Un método estandarizado para el análisis de las células del hígado sinusoidal endoteliales y sus Fenestraciones por Microscopía Electrónica de Barrido

Resumen

La célula endotelial sinusoidal del hígado fenestrada es un sistema de filtro biológicamente importante que está altamente influenciado por diversas enfermedades, toxinas y estados fisiológicos. Estos cambios tienen un impacto significativo en la función hepática. Describimos métodos para la estandarización de la medición del tamaño y el número de fenestraciones en estas células.

Resumen

Las células endoteliales sinusoidales del hígado son la puerta de entrada al hígado, sus fenestraciones transcelulares permiten la transferencia sin obstáculos de sustancias pequeñas y disueltas de la sangre al parénquima hepático para su metabolismo y procesamiento. Las fenestraciones son estructuras dinámicas: tanto su tamaño como su número pueden alterarse en respuesta a diversos estados fisiológicos, fármacos y enfermedades, lo que las convierte en un objetivo importante para la modulación. La comprensión de cómo la morfología del LSEC se ve influenciada por diversos estados patológicos, tóxicos y fisiológicos y cómo estos cambios afectan a la función hepática requiere una medición precisa del tamaño y el número de fenestraciones. En este artículo, describimos las técnicas de fijación y procesamiento de microscopía electrónica de barrido utilizadas en nuestro laboratorio para garantizar la preparación de muestras reproducibles y una interpretación precisa. Los métodos incluyen la fijación por perfusión, la fijación secundaria y la deshidratación, la preparación para el microscopio electrónico de barrido y el análisis. Finalmente, proporcionamos un método paso a paso para el análisis estandarizado de imágenes que beneficiará a todos los investigadores en el campo.

Introducción

Las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSECs) son altamente células endoteliales diferenciadas que recubren la pared de la sinusoide hepático. LSECs están perforadas con fenestraciones que no son diaphragmed, transcelular poros de 50-250 nm de diámetro. Hasta el 20% de la superficie de LSECs está cubierto por fenestraciones, que son por lo general en grupos de decenas a cientos llamadas placas de tamiz ^1-3 (Figura 1). Fenestraciones permiten la transferencia de plasma y nanosubstrates entre la sangre y los hepatocitos, la creación de un sistema de ultrafiltración altamente eficiente. Fenestraciones son estructuras dinámicas - tanto por su tamaño y / o el número puede ser alterado en respuesta a diversos estados fisiológicos, las drogas y las enfermedades. Por ejemplo, fenestraciones son más grandes en el ayunas que en el estado alimentado ^4; 2-di-iodoamphetamine aumenta número fenestración; ^5,6 y una reducción en el tamaño y número de fenestraciones por célula se produce en el envejecimiento y muchos estados de enfermedad ^7-13 . La medida exacta del tamaño y número de fenestraciones es importante para la comprensión de cómo las CESH morfología está influenciada por diversas enfermedades, tóxicas, y los estados fisiológicos; su impacto en la función hepática; y para el desarrollo de la fenestración de modulación de las intervenciones terapéuticas ^1.

El estudio de fenestraciones es difícil. El diámetro de fenestraciones se encuentra por debajo de la resolución de la microscopía de luz convencional, por lo que antes sólo la observación mediante microscopía electrónica tanto en tejido hepático o cultivadas LSECs intactas ha sido posible. El microscopio electrónico de barrido (SEM) con más frecuencia ha sido utilizado para estudiar el tamaño de la fenestración, la frecuencia y la porosidad (el porcentaje de membrana CESH que está perforada por fenestraciones) porque SEM permite la observación de grandes áreas de la superficie endotelial y la medición de miles, si no decenas de miles de fenestraciones. A pesar de su utilidad, los resultados que se informan de los estudios SEM-basados ​​paraCESH parámetros tales como el tamaño fenestración, número, la frecuencia y la porosidad varían ampliamente en la literatura (Tabla 1).

Fenestraciones y placas de tamiz son estructuras frágiles que contrato, rompen, dilatan o se unen durante la preparación de la muestra, se requiere procesamiento tanto cuidado para preservar su integridad. La presión de perfusión elevada ^14; osmolaridad incorrecta del fijador y tampones de ^15; fijación inadecuada o la fijación del tiempo; y la velocidad de deshidratación post-fijación y secado son todas las áreas de procesamiento para SEM que pueden producir artefactos que interfieren con la preservación de la ultraestructura (Figura 2). Pérdida de fenestraciones ('defenestration') y la contracción fenestración puede ocurrir como resultado de una mala fijación, lo que resulta en una reducción de diámetro fenestración y la porosidad de la célula. Métodos para mejorar la conservación de muestras para el análisis SEM se han descrito anteriormente ^15-17 y se discuteaquí con consejos adicionales sobre cómo mejorar la conservación de muestras. Los principales objetivos de la conservación de muestras son para eliminar la sangre de los sinusoides de modo que la superficie de la CESH puede ser visualizada y para evitar daños CESH de cualquiera alta presión o retrasada de fijación. La perfusión del hígado entero de fijador a través de la vena portal es el método preferido para la fijación de hígado. Como se describe en detalle en otra parte ^16,18 perfusión debe llevarse a cabo a baja presión (por ejemplo 10 cm de H ₂ 0) para evitar artefactos relacionados con la presión de perfusión-y el daño al CESH, típicamente manifiestan como grandes lagunas dentro de la membrana celular. Sin embargo, la fijación razonable a menudo se puede obtener usando la perfusión de la aguja de biopsias de hígado de seres humanos y animales, como se describe en detalle en otra parte ^19. Esta técnica consiste en inyectar directamente fijador en el tejido hasta que la sangre es expulsado de la muestra y el tejido es firme y fija. Fijación de muestras para microscopía electrónica necesita ser perfORMED lo más rápidamente posible después del cese del flujo sanguíneo para evitar cambios ultraestructurales que ocurren como resultado de los hígados procesos autolíticos extremadamente rápidos.

También presentamos un método de análisis de imagen que minimiza la inclusión de artefactos, y normaliza la medición de fenestraciones. La variación en la selección de sinusoides para micrografías, análisis de imágenes de artefactos, y la medición de área de la célula para la porosidad y la fenestración frecuencia han dado lugar a grandes discrepancias en los resultados publicados. Un enfoque estandarizado para la evaluación y medición de fenestraciones y los requisitos mínimos para la presentación de los datos no se han abordado con claridad en la literatura previamente ^4,10,20-31.

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos que implican el uso de animales se llevan a cabo de acuerdo con la legislación local. Nuestro trabajo es aprobado por el Distrito de Salud del Comité de Protección de los Animales Sydney Local. Los procedimientos permitidos se describen en la documentación de la licencia del proyecto y siguen las pautas que aseguren el bienestar de los animales en todo momento. Garantizar el cumplimiento de la legislación sobre la experimentación animal del país donde se realiza el trabajo.

1. Protocolo para la preparación de EM fijador

1. Para 100 ml de fijador, de paraformaldehído preparar mediante la adición de 2 g de polvo de paraformaldehído a 25 ml de agua destilada en un matraz cónico, calentar a 65 ºC, revolviendo constantemente con un agitador magnético.
   NOTA: El glutaraldehído, paraformaldehído y tampón cacodilato de sodio son todas las sustancias peligrosas y siempre deben ser manejados en campana de humos.
2. Se calienta a 65 ° C durante 2 minutos, dejar enfriar. Si es necesario, agregar una solución de hidróxido de sodio dropwise mientras se agita para despejar solución completamente.
   NOTA: hidróxido de sodio es peligroso, manejar con cuidado.
3. Añadir 10 ml de EM de grado social glutaraldehído, 50 ml de tampón cacodilato 0,2 M de sodio y 2 g de sacarosa y remover con un agitador magnético. Añadir 2 ml de 1,0 M de _CaCl2.
4. Ajustar el pH a 7,4 antes de hacer la solución hasta 100 ml con agua destilada. El fijador final contiene 2,5% de glutaraldehído, 2% de paraformaldehído, 2 mmol CaCl _2, 2% de sacarosa en tampón cacodilato 0,1 M. Asegúrese de que la osmolalidad total es de 440 mOsmol / l. Utilizar dentro de las 24 horas de preparación.

2. Fijación de perfusión hepática

1. Tampón de perfusión Cálido y fijador a 35-37 ºC. La temperatura correcta de la memoria intermedia de la exanguinación y fijador ayuda a asegurar la integridad del tejido.
2. Anestesiar al animal con una sola inyección intraperitoneal de 50 mg / kg de ketamina y 5 mg / kg de xilazina.
3. Una vez que el animal es bajoanestesia profunda, evaluada por la retirada de las extremidades posteriores y de pinzamiento del rabo, una incisión en Y se hace con extremos romos tijeras en el abdomen del animal para exponer la vena hepática y portal.
   NOTA: Asegúrese de que el equipo esté limpia para evitar la contaminación de las muestras con microorganismos y restos general que se verán fácilmente en SEM.
4. Atar dos suturas muy sueltos alrededor de la vena portal uno proximal al hígado, el otro más distalmente al hígado.
5. Canular la vena porta con una cánula de tamaño apropiado IV (18 G para las ratas, 22 G para los ratones) .Apriete suturas para asegurar cánula.
6. Comenzar la perfusión con solución salina tamponada con fosfato se calentó a 37 ºC, y a una presión de 10 cm de H ₂ 0. Entre 5 y 20 ml de PBS se requiere generalmente para Exsanguinate el hígado.
   NOTA: Por favor no permita que las burbujas de aire que entran en el hígado a través de los tubos conectados a la cánula ya que inducen artefactos secundarios a la embolización y la presión; El daño a los hepatocitos, sinusoids y fenestraciones CESH ocurre si la presión de perfusión es demasiado alto.
7. Cortar la vena cava abdominal y torácica para permitir que el tampón para salir libremente desde el hígado. Esto evita daños alta contrapresión a LSECs.
8. Una vez que el hígado es libre de sangre, reemplace PBS con fijador EM y perfundir durante aproximadamente 5 minutos, hasta que el hígado se endurece y muy pálido.
9. Suspender la perfusión y cortar el hígado fija en 1 - 2 mm ³ bloques con un bisturí afilado.
10. Tejido post-fix en EM fijador durante 24 a 72 horas a 4 ºC.
    NOTA: En general, underfixation causa más artefactos que overfixation.
11. Cambie fijador siguiente período post-fix a 0,1 M tampón cacodilato de sodio para el almacenamiento a 4 ºC.
    NOTA: Las muestras almacenadas de esta manera se conservarán durante un período significativo de tiempo (hasta 12 meses), la fijación secundaria sin embargo oportuno y se recomienda un examen para obtener mejores resultados.

3. Aguja Perfusion

NOTA: la fijación de la aguja es una variante de la fijación de perfusión que implica la inyección de fijador directamente en el tejido de hígado biopsia. El objetivo es que el fijador a ser lavada a través de los vasos sanguíneos con el fin de Exsanguinate ellas y exponer todo el bloque de tejido de fijador. Se debe tener cuidado para mantener la presión de inyección de baja presión para evitar lesiones ^18,19.

1. Retirar un pequeño trozo de hígado del animal o sujeto y enjuague con solución salina para eliminar la sangre y escombros.
2. Dibuje la solución salina normal en jeringa equipada con una aguja de calibre fino (normalmente una jeringa de insulina).
3. Se inyecta la solución salina muy lentamente en el hígado hasta que la sangre se vacía fuera del tejido. Se pueden requerir múltiples inyecciones.
4. Dibuje el fijador EM en otra jeringa equipada con una aguja de calibre fino (típicamente una jeringa de insulina).
5. Inyectar el fijador muy lentamente en el hígado hasta que se vuelve dura y de color canela. Inyección múltiples puede ser necesaria.
6. Cortar el hígado fija en 1 - 2 mm ³ bloques con un bisturí afilado. Incubar en fijador EM de 24 a 72 horas 4 ° C. Lavar 3 veces en tampón cacodilato de sodio 0,1 M antes de comenzar la fijación secundaria.

4. Preparación para Microscopía Electrónica de Barrido

1. Lavar la muestra 3 veces en tampón cacodilato 0,1 M de sodio. Para solucionar los lípidos, puesto fijar la muestra en el 2% de tetróxido de osmio en tampón cacodilato sódico 0,1 M durante 2 horas.
   NOTA: Completa el lavado es muy importante como cruz glutaraldehido y tetróxido de osmio reaccionan y generan artefactos en SEM.
2. Enjuagar las muestras en concentraciones crecientes de etanol para iniciar la deshidratación. En primer enjuague en etanol al 50% durante 5 minutos; luego 3 veces durante 5 min con etanol al 70%; enjuagar 3 veces durante 5 min con etanol al 90%; enjuague 2 veces durante 5 min en etanol al 100%; y finalmente enjuague 2 veces durante 10 min en etanol 100% (tamiz molecular).
3. Retire todo el etanol a partir de las muestras y reemplazar con hexametildisilazano (HMDS) en campana de humos y dejar actuar durante 10 minutos. Retire HMDS de las muestras de tejido y dejar que se evapore.
   NOTA: HMDS es altamente higroscópico en frío, por lo tanto permitirá alcanzar RT antes de utilizar para la etapa de deshidratación final.
4. Opcionalmente, montar las muestras inmediatamente o colocarlos en un desecador hasta el momento de montar para SEM.

5. Montaje

NOTA: montaje de muestras correcta maximizará el número de sinusoides claramente delineadas disponibles para el análisis bajo SEM.

1. Etiquetar la base de los metales talones de SEM y aplique cinta de carbón conductor de doble cara a la parte superior de los talones.
2. Visualizar las muestras usando un microscopio de disección para identificar la superficie con las mejores sinusoides para su posterior SEM. Coloque la superficie hacia arriba sobre la superficie de la cinta de carbono del trozo.
3. Especímenes palillo firmemente el talón, las muestras ya están listos para el recubrimiento por pulverización catódica.

ove_title "> 6. Recubrimiento

NOTA: El recubrimiento de la muestra con una fina película de metal conductor (oro o platino) en unos terrenos revestidor de bombardeo iónico el espécimen y lo protege de los daños causados ​​por el haz de electrones. Si el revestimiento es demasiado gruesas estructuras de interés pueden ser oscurecidos.

1. Colocar los trozos en la cámara de vacío del aparato de revestimiento por pulverización catódica automática fina, el modo de rotación y recubrimiento por pulverización catódica automática establecen durante 45 segundos. Utilice revestimiento de platino para más fina que detalla, sin embargo oro también es adecuado.
2. Aplicar una capa fina de pintura de carbono a las superficies externas de las muestras de hígado montados, teniendo cuidado de no recubrir las superficies sinusoidales.
3. Una vez que las muestras están recubiertos con platino y la pintura se ha secado de carbono que están listos para la observación en la SEM. Las muestras se pueden almacenar en un desecador.

7. Uso del microscopio electrónico de barrido

1. Lugar especímenes en el microscopio electrónico de barrido y volver microscopio para vacío.
2. El uso de procedimientos operativos microscopio estándar para la visualización de las muestras por comenzar con una ampliación baja, aumentando gradualmente la ampliación.
3. Asegúrese de que el microscopio se ajusta adecuadamente para trabajar a distancia, tamaño de punto y el astigmatismo.
4. Compruebe la integridad de la fijación. Si el CESH es sobre todo libre de huecos y contiene fenestraciones de medición 30-250 nm de diámetro por regla general, indicaría que la preparación de muestras ha sido un éxito.
5. Si los sinusoides están llenas de lagunas o carente de fenestraciones la preparación de la muestra no ha tenido éxito o no hay patología significativa. En este caso, cortar la muestra con una cuchilla de afeitar muy fino, y recubrir las superficies de corte y se analizaron para sinusoides fijos con éxito.
6. Aproximadamente a las 15.000-20.000 × magnificación seleccionar superficies planas CESH que están libres de escombros con una buena fijación y donde las fenestraciones son claramente visibles (que contiene típicamente al menos 10 fenestraciones).
7. Guardar imágenes de al menos 10 por sinusoides del hígado, de diferentes áreas de los bloques, utilizando al menos dos bloques por el hígado. Muestreo 10 micrografías a 15.000 - 20.000 × magnificación por animal es generalmente suficiente para la cuantificación de fenestraciones sea representativo de todo el hígado.

8. Análisis

NOTA: El software ImageJ que se puede descargar gratis desde el NIH se utiliza para cuantificar diámetro fenestración y frecuencia ( www.imagej.nih.gov/ij ).

1. Abrir imagen J y establecer la escala utilizando la barra de escala incrustado en la imagen (Screen shot 1).
2. Con la herramienta polígono en ImageJ, vestigios alrededor de toda la zona plana de la CESH incluyendo áreas fenestradas y defenestrado. No se limite a rastrear las placas de tamiz ya que esto falsamente inflar porosidad. Excluir cualquier grandes piezas de desechos que se encuentran en la superficie celular que podrían ser Obscuriofenestraciones NG.
3. Para medir el diámetro fenestración, trazar una línea a través del diámetro más largo de cada fenestración mediante la selección de la herramienta de línea, y presione "m" para medir la línea, y "d" (empate) para dibujar de forma permanente la línea en la imagen. Esta línea se define como el diámetro de la fenestración. La longitud de la línea estará disponible en el cuadro de resultados de ImageJ (Screen shot 2).
4. Mida todos los huecos que son agujeros más grandes en el citoplasma CESH más de 250 nm, así como fenestraciones. Las lagunas son a menudo objetos que reflejan mala perfusión o fijación, sin embargo lagunas también pueden ocurrir como resultado de la enfermedad y la toxicidad. Los datos de las lagunas será excluido de cálculo de los parámetros del hueco más adelante en el análisis.
5. La zona de las lagunas que no son circulares debe calcularse mediante el trazado alrededor de las lagunas y el cálculo de su área en ImageJ.
6. Pegue los datos del cuadro de resultados en ImageJ en una hoja de cálculo Excel para furtheanálisis r.

9. Cálculos

1. Promedio fenestración diámetro = promedio de todos los diámetros de fenestración (sin incluir las lagunas, donde las brechas son ≥ 250 nm).
2. Área Fenestración = πr ^2, donde r, el radio, se calcula a partir del diámetro fenestraciones individuo (r = d / 2), sin incluir huecos.
3. Porosidad (%) = (Σ (πr ²⁾ / área total analizada - Σ (área de huecos =)) (m ²⁾⁾ × 100.
4. Frecuencia Fenestration = número total de fenestraciones / (área total analizada-Σ (área de las lagunas) (m ^2).

10. Presentación de Fenestration datos

NOTA: Siempre que sea posible, las publicaciones, incluyendo la cuantificación de los datos de fenestración deben incluir la siguiente información

1. Diámetro Fenestration, con una declaración confirmando lo diámetros de frontera donde se utilizan para definir fenestraciones (típicamenteentre 50 a 250 nm), la frecuencia fenestración (número / m ²⁾ y la porosidad (%).
2. Una declaración que confirme si las brechas se han incluido en el análisis, gráfico de distribución de frecuencia de diámetro fenestración y el número de hígados, bloques, imágenes y fenestraciones debe incluirse en el análisis.

Resultados

Visualización inicial a bajo aumento por microscopía electrónica de barrido revela una superficie plana de la muestra de hígado con un área expuesta suficientemente grande como para observar muchas grandes vasos hepáticos y sinusoides (Figura 1A). Asegurar la colocación de bloques de hígado correcta en el talón de montaje es esencial para la obtención de imágenes claras de los sinusoides y la cápsula de Glisson del hígado se debe evitar por este motivo (Figura 1B). El aumento de la ampl...

Discusión

La capacidad de medir con precisión y de manera reproducible el estado del hígado endotelio sinusoidal es un paso importante en la comprensión de la biología de estas células altamente especializadas. Las nuevas técnicas como la microscopía iluminación estructurada ^32, microscopía de fuerza atómica y ³³ d-STORM (estocástico óptica directa reconstrución Microscopy) ³⁴ impartirán información importante sobre la morfología de estas células in vitro, pero SEM sigue siendo el princip...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
25% de glutaraldehído de grado EM	ProSciTech	C001	Almacene las existencias a -20 C hasta que las necesite, evite volver a congelar
el polvo de paraformaldehído	Sigma Aldrich	158127	Prepare siempre el cacodilato de sodio fresco de paraformaldehído
polvo	Sigma Aldrich	C0250	Prepare un caldo de 0,2 M, pH 7,4 disolviendo el polvo en dH2O, utilizado principalmente a 0,1 M preparando una dilución 1:2
Cloruro de calcio	Sigma Aldrich	C1016	Prepare 1 M de CaCl2 disolviendo polvo en dH2O
Tretroóxido de osmio	ProSciTech	C011	Lave las ampollas con ácido débil antes de usar para evitar la contaminación. Prepare el 2 % de caldo en botella de vidrio
Etanol- Absoluto	Sigma Aldrich 459836		El etanol 100% debe ser de alta calidad y almacenado con tamiz molecular
Otros grados de etanol	Labtech	EL5	Prepare etanoles clasificados con dH2O
Hexametildisilazano	Sigma Aldrich	52619	Deje que alcance la temperatura ambiente antes de usar
Cánulas	Terumo	TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C	18 G es adecuado para la mayoría de las ratas, 22 G es adecuado para la mayoría de los ratones, pero es bueno tener algunos 24 G a mano en el caso de ratones muy pequeños
Cinta de carbono conductora	ProSciTech	IA0201
Pintura al carbono	ProSciTech	I003
Ketamina			Debe obtenerse bajo licencia
Xilacina			Debe obtenerse bajo licencia
Tamiz molecular	Sigma Aldrich 208647		Elimina el agua del 100 % Etanol