Utilizando el Electrorretinograma para evaluar la función en el Roedor Retina y los efectos protectores de distancia Limb Preacondicionamiento Isquémico

Resumen

El electrorretinograma (ERG) es un potencial eléctrico generado por la retina en respuesta a la luz. En este trabajo se describe cómo utilizar el ERG para evaluar la función de la retina, en ratas adaptadas a la oscuridad, y cómo se puede utilizar para evaluar una intervención neuroprotectora, en el presente caso el precondicionamiento isquémico a distancia.

Resumen

El ERG es la suma de toda la actividad de la retina. El ERG generalmente se registra desde la córnea, que actúa como una antena que recoge y suma las señales de la retina. El ERG es una medida sensible de los cambios en la función de la retina que son pan-retinianos, pero es menos eficaz para detectar el daño confinado a una pequeña área de la retina. En el presente trabajo describimos cómo registrar el ERG 'flash', que es el potencial generado cuando la retina se expone a un breve destello de luz. Describimos los métodos de anestesia, midriasis y manejo de la córnea durante el registro; cómo mantener la retina oscura adaptada; materiales y colocación de electrodos; el rango y la calibración de la energía del estímulo; el registro de parámetros y la extracción de datos. También describimos un método para inducir isquemia en una extremidad y cómo usar el ERG para evaluar los efectos de esta isquemia alejada de la retina en la función de la retina después del daño por luz. Se describe un protocolo de dos destellos que permite el aislamiento del componente impulsado por el cono del ERG adaptado a la oscuridad y, por lo tanto, la separación de los componentes de la varilla y el cono. Debido a que se puede registrar con técnicas que son mínimamente invasivas, el ERG se ha utilizado ampliamente en estudios de fisiología, farmacología y toxicología de la retina. Describimos un ejemplo de esta utilidad, en el que se utiliza el ERG para evaluar la función de la retina dañada por la luz, con y sin intervención neuroprotectora; Preacondicionamiento por isquemia remota.

Introducción

El ERG es un potencial eléctrico generado por la retina en respuesta a la luz, y grabado de la superficie corneal del ojo. Cuando las condiciones de grabación se manejan con cuidado, el ERG se puede utilizar en una variedad de maneras para evaluar la función de la retina. Aquí describimos cómo grabar el 'Flash ERG', el potencial generado cuando la retina se expone a un breve, flash brillante presentado en un fondo Ganzfeld. El Ganzfeld dispersa la luz de forma homogénea y el flash de la luz alcanza toda la retina aproximadamente uniforme. Si la retina está oscuro adaptado antes de grabar, y la oscuridad, la adaptación se mantiene como el animal se prepara para la grabación, el ERG obtenido se genera por ambas fotorreceptores conos y bastones.

El oscuro-adaptado de flash ERG tiene una forma de onda característica, que ha sido analizada de dos maneras. En primer lugar, principios y finales de los componentes de la forma de onda ERG se han distinguido, y en relación con la secuencia de la neuronaal activación en la retina. El primer componente es una latencia corta en sentido negativo potencial, la onda a (Figura 1). Esto es seguido por un potencial positivo va, llamada la onda b. La fase ascendente de la onda b muestra oscilaciones, que se consideran un componente separado (potenciales oscilatorios o PO). La onda a se considera que está generada por fotorreceptores, la onda b por las células de la capa nuclear interna, y los PO por las células amacrinas ^1.

Sobre la base de la fuerza del estímulo, las respuestas a destellos muy tenues denominan el umbral de respuesta escotópica son posibles. El umbral de respuesta escotópica se entiende que ser generado a partir de las células ganglionares de la retina ^2-4. En segundo lugar, el flash ERG se puede separar por adaptación a la luz, o por un protocolo de dos flash descritos a continuación, en componentes de bastón y cono impulsada. En condiciones fotópicas, la onda a es no detectable en ratas, porque la población de cono es baja, pero PO y una onda b sonclaro ^5. En los primates, cuyas retinas tienen poblaciones cono superior, tanto de varilla y las vías de cono generan una detectable una onda ^6.

Dos medidas útiles a menudo extraídos de la ERG flash son las amplitudes de la a- y b-ondas, medidos como en la Figura 1, con respuestas de flash típicos mostrados en la Figura 2. Cuando la población fotorreceptor se reduce, por ejemplo por la exposición a damagingly brillante luz, se reducen todos los componentes del ERG. Intervenciones neuroprotectoras, como a distancia precondicionamiento isquémico (RIP), pueden ser validados por la preservación de las amplitudes de la a- y b-ondas (Figura 3). En resumen, el análisis de la ERG permite comparaciones entre sana, ligera y de la retina dañada neuroprotected.

Protocolo

Este protocolo sigue las directrices de cuidado de animales de la Universidad de Sydney.

1. Electrodos Fabricadores

1. Construir el electrodo positivo (el que se pondrá en contacto la córnea) a partir de un corto (5 cm) longitud de alambre de platino 1-2 mm de diámetro. Moda en un bucle de unos pocos milímetros de diámetro. Conecte este lazo a una ventaja convencional, el tiempo suficiente para llegar a la etapa de entrada del amplificador (ver Figura 4).
2. Construir el electrodo negativo (que irá en la boca del animal) utilizando un Ag / AgCl pellet 1-2 mm de diámetro, también conectado a una ventaja de convención (véase la Figura 4).
3. Como electrodo de referencia (que entrará en la grupa del animal), utilice una aguja hipodérmica limpia (23 G), también conectado a un cable de longitud adecuada (ver Figura 4).
4. Lo ideal es usar cables de tres líderes proporcionadas por los fabricantes de instrumentos, para conectar los tres electrodos (U positivo94; córnea, negativo → boca, la referencia → grupa) al amplificador.

2. Conexión y calibración del estímulo de luz y ERG Set-up

1. Crear (o localizar a) un laboratorio de grabación pequeño, que puede hacerse oscuro. Equipar con uno o ambos de una luz sobre-el-banco hecho de color rojo o una cabeza con lámpara roja.
2. Use un medidor de luz para confirmar que la iluminación de luz roja alcanzando el ojo de la rata durante la instalación no exceda de 1 lux.
   Nota: un filtro de densidad neutra se puede utilizar para reducir el brillo de la lámpara y la fuente de luz de la lámpara debe emitir específicamente luz roja. Adaptación oscuro se verá comprometida si las fuentes de luz emiten bajas (longitudes de onda visibles).
3. Sellar toda la luz parásita que entra en el laboratorio de grabación (esto a menudo requiere persistencia con cinta opaca) y preparar un filtro de densidad neutra (esto se puede comprar en las hojas) lo suficientemente grande como para caber en, y tan tenue, cualquier pantalla de ordenador que tendrá en el laboratorio.
   Nota: La luz parásita yla luz de una pantalla son suficientes para perjudicar adaptación a la oscuridad de los ojos de rata.
4. Conecte el amplificador al hardware de adquisición de datos. Conecte cables positivo, negativo y de referencia para el amplificador. Asegúrese de que el ordenador y la fuente de alimentación Ganzfeld LED estén bien conectados a una fuente de tierra.
   Nota: Algunos laboratorios han especializado puntos de puesta a tierra, conectado a una tierra del edificio; una pipa de agua es una alternativa eficaz.
5. Calibrar la fuente de luz LED con un radiómetro-calidad de la investigación. Fije el sensor del medidor en la posición en la que los ojos del animal se encuentra durante un experimento.
6. Programa de los LED Ganzfeld para ejecutar un protocolo ERG de campo completo con aumentos graduales en la energía flash, duración del flash, flash de repetición y el tiempo entre destellos, denominado intervalo interstimuls (ISI), los ajustes. Por ejemplo, un protocolo de campo completo véase el cuadro 1.
   Nota: El campo completo ERG destellos aumentan de destellos tenues repetitivas abderecha parpadea de una manera sabia paso. El programa de flash doble continuación del protocolo de campo completo y permite el aislamiento de las respuestas de conos y bastones.

3. Día Antes de ERG Experimentación

1. Oscuro adaptarse ratas Sprague-Dawley de 12 hr antes de la grabación. Es conveniente hacer esto en el laboratorio de grabación, una vez que la luz externa se ha eliminado.

4. Día de ERG Experimentación

1. Haga arreglos para que el animal sea calienta suavemente durante la grabación. Utilizamos una plataforma de metal ligero construido de manera que la cabeza del animal puede descansar en el punto correcto en la entrada a la Ganzfeld. La plataforma tiene tubo incorporado a través del cual bombeamos agua precalentada a 40 ° C en un baño de agua.
   Nota: La experiencia demuestra que esto mantiene la temperatura central del animal a 37 ° C.
2. Pesar la rata en condiciones de oscuridad. Apunte el peso y compensar ketamina correcta (60 mg / kg) y xilazina (5 mg / kg) dosis. Restringir la rata gently e inyectar anestesia por vía intraperitoneal.
3. Nota momento de la inyección. Una vez que el animal está inconsciente (generalmente dentro de 5 min) comprobar la profundidad de la anestesia ligeramente pellizcar una almohadilla del pie, para ver si una respuesta refleja está presente. Lo mejor es esperar hasta que este reflejo está ausente o débil, antes de proceder.
4. Aplique una gota de atropina y otro de proxmethacaine a la córnea.
5. Cortar una longitud de 10 cm de hilo negro. Haga un lazo con un nudo simple y deslice el aro sobre el ecuador del ojo. Apriete ligeramente; el efecto es dibujar el globo ocular ligeramente hacia adelante, con una presión mínima. Esto mantiene la córnea clara de los párpados.
6. Aplicar ojo carbómero cae a la superficie de la córnea. Asegurar carbómero permanece en la superficie de la córnea y no se derrame en los párpados o la cara.
7. Coloque la ropa de cama absorbente en la parte superior de la plataforma climatizada.
8. Posición de la rata en la ropa de cama, con la cabeza en el lugar recomendado en la apertura de la Ganzfeld.
9. Insertar intsonda de temperatura ernal en el recto. Sonda de temperatura segura en posición con cinta adhesiva el cable de la sonda a la cola.
10. Inserte el electrodo de referencia (la aguja 23 G) por vía subcutánea en la pata trasera, y conectarse a un amplificador.
11. Coloque el electrodo negativo (el sedimento de Ag / AgCl) de forma segura en la boca. Para evitar que esto se salga de la boca, colocar el cable de conexión a una superficie estable.
12. Coloque el electrodo positivo sobre el centro de la córnea. El uso de un micromanipulador, asegúrese de que el electrodo toca la córnea con suavidad.
13. Revise la temperatura del cuerpo está en 37,0 a 37,5 ° C.
14. Una vez que el animal esté correctamente colocado y electrodos están en su lugar, cubrir toda la configuración (Ganzfeld y animal) con un material opaco (para preservar la adaptación a la oscuridad). Utilizamos un paño negro suave.
15. En el software de adquisición ajustado a una frecuencia de muestreo de 2 KHz con un tiempo de colección de 100 a 1000 ms con 5 ms de muestreo pre-colección. Establezca los filtros de paso de banda para 1-1.000Hz y asegurar que el muestreo se activa para probar el periodo de ~ 250 ms después de un flash.
16. Compruebe la línea de base de la grabación. Debe estar libre de ruidos extraños, pero muestran un poco de ruido del amplificador y una oscilación respiratoria.
17. Si la línea de base muestra ruidos extraños, comenzará la solución de problemas. La mayoría de los problemas están relacionados con el deslizamiento en la posición del electrodo, o de puesta a tierra. Utilice una jaula de Faraday para garantizar grabaciones están libres de ruidos extraños.
18. Ejecute un destello de prueba, 0,4 log scot cd.sm ^-2. Una forma de onda ERG similar a la figura debería aparecer 2A. En nuestras respuestas típicas de laboratorio para un 0,4 log scot cd.sm ^-2 Flash son (una onda: -474 ± 39 mV y la onda b: 1.512 ± 160 mV, n = 11).
19. Deje que los animales a oscuro re-adaptarse durante 10 min. Es conveniente utilizar estos 10 min para volver a comprobar la línea de base.
20. Tras la confirmación de señal estable comenzar la grabación.
21. Al final de la sesión de grabación, compruebe que temperat cuerpose mantuvo ure. Retire los electrodos. Vuelva a aplicar polímero carbómero de córneas. Deje que el animal se recupere en una almohadilla de calor hasta que es completamente móvil y activo, antes de regresar a la vivienda de los animales.

5. La isquemia a distancia

1. Realizar isquemia a distancia, ya sea en roedores despiertos o anestesiados.
2. Si se anestesia el animal, lo pondré sobre una plataforma climatizada (arriba) y deslice el manguito del esfigmomanómetro sobre la parte superior de la extremidad posterior, clara de la rodilla.
3. Si los animales están acostumbrados a ser manejado, es posible llevar a cabo este procedimiento sin anestesia; esto requiere dos personas. A una persona le restringe el animal suavemente, y la segunda se aplica el manguito del esfigmomanómetro y opera el esfigmomanómetro.
4. Para los animales despiertos, use un pedazo de toalla de ~ 15 cm x 30 a 50 cm para envolver suavemente el animal, con un solo miembro posterior libre. Colocar el animal en la espalda a (por ejemplo) el antebrazo izquierdo, con la cabeza metida entre el brazo y el torso del titular, y el lugarel brazalete como se acaba de describir.
5. Desinflar el manguito y asegurar la válvula de presión de aire se cierra. Bombee el manguito a 160 mmHg en animales anestesiados, y 180 mmHg en animales despiertos. Esto supera la presión sistólica (generalmente 140 mmHg y 160 mmHg respectivamente).
6. Mantener estas presiones, según sea necesario, utilizando la bomba de mano.
7. Después de la hora prevista para la isquemia (usamos 2 períodos de 5 min separadas por 5 min de reperfusión), desinflar la presión del manguito aflojando la válvula de presión de aire.
8. Confirmar el efecto de la isquemia a distancia con una sonda de temperatura de la piel unida a la almohadilla de la pata. Temperatura de la piel por lo general cae 32-30 ° C, durante 5 min y se recupera en la reperfusión.

6. Daño Luz

1. Asegúrese de que las ratas están en un oscuro adaptado durante la noche, antes de que el procedimiento de daño de la luz.
2. En el momento apropiado después de isquemia de las extremidades (en nuestros experimentos sin demora), cada animal se coloca en solitario en una cajas de plexiglás, wiª de agua y alimentos en recipientes con base de suelo.
   Nota: El daño inducido por la luz sólo puede llevarse a cabo en animales albinos.
3. Encender una luz blanca pre-calibrado 1.000 lux a un tiempo estándar (normalmente 09 a.m.) y mantener esta condición durante 24 horas.

7. ERG extracción de datos y análisis

1. Adquirir formas de onda promediados del ERG. Si es necesario, correcto para una línea de base distinto de cero, por sustracción.
2. Medir la amplitud de la onda a (presentado en mediados a altas intensidades de estímulo), como la diferencia de voltaje entre la línea de base y la primera (<30 mseg latencia) canal (Figura 1).
3. Mida la amplitud de la onda b como la diferencia de voltaje entre el pico de la onda A y el positivo de la siguiente ola, que se producen normalmente en una latencia de 80 a 100 ms (Figura 1).
4. Aislar potenciales oscilatorios mediante el uso de una transformada de Fourier para filtrar los datos 60 a 235 Hz, con una banda de transición 90 Hz ^{7. Si se requiere la señal potencial oscilatorio aislado puede entonces ser restada de la forma de onda sin filtrar para confirmar la identidad de la vaguada de onda a.}
5. El tiempo implícito (latencia) de los picos A y B de onda también puede ser una medida útil (Figura 1). Utilice los destellos individuales para aislar la respuesta varilla. Restar la respuesta de los conos (flash 2) de la respuesta mixta (flash 1) para aislar la respuesta de varilla (Figura 2).
6. Normalizar la intensidad de luz individual una onda y amplitudes de onda b (post-tratamiento / post-tratamiento-base) o un promedio de grupos de tratamiento. Curvas Intensidad-respuesta trazar las amplitudes de grupo y de error contra la energía flash.

Resultados

El protocolo se puede utilizar para medir la función visual de la retina de roedores in vivo. La onda a, una medida de la función de los fotorreceptores, y la onda b, una medida de la función de la retina interna, se anotan en la Figura 1.

Las señales ERG aumentos de barra dominadas con el creciente estímulo de luz, como se muestra en la Figura 2A. La onda se convierte en un aparente en ~ 0,4 log scot cd.sm ^-2 y la amplitud de la onda aum...

Discusión

El método ERG flash adaptada a la oscuridad descrito anteriormente es un método fiable para evaluar la función de la retina en ratas. Tanto la onda ay la onda b se redujeron en un daño de la luz. Remoto precondicionamiento isquémico mitigado reducciones inducidas daños-luz en la onda ay la onda b. Esta preservación de la función retiniana sugiere que el precondicionamiento isquémico remoto ha inducido neuroprotección, asemejándose a otras formas de acondicionamiento previo de protección, tales como hipoxia, isquemia y e...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ordenador
Powerlab, hardware de adquisición de 4 canales	AD Instruments	PL 35044	Adquisición de ERG
Animal Bio Amp	AD Instruments FE	136	Amplificador para ERG
Lab chart	AD Instruments		Software de recogida de señales
Ganzfield	Soluciones fotométricas	FS-250A	Estímulo luminoso
Sistema operativo Ganzfield	Soluciones
Investigación Radiómetro	Tecnologías de luz internacionales	ILT-1700	calibrar serie
de luz Luxómetro		LX-1010B	comprobar luz roja ilustración
Excel	Microsoft
Cables conductores	AD Instruments		Conectar positivo, negativo electrodos de tierra al amplificador
Cables conductores - cocodrilo	AD Instruments		campo de tierra y hardware de adquisición a la computadora
Alambre de platino 95%	A&	Electrodo positivo de
Electrodo de boca Ag/AgCl Pellet	SDR	E205	electrodo negativo
Aguja 26 G	Electrodo de tierra	BD
Tubo de
Sistema de manta homeotérmica con sonda flexible	Harvard Appartus	507222F
Atropina 1% p/v	Bausch & Lomb		midriasis tópica
Proxmeticaína 0.5% p/v	Bausch &	Anestésico tópico
lágrimas de Visco, colirio	Novartis		polímero de carbómero
retráctil	con rosca
Pinzas
Adhesivo reutilizable	Blu tac		Dim linterna frontal roja. Electrodos de fijación
Lecho
Ketamil - ketamina 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		disociativo
Xilio - Xilacina 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		relajante muscular
Escala