Un ensayo de conducta Barato, escalable para medir etanol Sedación La sensibilidad y la tolerancia rápida en<em&gt; Drosophila</em

Resumen

Los ensayos sencillos para medir la sensibilidad al etanol y la tolerancia rápida en Drosophila facilitan el uso de este organismo modelo para investigar estos importantes comportamientos relacionados con el etanol. Aquí, se describe un ensayo relativamente simple y escalable para medir la sensibilidad al etanol y la tolerancia rápida en moscas.

Resumen

Trastorno por consumo de alcohol (AUD) es un grave problema de salud. A pesar de un gran componente hereditario AUD, algunos genes se han implicado de forma inequívoca en su etiología. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, es un poderoso modelo para explorar los mecanismos moleculares que subyacen a los comportamientos genéticos relacionados con el alcohol y por lo tanto representa una gran promesa para la identificación y la comprensión de la función de los genes que influyen en AUD. El uso del modelo de Drosophila para estos tipos de estudios depende de la disponibilidad de ensayos que miden de forma fiable respuestas de comportamiento a etanol. Este informe describe un ensayo adecuado para evaluar la sensibilidad de etanol y rápida tolerancia en las moscas. Sensibilidad etanol medido en este ensayo está influenciada por el volumen y la concentración de etanol utilizado, una variedad de manipulaciones genéticas se informó anteriormente, y también la longitud de tiempo que las moscas se alojan sin alimentos inmediatamente antes de la prueba. En contraste, el etanol sensitivity medido en este ensayo no se ve afectada por el vigor de la manipulación de la mosca, el sexo de las moscas, y la suplementación de medio de crecimiento con antibióticos o levaduras vivas. Tres métodos diferentes para cuantificar la sensibilidad de etanol se describen, todo lo cual lleva a los resultados de sensibilidad etanol esencialmente indistinguibles. La naturaleza escalable de este ensayo, junto con su simplicidad general de puesta a punto y relativamente de bajo costo, lo hacen adecuado para el análisis genético pequeña y gran escala de sensibilidad etanol y rápida tolerancia en Drosophila.

Introducción

Trastorno por consumo de alcohol (AUD) es un enorme problema de salud en todo el mundo (revisado en ^1). Aunque los mecanismos que impulsan el desarrollo de AUD son complejos, estos trastornos tienen un componente genético importante (por ejemplo, ^2). La gran heredabilidad de la AUD y las respuestas conductuales conservadas en etanol a través de muchas especies (revisado en ^3,4) han generado un gran interés en el uso de organismos modelo genético para investigar la participación de genes específicos en los comportamientos relacionados con etanol hacia una mejor comprensión de las bases moleculares de AUD. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, se ha convertido en un organismo líder en modelo para explorar los mecanismos moleculares genética de los comportamientos relacionados con etanol (revisado en ^3,4). Los estudios en moscas han puesto de relieve los roles de varias vías de señalización en las respuestas conductuales a etanol (revisado en ^5). Curiosamente, algunos de los genes y las vías que influir respons conductualeses a etanol en las moscas también se han implicado en los comportamientos relacionados con etanol de roedores y / o AUD humano (por ejemplo, ^6-14). La conservación de los mecanismos de los comportamientos relacionados con la conducción de etanol a través de especies, junto con la suite de herramientas genéticas disponibles en el sistema modelo de Drosophila, ponen de relieve la utilidad del modelo de mosca de la fruta para la investigación de la genética de las respuestas de comportamiento a etanol.

Sensibilidad ^15,16 y la tolerancia (revisado en ¹⁷⁾ a etanol en los seres humanos está relacionada con el desarrollo de AUD. Ambas de estas respuestas de comportamiento a etanol puede ser modelado en las moscas a través de una variedad de ensayos de laboratorio (revisado en ^3,4). Todos los ensayos de moscas que se sabe que los autores se basan en cualquiera de tiempo-dependiente inducida por etanol sedación / falta de coordinación o de recuperación en función del tiempo de sedación etanol.

En un artículo anterior de nuestro grupo sobre la genética de la sensibilidad de etanol y rtolerancia apid en Drosophila, se usó un ensayo de comportamiento basados ​​en etanol sedación inducida por vapor de ^moscas-18. Prueba en este ensayo se inició mediante la transferencia de adulto vivo vuela sin anestesia para vaciar viales de alimentos, atrapando las moscas en los viales con un tapón de acetato de celulosa, la adición de etanol a la parte superior (es decir, el lado no-fly) de la bujía de acetato de celulosa, y sellar el vial que contiene moscas, tapón de acetato de celulosa y el etanol con un tapón de silicona (véase el esquema de la Figura S3, referencia ^18). Viales de múltiples que representan los diferentes grupos de moscas fueron evaluados en paralelo, aumentando el rendimiento de este ensayo. Los viales se les dio un código anónimo y experimentadores estaban cegados al grupo de tratamiento para evitar el sesgo no intencional en la evaluación de la sedación. En un experimento estándar, moscas en viales se golpeó suavemente a intervalos de 6 min y, después de una recuperación de 30 segundos, se contó y converte el número de moscas sedados en cada viald para ciento moscas activos. Las moscas absorben vapor de etanol a partir de la clavija de acetato de celulosa de una manera dependiente del tiempo, causando aumentos progresivos en etanol interno ¹⁸ y sedación (referencia cf ¹⁸ y la Figura 1A y 1B en este informe). Sedación en este ensayo se define operacionalmente como moscas (i) de pie en la ausencia de caminar o (ii) que se encuentra en la espalda con o sin batir sus alas. Aquí, este ensayo sedación etanol se describe en detalle, se proporciona una mayor optimización operativa relevante para su uso, y el ensayo se utiliza para tratar la contribución de opciones de administración de suplementos de alimentos sobre la sensibilidad a la sedación mosca.

Protocolo

1. Día Antes de Ensayo

1. Recoger moscas en viales de alimentos frescos en grupos de 11 (solo sexo) bajo breve (1-5 min) CO _2.
2. Permitir que las moscas se recuperen O / N en viales de alimentos en un espacio con ambiente controlado (normalmente 25 ° C, humedad relativa del 60%, 12 horas de luz / oscuridad ciclo).
3. Preparar la solución de etanol (s) diluyendo puro (100%) de etanol en (≥18 MΩ) agua purificada hasta una concentración final (s) apropiado para el experimento planeado. Deje que la solución (s) para volver a RT O / N.
   Nota: La dilución de etanol es exotérmica.

2. Día de Ensayo

1. Para cada vial de moscas a ensayar, preparar (i) un vial limpio y vacío de alimentos; es decir, las pruebas de vial, (ii) un nuevo tapón de acetato de celulosa, (iii) un tapón de silicona y (iv) 1 ml de solución de etanol (véase la Tabla 3).
2. Preparar sala de pruebas mediante el ajuste de la temperatura a 20-25 ° C y humedad relativa de 55-65%.
3. Haga que otro trabajadorasignar un código único a cada grupo de viales y registrar el código para más tarde. Colocar los viales codificados con moscas en sala de pruebas para aclimatarse durante unos minutos.
4. Etiquetar viales de ensayo vacías para que coincida con los códigos de los viales de la mosca de 2,3.
5. Construir un registro de las pruebas en papel mediante la introducción de los códigos en columnas (una columna / vial) en una hoja de cálculo similar a la Tabla 1.
6. Utilizando el registro de las pruebas como guía, organizar viales alimentos codificados con las moscas y los viales de prueba vacíos en juego matrices en la sala de pruebas.
   Nota: un número máximo razonable de viales para poner a prueba es de 24 (es decir, 6 juegos de 4 viales de cada uno).
7. Transferencia vuela desde viales de alimentos en pareados viales de ensayo vacío / etiquetados e inserte inmediatamente tapones de acetato de celulosa en viales de prueba hasta tapones de acetato de celulosa son 2 cm por debajo de la parte superior del vial.
8. De aquí en adelante, manejar cada fila de cuatro viales como un conjunto a intervalos escalonados min 1.
9. Para la evaluación de tiempo 0, sujete cada vial individual wITH pulgar y el dedo índice, toque suavemente sobre la mesa tres veces para golpear las moscas a la parte inferior del vial, espere 30 segundos y luego contar el número de moscas que son inmóviles / muerto. Anote el número de moscas inmóviles / muertas para cada vial en el tiempo 0 min en el registro de la prueba en papel.
10. Iniciar temporizador con cuenta de forma continua en el tiempo 0 y comenzar inmediatamente la adición de 1 ml de etanol a tapones de acetato de celulosa en los viales para la primera fila / juego de 4 viales. Añadir 1 ml de etanol para los tapones de acetato de celulosa en los viales a intervalos de 5 seg en el orden en que se pondrá a prueba. Añadir etanol para los tapones de acetato de celulosa en un movimiento circular de modo que el etanol se absorbe de manera uniforme a través de los tapones de acetato de celulosa. Cuando el etanol se ha añadido a todos los viales de prueba 4 en el conjunto, insertar un tapón de silicona en cada vial para sellarlo.
11. A veces 1, 2, 3, 4 y 5 minutos, añadir 1 ml de etanol para el segundo tercio cuarto, conjuntos, quinto y sexto de 4 viales, respectivamente. Continúe insertando tapones de silicona despuésadición de etanol a cada conjunto de 4 viales.
12. A la hora 6 minutos, probar la primera serie de 4 viales agarrando cada vial con el pulgar y el índice, golpeando suavemente sobre la mesa tres veces para golpear las moscas a la parte inferior del vial, espera 30 segundos y luego contar y registrar el número total de moscas que están sedados. Puntuación vuela como sedado si (i) se destacan en el suelo del vial, pero no caminan o (ii) se encuentran en la espalda con o sin batir sus alas.
13. Maneje cada vial dentro del conjunto a intervalos de 5 segundos con el horario en la Tabla 2.
14. A veces 7, 8, 9, 10 y 11 min, probar el segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto juegos de viales, respectivamente, como se hizo para el primer set.
15. A la hora 12 min, probar la primera serie de 4 viales de nuevo como se describe en 2.12 y continuar probando la segunda tercera cuarta, conjuntos, quinto y sexto de viales a los 13, 14, 15, 16 y 17 minutos, respectivamente.
16. Continuar pruebas moscas como se describe en 2.12 hasta que todas las moscas son sedated.
17. Escriba el número total de moscas en cada vial en el registro de la prueba en papel. Censor moscas inmóviles / muertos en el tiempo 0 a partir del número total de moscas.
18. Calcular el porcentaje de moscas activas en cada punto de tiempo de evaluación y datos de la parcela como% moscas activos (eje y) en función del tiempo (eje x). Cuantificar la sedación etanol mediante la interpolación de Sedación Tiempo 50 valores (ST50, el tiempo a 50% sedación) de tercer orden curva polinómica o sigmoidal encaja o el cálculo del área bajo la curva.
19. Recopilar datos de viales decodificados y realizar análisis estadísticos (por ejemplo, un modelo lineal con Bonferroni test de comparación múltiple) según corresponda para el diseño experimental.

Resultados

Los datos brutos de este ensayo sedación etanol son los números de moscas que son sedados como una función de vapor de etanol tiempo de exposición. Los datos en bruto se convierten a las moscas por ciento activos como una función del tiempo (datos primarios, las figuras 1A, B, D - F). Sensibilidad a la sedación etanol a partir de los datos primarios se puede cuantificar como la sedación Tiempo 50 (ST50), el tiempo requerido para el 50% de las moscas para convertirse en sedado o AEA bajo...

Discusión

Ensayos sencillos que cuantifican reproducible fenotipos significativos son de gran valor para el análisis del comportamiento. El trabajo que se describe aquí aborda varios aspectos prácticos de un ensayo para medir la sensibilidad sedación etanol y rápida tolerancia en Drosophila. Aunque no es un tema central de este trabajo, análisis de comportamiento son facilitadas por el mantenimiento del medio ambiente y los antecedentes genéticos constante para los sujetos de prueba en un estudio. Además, por lo general ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
viales para alimentos	VWR	89092-772	estrecho
Flugs	Genesee/flystuff.com	49-102	tapón de
silicona	Fisher Scientific	09-704-1L	#4
etanol	Pharmaco-Aaper	111000200	200 proof

estrecho