Un método estandarizado para el análisis de las células del hígado sinusoidal endoteliales y sus Fenestraciones por Microscopía Electrónica de Barrido

Resumen

La célula endotelial sinusoidal del hígado fenestrada es un sistema de filtro biológicamente importante que está altamente influenciado por diversas enfermedades, toxinas y estados fisiológicos. Estos cambios tienen un impacto significativo en la función hepática. Describimos métodos para la estandarización de la medición del tamaño y el número de fenestraciones en estas células.

Resumen

Las células endoteliales sinusoidales del hígado son la puerta de entrada al hígado, sus fenestraciones transcelulares permiten la transferencia sin obstáculos de sustancias pequeñas y disueltas de la sangre al parénquima hepático para su metabolismo y procesamiento. Las fenestraciones son estructuras dinámicas: tanto su tamaño como su número pueden alterarse en respuesta a diversos estados fisiológicos, fármacos y enfermedades, lo que las convierte en un objetivo importante para la modulación. La comprensión de cómo la morfología del LSEC se ve influenciada por diversos estados patológicos, tóxicos y fisiológicos y cómo estos cambios afectan a la función hepática requiere una medición precisa del tamaño y el número de fenestraciones. En este artículo, describimos las técnicas de fijación y procesamiento de microscopía electrónica de barrido utilizadas en nuestro laboratorio para garantizar la preparación de muestras reproducibles y una interpretación precisa. Los métodos incluyen la fijación por perfusión, la fijación secundaria y la deshidratación, la preparación para el microscopio electrónico de barrido y el análisis. Finalmente, proporcionamos un método paso a paso para el análisis estandarizado de imágenes que beneficiará a todos los investigadores en el campo.

Introducción

Las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSECs) son altamente células endoteliales diferenciadas que recubren la pared de la sinusoide hepático. LSECs están perforadas con fenestraciones que no son diaphragmed, transcelular poros de 50-250 nm de diámetro. Hasta el 20% de la superficie de LSECs está cubierto por fenestraciones, que son por lo general en grupos de decenas a cientos llamadas placas de tamiz ^1-3 (Figura 1). Fenestraciones permiten la transferencia de plasma y nanosubstrates entre la sangre y los hepatocitos, la creación de un sistema de ultrafiltración altamente eficiente. Fenestraciones son estructuras dinámicas - tan....

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos que implican el uso de animales se llevan a cabo de acuerdo con la legislación local. Nuestro trabajo es aprobado por el Distrito de Salud del Comité de Protección de los Animales Sydney Local. Los procedimientos permitidos se describen en la documentación de la licencia del proyecto y siguen las pautas que aseguren el bienestar de los animales en todo momento. Garantizar el cumplimiento de la legislación sobre la experimentación animal del país donde se realiza el trabajo.

1. Protocolo para la preparación de EM fijador

1. Para 100 ml de fijador, de paraformaldehído preparar mediante la adición de 2 ....

Resultados

Visualización inicial a bajo aumento por microscopía electrónica de barrido revela una superficie plana de la muestra de hígado con un área expuesta suficientemente grande como para observar muchas grandes vasos hepáticos y sinusoides (Figura 1A). Asegurar la colocación de bloques de hígado correcta en el talón de montaje es esencial para la obtención de imágenes claras de los sinusoides y la cápsula de Glisson del hígado se debe evitar por este motivo (Figura 1B). El aumento de la ampl.......

Discusión

La capacidad de medir con precisión y de manera reproducible el estado del hígado endotelio sinusoidal es un paso importante en la comprensión de la biología de estas células altamente especializadas. Las nuevas técnicas como la microscopía iluminación estructurada ^32, microscopía de fuerza atómica y ³³ d-STORM (estocástico óptica directa reconstrución Microscopy) ³⁴ impartirán información importante sobre la morfología de estas células in vitro, pero SEM sigue siendo el princip.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
25% de glutaraldehído de grado EM	ProSciTech	C001	Almacene las existencias a -20 C hasta que las necesite, evite volver a congelar
el polvo de paraformaldehído	Sigma Aldrich	158127	Prepare siempre el cacodilato de sodio fresco de paraformaldehído
polvo	Sigma Aldrich	C0250	Prepare un caldo de 0,2 M, pH 7,4 disolviendo el polvo en dH2O, utilizado principalmente a 0,1 M preparando una dilución 1:2
Cloruro de calcio	Sigma Aldrich	C1016	Prepare 1 M de CaCl2 disolviendo polvo en dH2O
Tretroóxido de osmio	ProSciTech	C011	Lave las ampollas con ácido débil antes de usar para evitar la contaminación. Prepare el 2 % de caldo en botella de vidrio
Etanol- Absoluto	Sigma Aldrich 459836		El etanol 100% debe ser de alta calidad y almacenado con tamiz molecular
Otros grados de etanol	Labtech	EL5	Prepare etanoles clasificados con dH2O
Hexametildisilazano	Sigma Aldrich	52619	Deje que alcance la temperatura ambiente antes de usar
Cánulas	Terumo	TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C	18 G es adecuado para la mayoría de las ratas, 22 G es adecuado para la mayoría de los ratones, pero es bueno tener algunos 24 G a mano en el caso de ratones muy pequeños
Cinta de carbono conductora	ProSciTech	IA0201
Pintura al carbono	ProSciTech	I003
Ketamina			Debe obtenerse bajo licencia
Xilacina			Debe obtenerse bajo licencia
Tamiz molecular	Sigma Aldrich 208647		Elimina el agua del 100 % Etanol