El método de imagen vertical descrito en este protocolo permite la visualización detallada de los polos de un huevo de Drosophila melanogaster en desarrollo. Esta vista final proporciona una nueva perspectiva sobre la disposición y morfología de múltiples tipos de células en el epitelio folicular.
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Resumen
Resumen
La ovogénesis de Drosophila melanogaster proporciona un contexto ideal para estudiar diversos procesos de desarrollo, ya que el ovario tiene una arquitectura relativamente simple, está bien caracterizado y es susceptible de análisis genético. Cada cámara de óvulos consta de células de la línea germinal rodeadas por una sola capa epitelial de células de folículos somáticos. Los subconjuntos de células foliculares se diferencian durante etapas específicas para convertirse en varios tipos de células diferentes. Las técnicas estándar permiten principalmente una vista lateral de las cámaras de los óvulos y, por lo tanto, una visión limitada de la organización e identidad de las células foliculares. El protocolo de imagen vertical describe una técnica de montaje que permite una nueva vista vertical de las cámaras de huevos con un microscopio confocal estándar. Las muestras se montan primero entre dos capas de gelatina de glicerina en posición lateral (horizontal) en un portaobjetos de microscopio de vidrio. Luego, la gelatina con cámaras de huevos encerradas se corta en bloques, se transfiere a un cubreobjetos y se voltea para colocar las cámaras de huevos en posición vertical. Las cámaras de huevos montadas se pueden visualizar en un microscopio confocal vertical o invertido. Esta técnica permite estudiar la especificación, organización, marcadores moleculares y desarrollo de óvulos de las células foliculares con nuevo detalle y desde una nueva perspectiva.
Introducción
Estudio de Drosophila melanogaster ha proporcionado grandes conocimientos sobre la regulación genética de una amplia gama de fenómenos. En particular, ha habido una extensa investigación en el desarrollo de huevo, porque la ovogénesis proporciona una forma manejable para investigar muchos procesos de desarrollo diferentes, incluyendo patrones de tejido, los cambios de polaridad celular, la conmutación del ciclo celular, y la regulación de traducción 1,2,3,4. Un evento morfogénica importante durante la ovogénesis es la especificación, la adquisición de la motilidad, y la migración de un conjunto de células llamadas células de frontera (revisado en 5). Puesto que la migración celular es una característica clave de la morfogénesis animal, y porque la regulación genética de este proceso está bien conservada, mecanismos determinados en las moscas son propensos a ser importante en otros contextos. Por lo tanto, estamos investigando el control molecular de la migración celular frontera. Para nuestros estudios, hemos desarrollado un nuevo método para observar los polos anteriores de desarrollo de los huevos,donde surgen las células de frontera, para examinar cómo se desarrollan en detalle.
Dentro del ovario, existen cámaras de huevos en las distintas etapas de desarrollo a lo largo de las cadenas de llamadas ovarioles, que están provistas de un revestimiento delgado (Figura 1). Cada cámara de huevos pasará a formar un huevo. Durante la ovogénesis, varios tipos diferentes de células deben desarrollar de manera coordinada. El D. cámara de huevos melanogaster consta de 16 células de la línea germinal, entre ellos uno de los ovocitos, rodeado de una sola capa de epitelio folicular 6. Un pequeño número de células especializadas, llamadas células polares, surgen en los anteriores y posteriores polos del epitelio. Las células del borde 6-8 se originan en el epitelio anterior de la cámara de huevos, inducida por las células polares 5,7. A mediados de la ovogénesis (etapa 9), las células se desprenden de la frontera de sus vecinos y migran entre las células de la enfermera para alcanzar el ovocito en la parte posterior de la cámara de huevos 5,7. Este movimiento debe ser realizadomientras que las células permanecen en la frontera de un clúster que rodea dos células polares no móviles, haciendo de este un tipo de migración celular colectiva. Migración exitosa del grupo de células frontera garantiza el desarrollo adecuado de la micropilo de la cáscara del huevo, que es necesaria para la fertilización.
Las células polares anteriores instruyen destino celular frontera mediante la activación de una cascada de transducción de señales. Célula polar secretan una citoquina, Unpaired (UPD), que se une a un receptor transmembrana, domeless (DOMO), en células del folículo vecino durante la etapa 8 del desarrollo de los ovocitos 8,9. La unión de UPD causa de la tirosina quinasa Janus (JAK) para fosforilan el transductor de señales y activador de la transcripción (STAT) 8,10,11. STAT se mueve entonces al núcleo para activar la transcripción. Células del borde lento (SLBO) es un factor de transcripción que es una diana transcripcional directa de STAT y también se requiere para la migración de células frontera 12. Vistas laterales de cámaras de huevos indican tactividad STAT sombrero está regulada en un gradiente a través del epitelio anterior 8,11,13. Células del folículo más cercanos a las células polares tienen los más altos niveles de STAT activado, por lo que se convierten en células de frontera e invaden el tejido de la línea germinal adyacente.
Para entender cómo se especifican las células del borde interior y se desprenden del epitelio, tenemos que observar cómo se organiza el tejido. Si vemos cámaras de huevos desde una perspectiva anterior-en, esperaríamos la simetría radial de la actividad STAT en las células foliculares que rodean las células polares. Una vista frontal también mostrar con mayor precisión las diferencias de las proteínas de membrana y las interfaces de célula-célula antes y durante el desprendimiento de la comparación de células en diferentes planos focales. Porque cámaras de huevos son oblongas y unido entre sí por las células tallo, se instalan en portaobjetos lateralmente, por lo que es difícil de observar la arquitectura anterior. Por lo tanto, toda la información acerca de las células en los polos de la cámara de huevos tieneha inferido a partir de vistas laterales. Aunque alguna información puede ser obtenida a través de algoritmos reconstrucciones 3-D de las secciones ópticas, dispersión de la luz, fotoblanqueo y límites más pobres de la resolución en el eje Z que esta información menos detallada y fiable en ausencia de técnicas costosas como super-resolución microscopía 14 . Otros tipos de formación de imágenes basada en sección (por ejemplo, microscopía electrónica o seccionamiento microtomo) requieren una extensa manipulación de los tejidos, incluyendo la deshidratación, aumentando la probabilidad de artefactos. Por lo tanto, hemos desarrollado un nuevo método para la imagen D. cámaras de huevos melanogaster mientras que en posición vertical. Este método ya ha demostrado su utilidad en la aclaración de cómo están destinados células móviles (ver resultados representativos y Manning et al, en revisión), y es probable que sea más ampliamente valiosa en el estudio de otros aspectos de la ovogénesis.
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Protocolo
1. Disección de ovarioles
- Transferir unos quince 2-4 días de edad, las moscas hembras y unos pocos hombres a un nuevo vial de alimentos mosca con agregado de levadura seca activa. Utilice algodón como un tapón para los viales, y añadir unas gotas de agua para el algodón para mantener la humedad alta.
- Colocar el vial en una incubadora a 25 ° C durante 14-16 horas para maximizar el número de la etapa 8-10 cámaras de huevos.
NOTA: El tiempo de incubación varía dependiendo de la temperatura y la fase deseada. - Preparar los medios de disección, 0,1 M KPO 4 y NP40 soluciones según sea necesario para el día siguiente (ver Materiales).
- Anestesiar las moscas utilizando CO 2, y poner bajo un microscopio de disección. Pipet varias gotas de medios disección en cada cavidad en la diapositiva depresión de vidrio.
- Mantenga fórceps en cada mano en un ángulo de aproximadamente 30 ° a la superficie de la mesa y orientar una mosca hembra con las alas hacia abajo. Con la mano no dominante, recoger la hembra usando pinzas, agarrándola de la unanterior del abdomen, cerca del tórax, y sumerja en el medio de su disección en la diapositiva depresión (Figura 1A recuadro).
- Con el otro par de pinzas, sujete el exoesqueleto en la ventral posterior del abdomen y la traspasará. Coge los ovarios en el extremo posterior, a continuación, tire hacia fuera del abdomen y el lugar en el medio nuevo en el otro lado de la corredera de la depresión. (Figura 1A recuadro). Evite tirar aparte el intestino. Deseche la canal.
- Repita con el resto de las moscas hembras hasta que se disecan los ovarios. Deseche los varones.
- Con un par de pinzas, mantenga un ovario en el extremo posterior (cerca de las grandes cámaras de huevos), y con la otra mano usar un par de pinzas para pellizcar una de las cámaras de huevos más anteriores (germarium). (Figura 1A).
- Poco a poco y de manera constante, tirar de una cadena ovariole fuera de la vaina ovario. Continuar a diseccionar ovarioles individualmente hasta que todas las cámaras de huevo deseados son removed.
- Repita los pasos 1.7 a 1.8 para todos los ovarios disecados.
- Una vez completa, traslado ovarioles a un tubo de 0,6 ml con una pipeta de transferencia de plástico.
- Deje ovarioles depositan en el fondo del tubo, a continuación, proceder a los pasos de fijación y tinción.
2. Inmunofluorescencia (IF) La tinción de ovarioles
- Retire con cuidado los medios disección de ovarioles con una pipeta. Asegúrese de no eliminar cualquier ovarioles o cámaras de huevo. Deje aproximadamente 50 l de ovarioles y medios de disección.
- Añadir 50 l de 16% de paraformaldehído a 150 ml de 0,1 M KPO4 de búfer en un tubo, y añadir la solución de cámaras de huevos para solucionarlos. Incubar mientras se balancea durante 10 min. PRECAUCIÓN: paraformaldehído es tóxico.
- Retire el fijador y enjuague dos veces con tampón de lavado NP40 0,5 ml.
- Lavar dos veces durante 15 min cada uno a temperatura ambiente.
- Consulte la norma SI protocolo 15 para los pasos posteriores.
- Brevemente, después de la fijación, añadiranticuerpos primarios a las diluciones apropiadas y se incuban O / N a 4 ° C. Lave en NP40 varias veces, a continuación, añadir anticuerpos secundarios (1: 200 diluciones).
- Lavar varias veces en NP40, a continuación, añadir DAPI (1: 1000) durante 10 min, a continuación, repetir los lavados. Una vez SI protocolo es completa, añadir 200 l de glicerol al 50% en PBS para cámaras de huevos y dejar reposar a temperatura ambiente durante 2 horas.
- Retire la solución, reemplazarlo con un 70% de glicerol en PBS, y cubrir con papel aluminio. Coloque la muestra en 4 ᵒC hasta que esté listo para el montaje. Mientras tanto, continúe con el paso 3.
3. Preparación previa de Glicerina Jalea Slides
- Medir al menos 4 ml de glicerina jalea usando una espátula y llenar un tubo de cultivo de célula de vidrio hasta la marca de medio camino. Derretir la jalea de glicerina en un baño de agua a 55 ° C durante 30 min.
- Verter una pequeña gota de glicerol, aproximadamente 300 l, a partir de la solución madre en dos portaobjetos de microscopio. El uso de un tejido, extendido glicerol en una delgada layer en cada una de las diapositivas. Esto proporciona una base y permite una fácil extracción de gelatina de glicerina en el paso 5.6.
- Corte la punta de una punta de pipeta de 1.000 l filtrada. El uso de puntas de pipeta de corte para transferir 1.000-1.500 l de jalea caliente glicerina lentamente a cada portaobjetos. Tenga cuidado para evitar burbujas.
- Deje diapositivas jalea glicerina sientan durante 5 minutos a temperatura ambiente para ajustar.
- Coloque cada diapositiva jalea glicerina en 60 mm × 15 mm plato de Petri y cubrir con papel plástico. Lugar a 4 ° CO / N. Opcionalmente, tienda de glicerina diapositivas jalea de hasta 5 días a 4 ° C.
4. Montaje de cámaras de huevos
- Usando muestras de la etapa 2.5, pipeta varias gotas 3 l de cámaras de huevos en 70% de glicerol a través de uno de glicerina jalea diapositiva. Continuar pipeteo 3 mu l gotas hasta que todas las cámaras de huevos están en esta diapositiva. Asegúrese de que cada gota contiene al menos diez cámaras de huevos. Mientras tanto, calentar un tubo de cultivo de gelatina de glicerina en un 55 ° C baño de agua.
- Colocar el portaobjetos jalea glicerina con cámaras de huevos bajo un microscopio de disección. Ajustar la ampliación de modo que sólo una gota de cámaras de huevo está en el campo de visión (Figura 1B).
- El uso de una aguja de calibre 30 como una cuchara, coger la cámara de la etapa de huevo deseado. Cuando sea necesario, cámaras de huevos deseados separados de una cadena ovariole utilizando la aguja como un cuchillo.
- Para evitar los desechos que puedan interferir con la imagen, transferir la cámara de huevos a la segunda diapositiva jalea glicerina, con la anterior frente a la izquierda (Figura 1E -1). Repita hasta que hay por lo menos siete cámaras de huevos alineados en una columna (Figura 1C).
- Formar nuevas columnas de siete hasta que todas las cámaras de huevos deseados se transfieren a la segunda diapositiva jalea glicerina.
- Corte un pequeño trozo de tejido y giro. Use esto para absorber el exceso de PBS-glicerol a partir de las cámaras de huevos tocando ligeramente cada una. Tenga cuidado de no eliminar cámaras de huevos.
- Cortar lapunta de una punta de pipeta 200 l filtrada. Utilice esta transferir 150 l de glicerina jalea para cubrir todas las columnas de cámaras de huevos.
NOTA: La cantidad de glicerina jalea necesario para cubrir las columnas se basa en las etapas de la cámara de huevo y el número de columnas. La cantidad puede ser ajustada. - Deje cámaras de huevos montados sientan durante 5 minutos a temperatura ambiente hasta que la capa superior de la jalea de la glicerina se solidifica por completo (Figura 1D).
- Ponga los portaobjetos de cámaras de huevos montados en una placa de 60 mm x 15 mm de Petri y cubrir con papel plástico. Almacenar a 4 ° CO / N para permitir que las capas de gelatina glicerina para solidifican juntos (lugar en la oscuridad si existe preocupación por photobleaching).
5. Preparación de Cámaras de huevo de la Imagen
- Coloque la diapositiva de cámaras de huevos montados bajo un microscopio de disección. Ajustar la ampliación de modo que sólo una columna de cámaras de huevo está en el campo de visión.
- Con un bisturí miniatura ángulo de 45 °, corte un straight línea a lo largo del lado derecho de la primera columna de cámaras de huevos (cerca de la parte posterior de las cámaras de huevos). (Figura 1D-E)
- A continuación, cortar por encima de la primera cámara de huevos en la parte superior y por debajo de la última cámara de huevos en la columna. En este punto la columna de cámaras de huevos se debe cortar en tres lados.
- El uso de un microknife, rebanada a lo largo del lado izquierdo de la columna, lo más cerca posible a la cara anterior de las cámaras de huevo (Figura 1E) -3.
- Pipetear 100 l de frío 1X PBT sobre la columna de la corte.
- Use una espátula de bordes redondeados para eliminar el exceso de gelatina de glicerina en torno a tres lados de la columna de la corte de cámaras de huevos y descartar, dejando el resto de la diapositiva.
- Inserte la espátula en el corte hecho en el lado anterior de cámaras de huevos y separar la columna desde el bloque de gelatina de glicerina primaria.
- Preparar las muestras, ya sea para invertidas (5.8.1) o vertical (5.8.2) de microscopía.
- Para Inverted Microscope: t Transferenciaque la columna de cámaras de huevos a un cubreobjetos con cara anterior de cámaras de huevos hacia abajo. Repita los pasos 5.2 a 5.8 hasta que se hayan eliminado todas las columnas de la jalea de glicerina y montado. Añadir un par de gotas de 50% PBS-glicerol en cada bloque de cámaras de huevos para evitar que se sequen. Cámaras de huevos imagen directamente sobre cubreobjetos.
- Para microscopio vertical: Transferir la columna de cámaras de huevos a un portaobjetos de microscopio con la cara anterior hacia arriba. Repita los pasos 5.2 a 5.9 hasta que se hayan eliminado todas las columnas de la jalea de glicerina y montadas en portaobjetos de microscopio. Añadir un par de gotas de 50% PBS-glicerol en cada bloque de cámaras de huevos y los bloques de la cubierta con un cubreobjetos ½ # 1.
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Resultados
El método de formación de imágenes en posición vertical nos permitió ver directamente la organización de células en el epitelio folicular anterior en la etapa 8. Un marcador general de destino de las células del folículo, la ausencia Eyes (EYA) de proteína, así como el marcador de ADN nuclear DAPI, mostró incluso expresión a través de este campo de las células, y demostraron que todas las células se podían ver con intensidades de tinción similares (Figura 2B "). Proteínas reguladas en respuesta a l...
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Discusión
Aquí se describe un método para montar y la imagen pequeña, el desarrollo de cámaras de huevos desde una perspectiva final sobre. Las técnicas comunes para cámaras de huevos de imagen se optimizan para las vistas laterales y permiten principalmente visualización precisa de las células del folículo medio-lateral cuando se tiñen con anticuerpos fluorescentes. El uso de la Z-pilas o 3-D ayudas reconstrucciones en la visualización de múltiples planos focales, pero sigue siendo insuficiente para la resolución sub-celular de ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Agradecemos la ayuda de los miembros de la comunidad de moscas, en particular de la Dra. Denise Montell, la Dra. Lynn Cooley y la Dra. Pernille Rorth, por sus reactivos. Agradecemos a Flybase, al Bloomington Drosophila Stock Center y al Developmental Studies Hybridoma Bank por la información y el suministro de existencias de moscas y anticuerpos, respectivamente. LM cuenta con el apoyo de la Subvención del Departamento de Educación, la Beca de Capacitación (P200A120017) de Asistencia a Graduados en las Áreas de Necesidad Nacional (GAANN) y por una Subvención de la Iniciativa NIGMS para Maximizar el Desarrollo Estudiantil (2 R25-GM55036). Una parte del trabajo de microscopía fue apoyada por la subvención DBI-0722569 de NSF MRI y el Keith R. Porter Core Imaging Facility. La investigación fue apoyada en parte por un premio NSF CAREER Award (1054422) y un premio Basil O'Connor Starter Scholar Award de March of Dimes, ambos otorgados a MSG.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,1 M Tampón de fosfato de potasio (KPO4 tampón) | Añadir 3,1 g de NaH2PO4• H2O y 10,9 g de Na2HPO4 (anhidro) a H2O destilado para obtener un volumen de 1 L. El pH de la solución final será de 7,4. Este búfer se puede almacenar hasta 1 mes a 4 °C. | ||
| Solución acuosa de paraformaldehído al 16%, grado EM | Ciencias de Microscopía Electrónica | 15710 | sin metanol para preservar la fluorescencia GFP |
| Aguja de 30G x 1/2 pulgada | VWR | BD305106 | Bisel regular |
| Levadura seca activa | Genesee Scientific | 62-103 | Para engordar moscas hembras |
| Albúmina sérica bovina Empresa | cultivo celular PAA | A15-701 | Utilizado en NP40 Tampón |
| de lavado Dumont #5 Pinzas | Fine Science Tools | 11295-10 | Aleación de Dumostar, punta biologie; las puntas afiladas son esenciales para la disección |
| de ovariolosDAPI (4′,6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato) | Sigma Aldrich | D9542 | 5 mg/ml solución madre |
| Suero fetal bovino (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Añadido al medio de disección del suplemento (10%) |
| Tubo de cultivo de vidrio | VWR | 47729-576 | 14 ml |
| Portaobjetos de depresión de vidrio | VWR | 470019-020 | 1,2 mm de espesor, gelatina de glicerina de doble cavidad |
| Electrónica Microsocpy Sciences | 17998-10 Medios de | montaje | |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% en PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (intercambiable para Nonidet P-40) Utilizado en NP40 Wash Buffer |
| Estereoscopio fluorescente Leica | Leica Microsystems | ||
| Microscopio confocal Leica SP5 | Leica Microsystems | 40x/0.55NA objetivo seco | |
| Micro espátula | VWR | 82027-518 | Portaobjetos |
| microscopio | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Tampón | 50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0,5% Ipegal, 1 mg/ml BSA y 0,02% azida sódica | ||
| Penicilina-Estreptomicina-Glutamina | Life Technologies | 10378-016 | Añadido al medio de disección complementario (0,6X) |
| Petridish- Polisterino, estéril | VWR | 82050-548 | 60 W x 15 H |
| mm Tampón de fosfato salino | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 paquetes de polvo |
| Fosfato de potasio dibásico | Sigma Aldrich | P3786-500G | Utilizado en 0,1 m KPO4 Buffer |
| Fosfato de potasio monobásico | Sigma Aldrich | P9791-500G | utilizado en 0,1 M KPO4 Buffer |
| [header] | |||
| Schneider' s Tecnologías de | vida | 11720018 | con L-glutamina y bicarbonato de sodio |
| Azida de sodio | Sigma Aldrich | S2002-25G | Utilizado en la tinción de anticuerpos fluorescentes |
| Cloruro de sodio | Sigma Aldrich | S3014-500G | Utilizado en NP40 Tampón de lavado |
| TRIS-HCl | IBI Scientific | IB70144 | 1 M TRIS-HCl, pH 7.4 |
| Volocity Imagen 3D Software de análisis | PerkinElmer | Para el procesamiento de pilas Z confocales |
Referencias
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