El protocolo describe los detalles de un procedimiento experimental para cuantificar de glóbulos rojos (RBC) agregados bajo un régimen de cizalladura controlada y constante, basado en técnicas de procesamiento de imágenes. El objetivo de este protocolo es relacionar tamaños de agregados de glóbulos rojos a la velocidad de cizallamiento correspondiente en un entorno controlado de microfluidos.
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Artículo de método
Medio Ambiente Microfluidic controlada de Investigación Dinámica de agregación de glóbulos rojos
En este artículo
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Resumen
Resumen
La sangre, como biofluido no newtoniano, representa el foco de numerosos estudios en el campo Hemorreología. Constituyentes de la sangre incluyen glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas que se encuentran suspendidas en el plasma sanguíneo. Debido a la abundancia de los glóbulos rojos (40% a 45% del volumen de sangre), su comportamiento dicta el comportamiento reológico de la sangre especialmente en la microcirculación. A velocidades de cizallamiento muy bajas, los glóbulos rojos se ven de montar y entidades forma llamada agregados, lo que provoca el comportamiento no newtoniano de la sangre. Es importante entender las condiciones de la formación de agregados de comprender la reología de la sangre en la microcirculación. El protocolo descrito aquí detalla el procedimiento experimental para determinar cuantitativamente los agregados de glóbulos rojos en la microcirculación bajo velocidad de cizallamiento constante, basado en procesamiento de imágenes. Para este propósito, RBC-suspensiones se prueban y se analizaron en microcanales 120 x 60 micras de poli-dimetil-siloxano (PDMS). Los RBC-suspensiones son entllovió usando un segundo fluido con el fin de obtener un perfil de velocidad lineal dentro de la capa de sangre y así lograr una amplia gama de velocidades de cizalladura constantes. La velocidad de cizallamiento se determina usando un sistema de micro velocimetría por imágenes de partículas (μPIV), mientras que los agregados de glóbulos rojos se visualizaron utilizando una cámara de alta velocidad. Los vídeos capturados de los agregados de glóbulos rojos se analizaron utilizando técnicas de procesamiento de imágenes con el fin de determinar los tamaños de los agregados basados en las imágenes de intensidades.
Introducción
Glóbulos rojos (GR) juegan un papel crucial en la determinación del comportamiento reológico de la sangre. Son casi singularmente responsable de las propiedades particulares de la sangre in vitro e in vivo. En condiciones fisiológicas, los glóbulos rojos ocupan 40% a 45% del volumen de sangre. En la microcirculación, los glóbulos rojos solamente ocupar hasta el 20% del volumen de la sangre debido a diámetros de los vasos más pequeños y el efecto plasma 1 descremado. Este fenómeno de reducción de plasma en la microcirculación se conoce como el efecto Fåhraeus. A bajas velocidades de cizalla, los glóbulos rojos son capaces de tender un puen....
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Protocolo
La sangre se recoge de los individuos sanos, con la aprobación del comité de ética de la Universidad de Ottawa (H11-13-06).
1. Microchannel Fabrication
Los microcanales son fabricados en base a los métodos estándar de fotolitografía 18.
- Diseñar la geometría microcanal utilizando un diseño (CAD) asistido por ordenador e imprimir la configuración en una transparencia foto-máscara. Estas máscaras son cruciales ya que dictan la trayectoria de la luz durante el proceso de fabricación. En este caso, las dimensiones de microcanales son 120 micras de espesor, 60 micras de profundidad y 7 mm de lo....
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Resultados
Un ejemplo del flujo de dos fluidos en la doble Y-microcanal se muestra en la Figura 2 para los glóbulos rojos humanos en suspensión en 5%, 10% y 15% de hematocrito y que fluye a 10 l / hr. La Figura 3 muestra la diferencia en tamaños de agregados cuando el flujo en el canal se reduce de 10 l / hr a 5 l / h para un hematocrito de 10%. Esto da una idea cualitativa de los tamaños de los agregados cuando se varía el hematocrito y la velocidad de cizallamiento. La figura 5 .......
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Discusión
Utilizando la presente metodología, es posible analizar cualitativa y cuantitativamente el RBC agregados bajo diferentes condiciones de flujo y hematocritos. Para las pruebas de éxito y la detección agregada, es crucial para determinar la relación de velocidad apropiada entre los dos fluidos en la entrada de microcanal. Esta relación es muy importante para obtener un espesor de capa de sangre óptimo donde el perfil de velocidad es casi lineal 19.
Otro factor clave para la prueba c.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá. Microfabricación se realizó con el apoyo de la instalación McGill nanoherramientas Microfab en la Universidad McGill y el Departamento de Electrónica de la Universidad de Carleton.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| SU8-50 negativo a base de epoxi Foto-resistente | MicroChem Corp. | ||
| Desarrollador de SU8-50 | MicroChem Corp. | ||
| Poli(dimetilsiloxano) (PDMS) Sylgard-184 | Dow-Corning | 3097358-1004 | |
| PE-50 series Sistema de plasma | Grabado por plasma | serie | |
| Tubos de extracción de sangre con K2-EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) | Centrífuga B367861 | ||
| i.e. Thermo Scientific CL2 | Thermo Scientific | 004260F | |
| Solución salina tamponada Poshpate (PBS) | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Tracer fluorescente solución de partículas (15 ml) | FisherSci | R800 | |
| Aggregometer | RheoMeditech | Rheo Scan AnD300 | |
| Jeringas de vidrio (50 y micro; l) | Hamilton | 80965 | |
| Tubing (Tygon) | FisherSci | AAA00001 | |
| Cámara de alta velocidad (Basler) | Graftek Imaging Inc. | basler acA2000-340km | Se podría utilizar una cámara capaz de grabar 18 fotogramas por segundo. |
| Cámara de doble pulso | LaVision | Imager Microscopio Intenso | |
| MITAS | LaVision | MITAS | |
| Láser Nd:YAG | New Wave Research | Solo-II | |
| Bomba de jeringa (Nexus3000 y PicoPlus) | Chemyx Inc. y Harvard Apparatus | Nexus3000 y PicoPlus | |
| DaVis software | LaVision | Davis |
Referencias
- Perkkio, J., Keskinen, R. Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming. Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).
- Chien, S., Jan, K. Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation. Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).
- Neu, B....
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation
Posted by JoVE Editors on 11/30/2015. Citeable Link.
An erratum was issue for Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation. The introduction section was updated.
