El Doble-H Maze: Una prueba del comportamiento robusto para el Aprendizaje y la Memoria en roedores

Summary

El objetivo de este protocolo es investigar la cognición espacial en roedores. El laberinto acuático de doble H es una prueba novedosa, que es particularmente útil para dilucidar los diferentes componentes del aprendizaje, la consolidación y la memoria, así como la interacción de los sistemas de memoria.

Abstract

Investigación cognición espacial en roedores típicamente emplea el uso de tareas laberinto, cuyos atributos variar de un laberinto a la siguiente. Estas tareas varían por su flexibilidad conductual y la duración de la memoria requerida, el número de objetivos y caminos, así como la complejidad de la tarea global. Una característica de confusión en muchas de estas tareas es la falta de control sobre la estrategia empleada por los roedores para llegar a la meta, por ejemplo, (procedimiento) estrategias basadas-declarativas (como) o egocéntricos alocéntricos. El laberinto de doble H es una tarea de memoria de escape de agua novela que aborda esta cuestión, al permitir que el experimentador para dirigir el tipo de estrategia aprendido durante el periodo de formación. El laberinto de doble H es un dispositivo transparente, que consiste en un callejón central con tres brazos que sobresalen en ambos lados, junto con una plataforma de escape sumergida en la extremidad de uno de estos brazos.

Las ratas pueden ser entrenados utilizando una estrategia alocéntrica alternando la stposición arte en el laberinto de una manera impredecible (véase el protocolo 1; §4.7), requiriendo así a aprender la ubicación de la plataforma en base a las señales allothetic disponibles. Por otra parte, una estrategia de aprendizaje egocéntrica (protocolo 2; §4.8) puede ser empleado por la liberación de las ratas de la misma posición durante cada ensayo, hasta que aprendan el patrón de procedimiento necesario para alcanzar la meta. Esta tarea ha sido probada para permitir la formación de huellas de la memoria estables.

La memoria puede ser sondeó después del período de entrenamiento en un ensayo de sonda engañosa, en el que la posición de partida para el suplentes ratas. A raíz de un paradigma de aprendizaje egocéntrico, ratas normalmente recurren a una estrategia basada en alocéntrica, pero sólo cuando su vista inicial sobre las señales extra-laberinto difiere notablemente de su posición original. Esta tarea es ideal para explorar los efectos de drogas / perturbaciones en el rendimiento de la memoria alocéntrica / egocéntrica, así como las interacciones entre ªESE dos sistemas de memoria.

Introduction

En los animales, el aprendizaje está mediado principalmente por los sistemas de memoria hippocampal- y basada en el cuerpo estriado ^1,2, que desempeñan un papel central en relación con colocación y procesal-memoria, respectivamente. La relación entre estos dos sistemas es compleja, y se sabe que interactúan entre sí de maneras cooperativos o competitivos ^1,3. Además, los estudios han demostrado que la influencia de cualquiera de estos sistemas de memoria sobre el comportamiento animal puede aumentar después de la ausencia o daño del otro sistema ^4-7. Ambos de estos sistemas están conectados a la corteza prefrontal a través del tálamo.

Numerosos trastornos neurológicos y enfermedades neurodegenerativas pueden afectar la cognición espacial en los seres humanos, que se basan en la interacción entre los sistemas de memoria de procedimiento y declarativo. Los ejemplos incluyen la enfermedad de Parkinson (PD), la enfermedad de Huntington (HD) ^8-10, la enfermedad de Alzheimer (AD) ^11-14, así comoLa esclerosis lateral amiotrófica (ELA) ^15. Los modelos animales, que son relevantes para estos trastornos pueden ser inducidos a través de diversos tratamientos con fármacos que bloquean ciertos receptores ^16, así como a través de lesiones específicas. Cuando dichos animales se utilizan con tareas de memoria espacial, una información valiosa puede ser adquirida en los mecanismos subyacentes relacionados con estos trastornos, así como para diversas opciones de tratamiento.

Hay muchos tipos diferentes de tareas de memoria espacial en roedores, que colectivamente están diseñadas para evaluar aspectos específicos de aprendizaje y la memoria, así como los efectos de los tratamientos potenciales para diversos trastornos ^17,18. Estas tareas se pueden distinguir por el número de goles y las vías, el grado de flexibilidad de comportamiento en la solución de la tarea, la duración de memoria o de retardo, así como la elección de la estrategia usada en la solución de la tarea. Un buen rendimiento puede ser adquirido en base a las señales o puntos de referencia externos que se utilizan para orientarel animal hacia el objetivo (una estrategia alocéntrica o lugar). Alternativamente, un roedor puede desarrollar una estrategia que se basa en la dirección física y señales con respecto a la dirección para moverse en (una estrategia egocéntrica o de procedimiento), por ejemplo, si una rata sabe que la meta es una vuelta a la izquierda seguido de un giro a la derecha , entonces hay poca necesidad de una estrategia alocéntrica o lugar. Tareas Maze menudo difieren según el grado de flexibilidad que ofrece a los roedores en la solución de ellos. Por ejemplo, en el laberinto acuático de Morris, una versión seca de este último (por ejemplo, ¹⁹⁾ o el laberinto Barnes (por ejemplo, ^20), no son potencialmente infinitas rutas de la rata puede tomar para llegar a la meta. En el laberinto acuático de Morris, por ejemplo, la ubicación de la meta puede ser aprendido basado en hitos o señales (estrategia alocéntrica) externos, o simplemente nadar en círculos hacia el centro hasta que la plataforma se encuentra (estrategia egocéntrica) ^21. Algunas tareas tienen múltiples objetivosy un alto grado de flexibilidad, como la tarea de cono campo ²² o radial de Olton laberinto ^23. En el otro extremo de la escala son tareas, que ofrecen una flexibilidad limitada para llegar a la meta, por ejemplo, el laberinto de piedra, o la versión alterna de la T-laberinto. Estas tareas proporcionan una sola manera correcta de llegar a la meta y facilitan la aparición de rutinas cognitivas que se rigen principalmente por el sistema de memoria de procedimiento basado en el estriado.

El laberinto de doble H es un nuevo dispositivo de pruebas de memoria espacial, que fue diseñado para permitir que el experimentador para dirigir el tipo de estrategia que se aprende por los roedores en la solución de la tarea ^24. Consta de tres brazos corren paralelas cortadas por un callejón central de perpendicular, el laberinto de doble H es una tarea de escape de agua en la que los roedores aprenden a llegar a una plataforma de escape que se sumerge en una de las ubicaciones laberinto. Durante el entrenamiento, una estrategia de procedimiento puede ser desarrollado por el mantenimiento de tél mismo inicio y ubicaciones meta de todo. Por otra parte, una estrategia alocéntrica puede desarrollarse por la alternancia de la ubicación inicial en un orden aleatorio, por lo que requiere la rata de aprender la ubicación de la plataforma de búsqueda basado en señales ambientales, ya que tiene que hacer en un laberinto de agua. Esto supera un obstáculo presente en muchas tareas diferentes laberinto, en el que el experimentador de lo contrario tiene poco control sobre el tipo de estrategia que utilizan roedores. Esto es importante cuando se considera que los efectos de ciertos fármacos candidatos mejoran la cognición se basan en el sistema lugar-memoria basada en el hipocampo, así la aparición de rutinas o procedimientos cognitivos puede confundir la interpretación de las observaciones de comportamiento cuando los animales, por ejemplo, interruptor de alocéntrica a la memoria de procedimiento durante el curso de capacitación. Del mismo modo, puede ser deseable para evaluar los efectos de los fármacos y tratamientos en la memoria de procedimiento, sin la influencia de la memoria basado en el lugar alocéntrica. Finalmente, este dispositivopuede ser utilizado para estudiar las interacciones cooperativas o competitivas entre estos sistemas de memoria, y las condiciones en que los roedores pueden cambiar de un sistema a otro.

Protocol

1. Consideraciones generales

Este protocolo ha sido aprobado por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo de Hospital Universitario de Friburgo (lo mismo para Estrasburgo). La agudeza visual es necesaria para el desempeño en las pruebas de aprendizaje espacial. Los roedores con sistemas visuales deteriorados por lo tanto no son adecuados. Además, la iluminación debe ser suficiente para que las ratas para ver las diferentes señales situadas en las paredes circundantes. Es útil para utilizar las señales básicas en forma (cuadrado, círculo, triángulo), pero bien contrastados (por ejemplo, las señales pintadas de negro sobre un fondo pintado de blanco). Del mismo modo, los déficits motrices severos son los criterios de exclusión, porque la natación es necesaria para esta prueba y ahogamiento puede ocurrir. Por último, los roedores hiper-ansiedad pueden mostrar un comportamiento de búsqueda fuertemente sesgada, lo que repercute en el rendimiento.

2. Aparato Set Up

1. Construir un laberinto de doble H que consiste en un callejón central de 160 cm, que está intersectado en ambos extremos y en el centropor tres paralelos ejecutar brazos 160 cm (ver Figura 1). Asegúrese de que el callejón central y sus brazos perpendiculares son 20 cm de ancho, y están rodeados por 35 cm de alto paredes de plexiglás transparente. Grosor del plexiglás es de 6 mm para todas las partes.
2. Asegure las paredes en su lugar con pegamento y tornillos, y resistente al agua el laberinto usando juntas de silicona en todos los ángulos internos. Estas juntas pueden ser reemplazados fácilmente en caso de que pierda su impermeabilidad. Colocar una salida de drenaje en la extremidad de uno de los brazos de esquina (o en el centro del laberinto) para el vaciado.
3. Coloque el laberinto en una mesa alta de 80 cm, con un espacio adecuado a su alrededor para una) caminando por el laberinto, y b) la colocación de señales bien contrastados. Designar cada brazo en el laberinto por su posición, es decir, al noroeste (NW), norte (N), noreste (NE), suroeste (SW), sur (S) y sureste (SE).
4. Coloque una cámara montada en el techo por encima del laberinto para el análisis posterior a la prueba de la conducta animal, utilizando ya sea manual o autmétodos omatic (vídeo-seguimiento) (véase el § 5).

3. Comentarios generales

1. Antes de usar, llenan el laberinto con agua hasta una altura aproximada de 18 cm (200 L). Esto es lo suficientemente alta como para evitar que las ratas de tocar la parte inferior del laberinto con sus pies, pero lo suficiente para evitar el escape de poca profundidad.
2. Después de pre-entrenamiento, hacer que el agua opaca mezclando 250 g de leche desnatada en polvo. Cambie el agua diariamente para evitar que el agua de la leche se vuelva rancio. Mantenga la temperatura del agua entre 21 a 23 ° C para proporcionar incentivos para que las ratas buscan la plataforma de escape.
   NOTA: A medida que las ratas se familiaricen con la posición de la plataforma durante el pre-entrenamiento, su posición se mueve a un brazo diferente durante el entrenamiento.
3. Antes de su uso, sumerja una plataforma de diámetro 17 cm de alto, 10 cm en el extremo de uno de los brazos de esquina (NE, NW, SE o SW). Asegúrese de que la altura para ser sumergido es 1 cm por debajo de la superficie de la superficie del agua. Capacitar a las ratas para llegarla plataforma de destino utilizando una estrategia de aprendizaje egocéntrica alocéntrica o, lo que depende del tipo de paradigma utilizado (véase § 4).

4. Protocolos de formación básica

NOTA: Las ratas son típicamente provistos de un día inicial de pre-entrenamiento, lo que les permite familiarizarse con el laberinto.

1. Para pre-formación liberar la rata desde la extremidad de uno de los brazos centrales (por ejemplo, S brazo) y coloque la plataforma de peligro en la extremidad de uno de los brazos de la esquina (por ejemplo, NE), a continuación, dar las ratas 4 consecutivo 60 sec ensayos en los que llegan a la plataforma de destino.
2. Al llegar a la plataforma de escape, permite la rata para esperar allí por 15 seg, de modo que puedan descansar y observar su entorno. Independientemente de la posición de inicio, siempre bloquear el brazo opuesto con una puerta de guillotina transparente, lo que evita la entrada.
   NOTA: Durante la pre-entrenamiento, dejar el agua transparente, y ajustar la plataforma queight tal que sobresale 1 cm por encima de la superficie del agua, por lo que es visible para la rata.
3. Realizar sesión de entrenamiento diario que consta de hasta 4 ensayos consecutivos, separados por un espacio de 10 segundos como mínimo (formación discreta, es decir, con intervalos de varios minutos entre los ensayos, es una alternativa).
4. Para el entrenamiento, la ubicación de la plataforma desde su posición de pre-entrenamiento para el brazo elegido (por ejemplo, NW) y sumergirlo en su extremidad 1 cm por debajo de la superficie del agua. Ahora hacer que la opaca agua mediante la adición de leche en polvo y realizar la siguiente formación (sección 4).
5. Para las ratas que no llegan a la plataforma de destino dentro de 60 segundos, ellos regresan a la posición inicial, y suavemente los guían a la plataforma por el experimentador.
6. Mida varias variables durante las sesiones de entrenamiento y de sonda, como, nadó la distancia, la latencia al brazo meta / plataforma, tiempo de permanencia en cada brazo, así como el número de errores iniciales / repetitivos (ver Figura2). Tenga en cuenta que las latencias pueden estar influidos por dificultades motoras. Llegado el caso, la distancia y los errores aparecen como variables más fiables sobre el rendimiento cognitivo.
7. Alocéntrica Estrategia de Formación:
   1. Día 1 - Pre-entrenamiento:
      1. No agregue leche en polvo para este paso. Coloque plataforma de escape que sobresale 1 cm por encima de la superficie del agua en una ubicación fija. Ratas tren en 4 ensayos consecutivos para llegar a la plataforma.
   2. Días 2-5 - Formación:
      1. Añadir 250 g de leche desnatada en polvo al agua para que sea opaco. Mueva la plataforma a un brazo diferente (por ejemplo, de NE a SO) y añadir agua para que la plataforma es 1 cm por debajo de la superficie del agua. Ratas de liberación, ya sea del brazo N o S en secuencias impredecibles para cada sesión, de modo que ambos brazos se utilizan el doble de inicio el juicio en una sola sesión (4 ensayos / día, por ejemplo, SNNS, NSNS; ver Figura 3).
   3. Día 6 - La sonda de la sesión:
      1. Retire plataforma para el ensayo de la sonda. Suelte ratas de un brazo diferente a los utilizados durante el entrenamiento (por ejemplo, SO), y les permiten nadar durante 60 segundos. Ver Figura 4 para las pistas de natación representativas. Análisis del tiempo pasado en el brazo objetivo (antigua ubicación de la plataforma) da una indicación acerca de si las ratas utilizan una estrategia espacial, otro tipo de estrategia, una combinación secuencial de diferentes estrategias (ver abajo), o un patrón de búsqueda desorganizado.
8. Egocéntrico Formación Estrategia:
   1. Día 1 - Pre-entrenamiento:
      1. Esta es la misma como primer paso en la formación estrategia alocéntrica (paso 4.1). No agregue leche en polvo para este paso. Coloque plataforma de escape que sobresale 1 cm por encima de la superficie del agua en una ubicación fija. Ratas tren en 4 ensayos consecutivos para llegar a la plataforma.
   2. Días 2-5 - Formación:
      1. Añadir 250 g deleche desnatada en polvo al agua para que sea opaco. Mueva la plataforma a un brazo diferente y añadir agua para que la plataforma es 1 cm por debajo de la superficie del agua. Ratas de lanzamiento desde el mismo brazo de inicio (S o N; ver Figura 5) para cada ensayo (4 ensayos / día).
   3. Día 6 - La sonda de la sesión:
      1. Retire plataforma para el ensayo de la sonda. Las ratas son liberados de un brazo diferente de donde fueron liberados durante la capacitación. Permita que las ratas a nadar durante 60 segundos. Bloquear el brazo opuesto con una puerta de guillotina transparente.
         NOTA: Modificar las estrategias de capacitación encima de acuerdo a los requerimientos de una experiencia particular, por ejemplo, pruebas de drogas Efectos etc.
9. Seque la rata con toallas absorbentes después de cada sesión en el agua.

5. Análisis

1. Realizar mediciones de latencias, errores iniciales y repetitivos, primeras opciones y tipo de respuesta manually mediante el registro de estas variables de los videos tomados por la cámara encima.
2. Alternativamente, si está disponible, utilizar el software de vídeo de seguimiento disponible en el mercado y configurado para grabar estas variables automáticamente.
3. Análisis Estadístico:
   NOTA: La aplicación concreta de análisis estadístico depende del estudio, que está teniendo lugar.
   1. Realizar un uno, dos o tres vías ANOVAs con respecto a los errores iniciales / repetitivas, la latencia al brazo meta / plataforma, y ​​el tiempo pasado en el brazo objetivo; con factores que incluyen el día de la prueba, y el grupo (s) de tratamiento.
   2. Cuando sea necesario, siga estos ANOVAs utilizando post hoc-Newman-Keuls comparaciones múltiples pruebas. Para comparar el rendimiento, utilice un valor de referencia (por ejemplo, el tiempo de permanencia en el brazo para el objetivo durante un ensayo de sonda versus el nivel de azar), y llevar a cabo la prueba t.
   3. Si es necesario, utilice las estadísticas no paramétricas, además (por ejemplo, χ², ver más abajo) o en lugar cuando las condiciones para PARAMETlos ric no se cumplen.

Results

Estrategia de aprendizaje egocéntrico

Un estudio se llevó a cabo para determinar si la estrategia de la memoria elegida en ratas cambios basados ​​en las alteraciones de su perspectiva de las señales ambientales externos, siguiendo un paradigma egocéntrico-learning ^25. Las ratas fueron entrenadas durante 4 días (4 ensayos / día) para llegar a un brazo de meta situada en NE, y se pusieron a prueba posteriormente en el quinto día usando un ensayo de sonda engañosa, en la que el brazo d...

Discussion

Comentarios sobre Diseño Estudio y Análisis

Desde su concepción, el laberinto de doble H se ha utilizado en una serie de experimentos de comportamiento en ratas, que colectivamente fueron diseñados para estudiar las respuestas egocéntricos y / o alocéntricos en ratas en condiciones normales de ^24,25 y alterado ^26-29 estados cerebrales. Los últimos estudios incluyen la estimulación del estriado cerebral profunda (DBS) ^26, los modelos animales de trastornos neurol...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ratas o ratones	Río
Toallas para secar	Hospital		1 / animal
Agua			~ 200 L / día
Leche descremada en polvo		comestibles	250 g / 200 L
de agua Manguera de jardín	Ferretería
Tendedero para toallas	Ferretería
Cámara Kinect	Kinect
	Ordenador PC any
[header]
Doble H Laberinto, (plexiglás) (Custom-Built)
Paredes laterales externas, 1600 veces; 350 veces; 6 mm
2 Paredes laterales internas, 706 &veces; 350 veces; 6 mm			8
Paneles de pasillo central, 500 veces; 350 veces 3 mm			4
Extremidades de los brazos, 188 veces 350 veces 6 mm			6
Puertas de guillotina, 187 veces y 350 veces
mm 3 Tapas de extremidades, 200 veces 250 mm			6
Travesaños, 200 veces 40 mm			6
[encabezado]
Plataforma de laberinto de doble H (para lastrar) (Custom-Built)
Plataforma metálica, 100 mm diámetro y veces; 150 mm			2
Cubierta de plataforma, 100 mm diámetro y veces; 6 mm			2