el uso de otros compuestos de moléculas pequeñas, como se describe en estudios anteriores 11. IWR1 fue seleccionado sobre otros inhibidores de Wnt de molécula pequeña debido a la mayor rango en el que se ha demostrado ser eficaz en la inhibición de la señalización de Wnt 11.
  4. En el día 5, cambiar el medio de nuevo a RPMI / B27 sin medio de la insulina y se deja durante 48 horas (hasta el día 7).
  5. En el día 7, sustituir el medio con medio RPMI / B27 (con insulina) y reemplazar el medio cada 3 días a partir de entonces con el mismo medio. Latido espontáneo de los cardiomiocitos debe primero ser visibles en aproximadamente el día 8 a día10.

7. Purificación de cardiomiocitos humanos a través de inanición glucosa

  1. En el día 10 post-diferenciación, cambiar el medio en cada pocillo de la placa de 6 pocillos a 2 ml de medio de bajo nivel de glucosa y mantener las células en este medio durante 3 días (hasta el día 13).
  2. En el día 13, las células volver a medio RPMI / B27 (con insulina).
  3. Opcionalmente, replate cardiomiocitos antes de la segunda ronda de la inanición glucosa para ayudar a aflojar los no cardiomiocitos de la placa de cultivo, lo que facilita la disociación de los no cardiomiocitos durante la inanición glucosa.
    1. Al día 13, el medio aspirado, lavar una vez con PBS, y disociar las células en células individuales usando 500 l de enzima disociación celular durante 5 min a 37 ° C. Específicamente, después de 5 min de tratamiento con enzimas, utilizar una pipeta de 1000 l para disociar manualmente los cardiomiocitos de la placa de 6 pocillos tirando repetidamente la enzima disociación celular y pulverización contra el cardiomyomonocapa cyte. Hasta 30 repeticiones de pipeteo puede ser necesaria para disociar los cardiomiocitos en células individuales.
    2. Después las células se disocian y están en forma de una sola célula, recoger todas las células en un tubo cónico de 15 ml llena con 5 ml de medio RPMI / B27 con la insulina para diluir la enzima disociación celular y centrifugar durante 4 min a 200 x g. Aspirar y desechar el sobrenadante.
    3. Vuelva a suspender las células con el medio 2 ml RPMI / B27 y placa sobre una nueva placa de 6 pocillos recubiertos de CEEM. Típicamente, el aumento de la confluencia de los cardiomiocitos ayuda con la supervivencia celular durante la resiembra. Trate de replate 2.000.000 células por plato nuevo de 6 pocillos para la supervivencia óptima durante la resiembra.
  4. En el día 14, cambiar el medio de nuevo a 2 ml de medio-bajo de glucosa para un segundo ciclo de la privación de glucosa. Cultivar las células en este estado bajo nivel de glucosa durante 3 días más. La mayoría de los no cardiomiocitos morirán en esta condición de cultivo bajo en glucosa.
  5. En el día 17, cambiar el medio a 2 ml de RMedio PMI / B27 con insulina. Las células restantes serán cardiomiocitos altamente purificados. Estos cardiomiocitos se pueden utilizar para el análisis de la expresión génica, la selección de fármacos, el análisis metabólico, y varios otros ensayos de aguas abajo.

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Resultados

Los cambios morfológicos durante hiPSC diferenciación.

El hiPSC cultivaron en placas libres de alimentador creció colonias planas, bidimensionales. Al llegar a alrededor de 85% de confluencia, hiPSCs fueron tratados con 6 mM CHIR para la diferenciación (Figura 1A). Se observaron cantidades sustanciales de la muerte celular, un fenómeno normal y común, después de 24 horas de tratamiento CHIR. Después de dos días de tratamiento CHIR, los hiPSCs continuaron dif...

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Discusión

La obtención de una gran cantidad de cardiomiocitos hiPSC derivado altamente purificada es crítica para la investigación cardiaca básica, así como las aplicaciones clínicas y de la traducción. Protocolos de diferenciación cardíacos han sufrido grandes mejoras en los últimos años, la transición de métodos basados ​​en el cuerpo embrioides que utilizan el crecimiento cardiogénico los factores 2, a la matriz métodos sándwich 12, y finalmente a los métodos basados ​​en pequeñas monocapa molécula modula...

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por el NIH/NHBI (U01 HL099776-5), el Premio al Nuevo Innovador del Director de los NIH (DP2 OD004411-2), el Instituto de Medicina Regenerativa de California (RB3-05129), la Asociación Americana del Corazón (14GRNT18630016) y el Premio Dotado del Profesorado Scholar de la Fundación Lucile Packard para Niños y el Instituto de Investigación de Salud Infantil de Stanford (a SMW). También reconocemos el apoyo financiero de la Beca Predoctoral 13PRE15770000 de la Asociación Americana del Corazón y del Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias DGE-114747 (AS).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Matrigel (9-12 mg/ml)BD Biosciences354277
medios RPMIInvitrogen11835055
Medios RPMI sin glucosaInvitrogen11879-020
B27 Minus InsulinaInvitrogenA1895601
B27 Suplemento (con insulina)Invitrogen17504-044
Antibiótico antiestreptococoInvitrogen15140122
Suero fetal bovinoBenchMark100-106
DMSOSigmaD-2650
Inhibidor de ROCK Y-27632EMD Millipore688000
CHIR99021Thermo Fisher508306
IWR1SigmaI0161
EDTAInvitrogen15575-020
AccutaseMilliporeSCR005
Elevador de célulasFisher08-100-240
CryovialFisher (tubos NUNC)375418
TrypLE Select EnzymeInvitrogen12563-011

Referencias

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