Sincronización de Caulobacter crescentus Para la Investigación del Ciclo Celular Bacteriana

Resumen

La sincronización de las células bacterianas es esencial para los estudios del ciclo y desarrollo de las células bacterianas. Caulobacter crescentus es sincronizable a través de la centrifugación por densidad, lo que permite una herramienta rápida y potente para el estudio del ciclo celular bacteriano. Aquí proporcionamos un protocolo detallado para la sincronización de las células Caulobacter.

Resumen

El ciclo celular es importante para el crecimiento, la replicación del genoma y el desarrollo en todas las células. En las bacterias, los estudios del ciclo celular se han centrado en gran medida en células no sincronizadas, lo que dificulta el orden de los eventos temporales necesarios para la progresión del ciclo celular, la replicación del genoma y la división. Caulobacter crescentus proporciona un excelente sistema modelo para el ciclo celular bacteriano mediante el cual las células pueden sincronizarse rápidamente en un estado G0 mediante centrifugación por densidad. Los experimentos de sincronización del ciclo celular se han utilizado para establecer los eventos moleculares que gobiernan la replicación y segregación de cromosomas, para mapear una red reguladora genética que controla la progresión del ciclo celular y para identificar el establecimiento de complejos de señalización polar necesarios para la división celular asimétrica. Aquí proporcionamos un protocolo detallado para la sincronización rápida de las células Caulobacter NA1000. La sincronización se puede realizar en un formato a gran escala para el perfil de expresión génica y los ensayos de Western blot, así como en un formato a pequeña escala para los ensayos de microscopía o FACS. La rápida sincronizabilidad y el alto rendimiento celular de Caulobacter hacen de este organismo un poderoso sistema modelo para estudios del ciclo celular bacteriano.

Introducción

El ciclo celular bacteriana controla tanto la replicación del genoma y la división de las células hijas. Es importante destacar que, como la resistencia a los antibióticos es una amenaza creciente para la salud pública, el ciclo celular bacteriana presenta un objetivo sin explotar para el desarrollo de antibióticos.

En la bacteria Caulobacter crescentus, cada ciclo celular conduce a una división asimétrica, produciendo dos células hijas de diferentes destinos (Figura 1A) ^1,2. Una célula hija hereda un flagelo y es móvil, mientras que la otra hija hereda un tallo y es sésiles. Un circuito genético integrado controla la progresión del ciclo celular y destino celular mediante la regulación transcripcional, fosfo-señalización, y proteólisis regulada ^3. Además, la replicación de cromosomas y células hijas rendimiento segregación concurrentes que contienen exactamente una copia del cromosoma ^4. Es importante destacar que estos dos tipos de células se pueden separar rápidamente por colloidal partícula de sílice centrifugación de densidad en la cepa NA1000 sincronizable ^5-7 permitiendo el aislamiento de las células swarmer del resto de la población con altos rendimientos (Figura 1B). Aislado swarmer células luego proceder de forma sincrónica a través de la división celular asimétrica. Aquí, detallamos el protocolo utilizado para sincronizar Caulobacter cepa NA1000. Proporcionamos protocolos y sugerencias para solucionar problemas comunes para ambos de gran y pequeña escala sincronizaciones. Este procedimiento experimental proporciona una poderosa herramienta para interrogar el control espacio-temporal del ciclo celular Caulobacter y destino celular.

Protocolo

1. Sincronía a gran escala - óptimo para el Western Blot, Microarray / RNA-Seq, y otros ensayos intensivos de materiales

1. De una acción congelador o una placa, crecer un 5 ml O / N de la cultura NA1000 cepa por agitación a 28 ° C en medio PYE.
2. Inocular 0,5 ml de las células de la etapa 1 en 25 ml de M2G (Tablas 1-2) y agitar a 28 ° C hasta que el cultivo alcanza una OD ₆₀₀ entre 0,5 y 0,6.
3. Se inoculan las células en 1 l de M2G y agitar a 28 ° C.
4. Una vez _DO600 alcanza de 0,5 a 0,6, confirmar la presencia de swarmer células utilizando microscopía fase líquida montada. Punto 1 l de células sobre un portaobjetos de vidrio, cubierta con una hoja de la cubierta, y la imagen por microscopía de fase. Confirmar la presencia de células swarmer mediante la visualización de las células que nadan rápidamente en la población.
5. Girar las células durante 15 min a 7 kxg a 4 ° C en un rotor JA-10.
6. Descartar el sobrenadante y añadir 180 ml de frío M2 (Tablas 1-2) y cosa suavementeuspend todas las células utilizando una pipeta serológica. Deseche células poco granuladas; que son las células predivisional y acechado.
7. Añadir 60 ml de solución de sílice coloidal frío (asegúrese de mezclar la suspensión de sílice coloidal bien antes de añadir a las células) y mezclar bien la suspensión celular.
8. Verter la suspensión de células en ocho tubos de 30 ml y centrifugar durante 30 min a 6,4 kxg a 4 ° C en un rotor JA-20.
   NOTA: Hay que ver a dos bandas distintas; la banda swarmer es la banda más baja mientras acechadas células / predivisional están en la banda superior (Figura 1B).
9. Aspirar con cuidado la banda superior y retire el líquido a ~ 1 cm por encima de la banda swarmer (la banda inferior).
10. (Crítica) Con una pipeta Pasteur, retire con cuidado la banda swarmer y colocar en un tubo limpio. Para lavar la sílice coloidal, parte superior del tubo con frío M2 y centrifugado durante 10 minutos a 6,4 kxg a 4 ° C en un rotor JA-20.
11. Desechar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender ellas células en 20 ml de frío M2 y centrifugado durante 10 minutos a 6,4 kxg a 4 ° C en un rotor JA-20.
12. Resuspender todas las pastillas en 30 ml de frío M2 y medir la OD ₆₀₀ usando un espectrofotómetro y en blanco utilizando medio M2 frío. Guardar 1 l para la imagen de fase para comprobar swarmer células; 90-95% de las células debería ser enjambres.
13. Centrifugar las células durante 5 minutos a 6,4 kxg a 4 ° C en un rotor JA-20. Resuspender las células en 28 ° C M2G medio de modo que el A ₆₀₀ es de ~ 0,3-0,4 y comenzar agitación a 28 ° C.
    NOTA: Los rendimientos típicos son entre 30 y 60 ml de swarmer cultivo celular de 1 litro de células no sincronizadas.
14. Comience a tomar los puntos de tiempo (la cultura de tipo salvaje tomará aproximadamente 135-140 minutos para dividir) ^8,9. En cada punto de tiempo, medir el OD _600. Compruebe que el OD ₆₀₀ después de la división es de aproximadamente 2 veces la DO inicial _600.
15. Para ensayos de transferencia o de expresión génica occidentales, retirar alícuotas de 1 ml de la culture en los tiempos deseados, de girar a velocidad máxima en una centrífuga de mesa durante 30 segundos, rápidamente decantar o aspirar el medio, y el flash congelar el sedimento de células en nitrógeno líquido. Guarde las células a -80 ° C hasta el análisis de aguas abajo.

2. Sincronía pequeña escala - Óptimo para Microscopía

1. De una acción congelador o una placa, crecer un cultivo de 5 ml O / N agitación a 28 ° C en M2G.
2. Diluir en 15 ml de M2G (Tablas 1-2) y crecer hasta mediados de log (OD ₆₀₀ = 0,5 a 0,6).
3. Giran a 6,4 kxg durante 10 min a 4 ° C en un rotor JA-20, y se vuelve a suspender en 1 ml M2 frías (Tablas 1-2) y transferir a un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
4. Giran a 15 kxg durante 3 min en un tubo de microcentrífuga para sedimentar las células, aspirar el sobrenadante, el sedimento se puso en hielo, y resuspender en 900 l de frío M2.
5. Añadir 900 l de PVP frío recubierto de sílice coloidal y centrifugado durante 20 minutos a 15 kxg a 4 ° C en un microtubo rocentrifuge.
6. (Crítica) Aspirar o una pipeta de la parte superior de banda celular acechado / predivisional y recoger la parte inferior swarmer banda en un nuevo tubo de microcentrífuga.
7. Lavar las células dos veces en swarmer 1 ml de frío, mientras que M2 centrifugación a 15 kxg durante 3 min.
8. Antes de que el centrifugado final, mover las células en un tubo de ensayo de vidrio de 1 ml pre-enfriada y medir la OD ₆₀₀ de las células en comparación con un blanco de M2.
9. Resuspender el precipitado celular final a 28 ° C M2G a una DO entre 0,3 a 0,4 y agitar células / rollo a 28 ° C.
   NOTA: Los rendimientos típicos son entre 2 y 4 ml de cultivo celular swarmer.
10. Para los experimentos de microscopía, a la deseada puntos temporales lugar 1 l de células sobre una almohadilla de agarosa M2G para la imagen.

Resultados

Sincronización típicamente produce dos bandas de células (Figura 1B): la banda swarmer, que tiene una densidad más alta, y una banda de células tallo / predivisional de menor densidad. Para asegurar los controles comunes de sincronización eficiente incluyen la supervisión de la OD ₆₀₀ y la medición de los niveles de proteína CtrA por Western blot en momentos distintos del ciclo celular. La OD ₆₀₀ debería aumentar en aproximadamente 2 veces durante el curso del ciclo celular

Discusión

El ciclo celular bacteriano es un proceso fundamental en la vida y es importante para el estudio del crecimiento y como objetivo de los antibióticos de próxima generación. Aquí, detallamos los procedimientos de sincronización rápida para C. crescentus NA1000, un organismo modelo para el estudio del ciclo celular bacteriano y la división celular asimétrica. Este método se puede modificar a western blot, perfiles de expresión génica y ensayos de microscopía de fluorescencia para investigar la regulación espaciote...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sílice coloidal recubierta de PVP (Percoll)	Sigma-Aldrich	P4937
Sílice coloidal (Ludox AS-40)	Sigma-Aldrich	420840
Rotor JA10	Beckman-Coulter	369687
Rotor JA20	Beckman-Coulter	334831
solución de quelato de sulfato ferroso	Sigma-Aldrich	F0518
Tubos de centrífuga de 30 ml	Corning	8445
Na2HPO4	EMD	SX0720-1
KH2PO4	VWR	BDH9268-500G
NH4Cl	Amresco	0621-500g