Este manuscrito describe el uso de la tecnología de vanguardia proporcionada por los microarrays de ADN. Los microarrays proporcionan una visión general de los cambios transcriptómicos en las bacterias que se producen en una condición específica. Además, destacamos la facilidad con la que se pueden analizar grandes cantidades de datos mediante el uso de convenientes paquetes de software desarrollados internamente.
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Artículo de método
Una tubería rápida y fiable para el estudio de caso Análisis Bacteriano Transcriptome: Regulación Génica Serina-dependiente en
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Resumen
Resumen
La expresión génica y su regulación son muy importantes para entender el comportamiento de las células en diferentes condiciones. Varias técnicas se utilizan hoy en día para estudiar la expresión génica, pero la mayoría están limitados en términos de proporcionar una visión global de la expresión de todo el transcriptoma. Microarrays de ADN ofrecer una tecnología de investigación rápida y económica, lo que da una visión completa de la expresión génica global y tienen un gran número de aplicaciones, incluyendo la identificación de nuevos genes y factores de transcripción sitios, la caracterización de la actividad transcripcional de las células y también vinculantes ayudar en el análisis de miles de los genes (en un solo experimento). En el presente estudio, las condiciones para el análisis del transcriptoma bacteriana de cosecha de células para el análisis de microarrays de ADN han sido optimizados. Teniendo en cuenta el tiempo, los costos y la precisión de los experimentos, esta plataforma tecnológica resulta ser muy útil y universalmente applicabale para estudiar transcripto bacterianames. Aquí, realizamos el análisis de microarrays de ADN con Streptococcus pneumoniae como un caso-estudio comparando las respuestas transcripcional de S. pneumoniae cultiva en presencia de diferentes concentraciones de L-serina en el medio. El ARN total se aisló utilizando un método de Macaloide utilizando un kit de aislamiento de ARN y la calidad del ARN se comprobó mediante el uso de un kit de comprobación de la calidad del ARN. Se preparó ADNc utilizando transcriptasa inversa y las muestras de ADNc se marcaron utilizando uno de los dos colorantes fluorescentes de amina reactiva. Hechas en casa de ADN de microarrays diapositivas fueron utilizados para la hibridación de las muestras de ADNc marcadas y los datos de microarrays se analizaron mediante el uso de un marco de pre-procesamiento de datos de microarrays de cDNA (Microprep). Finalmente, Cyber-T se utilizó para analizar los datos generados usando Microprep para la identificación de estadísticamente significativas genes expresados diferencialmente. Paquetes de software Además, construido en la casa (pimienta, FIVA, DIVULGAR, FISCAL, Genome2D) se utilizaron para analizardatos.
Introducción
El estudio de todo el conjunto de la abundancia de ARNm (transcriptoma) codificada por el genoma de un organismo unicelular o una célula eucariota en un momento específico o bajo una condición específica, incluyendo la sobreexpresión del gen o knock-out, se llama transcriptómica. Transcriptómica nos permite observar hasta qué punto los genes se expresan bajo una condición particular en un punto X tiempo y nos da información acerca de la fuerza con los genes se expresan con respecto a una referencia.
Un microarray es una matriz bidimensional sobre un sustrato sólido (por lo general un portaobjetos de vidrio o silicio de células de película....
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Protocolo
1. Preparación de los medios de comunicación, y cultivo celular
- Crecer S. D39 pneumoniae cepa de tipo salvaje 21 como se describió anteriormente 11. Inocular células almacenadas a -80 ° C en glicerol al 10% (con relación 1/100 en tubos de 50 ml estériles) en 50 ml químicamente medio definido (CDM) con un pH final de 6,4 15, pero omitir L-serina a partir del aminoácido mezcla.
Nota: se utilizaron dos MDL diferentes; uno que contiene una concentración mínima de L-serina (150 mM) y el otro que contiene una concentración máxima de L-serina (10 mM). Esta concentración mínima es básicamente la ....
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Resultados
ARN, aislamientos y análisis de ADNc
L-serina es uno de los aminoácidos esenciales y su concentración en el plasma sanguíneo humano varía desde 60 hasta 150 mM en niños y adultos. Su papel en la biosíntesis de purinas y pirimidinas destaca su importancia en el metabolismo y es un precursor de varios aminoácidos (glicina, cisteína y triptófano). Para estudiar el impacto de la L-serina en todo el transcriptoma de S. Se realizó pneumoniae D39 cepa de tipo salv.......
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Discusión
Se describe un protocolo fácil de usar que puede ser aplicado para realizar el análisis del transcriptoma enteras de bacterias. El punto clave de esta técnica en particular es que las condiciones en que se cosechan las células variará. Después de cosechar las células y el aislamiento de ARN, esta técnica se hace igual para todos los tipos de muestras bacterianas y sigue los pasos exactamente idénticos y por lo tanto, se puede aplicar a cualquier tipo de cultivo bacteriano. El protocolo es muy simple y conveniente y comi.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Damos las gracias a Anne de Jong y Siger Holsappel para obtener ayuda con la producción de diapositivas microarrays de ADN. El apoyo de Anne de Jong para el análisis de la bioinformática también se agradece. También agradecemos a Jelle Slager para revisar el documento. Muhammad Afzal y Irfan Manzoor son apoyados por la Universidad GC, Faisalabad, Pakistán bajo el programa de desarrollo de la facultad de HEC Pakistán.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Fenol ácido | SigmaAldrich | P4682 | |
| Kit de aislamiento de ARN Roche | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Perlas | de vidrio 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent G2940CA | ||
| Superscript III | Tecnologías de vida Invitrogen 18080044 | ||
| AA-dUTP | Tecnologías de vida Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Tecnologías de vida Invitrogen | ||
| primer tampón de hebra | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Enfriador Speedvac | Eppendorf | RUGNE3140 | Concentrador Speedvac plus |
| Horno de hibridación | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | ||
| Toallita | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Cargador automático Genpix 4200A1 | MSD tecnologías | Escáner de microarrays | |
| Bicarbonato de sodio | SigmaAldrich | 104766 |
Referencias
- Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
- Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods.
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Reimpresiones y permisos
