Protocolos para la obtención de embriones somáticos y cigóticos para el estudio de la regulación del desarrollo embrionario temprano en el Modelo de Leguminosas Medicago truncatula

Summary

El objetivo es ilustrar que el modelo de leguminosa Medicago truncatula puede utilizarse fácilmente para investigar la regulación de la embriogénesis temprana de plantas para complementar el modelo de Arabidopsis no leguminosa. La morfología de las vainas está relacionada con las etapas de embriogénesis cigótica y también se proporciona un protocolo para recolectar embriones mediante cultivo de tejidos.

Abstract

La embriogénesis temprana a partir de una sola célula cigoto pasa a través de una rápida división celular y la morfogénesis, y se caracteriza morfológicamente por etapas pre-globular, globulares, corazón, de torpedos y de cotiledones. Este desarrollo progresivo está bajo la regulación estricta de una red molecular compleja. La recolección de suficientes embriones tempranos en una etapa similar de desarrollo es esencial para la investigación de la regulación celular y molecular de la embriogénesis temprana. Esto no es directo desde la embriogénesis temprana sufre morfogénesis rápido en un corto periodo de tiempo, por ejemplo 8 días para Medicago truncatula para llegar al estadio de cotiledones temprano. Aquí, abordamos el tema por dos enfoques. El primero establece una vinculación entre el desarrollo del embrión y la morfología pod en ayudar a indicar la etapa del embrión cigóticos. Esto se basa sobre todo en el número de espirales de la vaina y el desarrollo de las espinas. Una forma alternativa para complementar la in vivo sos estudios es a través de explantes de hoja de cultivo para producir embriones somáticos. El medio incluye una combinación de hormonas inusual - una auxina (ácido 1-naftalenacético), una citocinina (6-bencilaminopurina), el ácido abscísico y ácido giberélico. Las diferentes etapas se pueden discernir que crece fuera del callo sin disección.

Introduction

Las legumbres son la tercera familia más grande de plantas superiores, con aproximadamente 20.000 especies y el (o Fabaceae) familia de las leguminosas son segundos a los cereales en la superficie cosechada y la producción total ^1. La soja es el cultivo cultivado tercera más grande. Leguminosas de grano proporcionan alrededor de un tercio de la proteína dietética y un tercio de aceite vegetal para el consumo humano ^2. Legumbres con su capacidad de fijación de _N2 también contribuyen a los sistemas agrícolas sostenibles. Medicago truncatula, como la soja, las tiendas de proteína y aceite en los cotiledones de las semillas y es ....

Protocol

1. Desarrollo de embriones cigóticos

1. Material Vegetal
   1. Crece la Medicago truncatula tipo salvaje Jemalong o su isogénica más cercana, altamente re-generable genotipo Jemalong 2HA ¹³ (conocido como 2HA) en un invernadero con un fotoperíodo de 14 horas y 23 ° C / 19 ° C de temperatura día / noche.
      1. Pierce la superficie de la cubierta de la semilla (con una aguja de 23 G) antes de sembrar la semilla de modo se permite que el agua para entrar en la semilla y en remojo en agua durante la noche. Agregar suficiente agua para cubrir la totalidad de la semilla.
      2. Siembre 3 semillas en cada maceta 15 cm de diámetro (un tot....

Results

Para embriogénesis diferentes estructuras vaina cigóticos correspondientes a las diferentes etapas de embriones se muestra en la Figura 1A - F, mientras que las diferentes etapas de embriones se muestran en la Figura 2A - F. Mediante la selección de las vainas en la misma etapa, las muestras de óvulos que son bastante uniforme puede obtenerse (Figura 3A). Mediante el uso de RT-qPCR embrión genes específicos se pueden detectar fácilmente.......

Discussion

Los protocolos descritos son relativamente sencillo y permiten la investigación de la embriogénesis leguminosa con toda la célula contemporánea y técnicas moleculares. Reconocemos que hay ventajas y desventajas de ambos in vivo e in vitro enfoques. Ambos permiten un mayor enfoque en la embriogénesis temprana en comparación con la cultura de las semillas inmaduras ^19.

En el caso de los estudios in vivo lo que se describe es predominantemente el a.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medio P4	Sigma-Aldrich		Utilice Sigma-Aldrich Chemicals u otro proveedor
de
Sales menores
Vitaminas
Agar	Bacto Laboratories	214010	Bacto agar
Hormonas vegetales
1- Ácido naftalenacético	Sigma-Aldrich	N0640	Disolver en una pequeña cantidad de 1 M de NaOH
Ácido abscísico	Sigma-Aldrich	A1049	Disolver en una pequeña cantidad de 1 M de NaOH
6-Benzilaminopurina	Sigma-Aldrich	B3274	Disolver en agua MQ con calentamiento y unas gotas 1N HCl
Ácido giberélico	Sigma-Aldrich	G7645	Disolver en una pequeña cantidad de etanol
Equipo
Microscopio estereoscópico de disección	Leica	MZFLIII	O similar
Microscopio óptico	Zeiss	Axiophot	O similar, con óptica adecuada
Cámara digital	Zeiss	AxioCam HRc	O similar
Hojas
Tapón de rosca de 250 mL Recipiente de policarbonato con tapa de polipropileno	SARSTEDT	75.9922.519	Esterilizable en autoclave