Artículo de método

Ratón Naïve CD4 + Aislamiento de células T y In vitro Diferenciación en subconjuntos de células T

DOI:

10.3791/52739

⸱

16 de abril de 2015

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, The Chicago Medical School, Rosalind Franklin University of Medicine and Science

En este artículo

Resumen

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+ > 'jove_content'Naïve se polarizan en varios subconjuntos dependiendo del entorno en el momento de la activación. La diferenciación de los linfocitos T CD4+ naïve a varios subconjuntos efectores se puede lograr in vitro mediante la adición de estímulos del receptor de linfocitos T y señales específicas de citocinas.

Resumen

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Las células T CD4+ inexpertas (ingenuas) experimentan expansión y diferenciación a subconjuntos efectores en el momento del reconocimiento del receptor de células T (TCR) del antígeno afín presentado en la clase II del MHC. Las señales de citocinas presentes en el medio ambiente en el momento de la activación de TCR son un factor importante en la determinación del destino efector de una célula T CD4+ vírgenes. Aunque el entorno de las citocinas durante la activación de los linfocitos T vírgenes puede ser complejo e involucrar señales redundantes y opuestas in vivo, la adición de varias combinaciones de citocinas durante la activación vítrea de los linfocitos T CD4+ vítreos ingenuos puede promover fácilmente el establecimiento de linajes de T auxiliares efectores con expresión distintiva de citocinas y factores de transcripción. Estos experimentos de diferenciación se utilizan habitualmente como primer paso para la evaluación de dianas que se cree que promueven o inhiben el desarrollo de ciertos subconjuntos de T auxiliares CD4+. La adición de mediadores, como agonistas de señalización, antagonistas u otras citocinas, durante el proceso de diferenciación también se puede utilizar para estudiar la influencia de un objetivo particular en la diferenciación de las células T. Aquí, describimos un protocolo básico para el aislamiento de células T vírgenes de ratón y los pasos posteriores necesarios para polarizar células vírgenes a varios linajes de efectores T auxiliares in vitro.

Introducción

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El concepto de linajes o subconjuntos de CD4 + T helper distintas células (Th) ha estado presente desde la última parte del siglo 20 1. El reconocimiento de antígeno afín en presencia de señales coestimuladoras resultados en varias rondas de proliferación celular y la eventual diferenciación en células Th efectoras. El tipo de célula Th generado durante este proceso es dependiente del entorno de citoquinas presentes durante la activación 2. Inicialmente, se creía que las células Th ingenuas para polarizar en 2 linajes distintos siguientes receptor de células T (TCR) de activación, la ligadura de CD28 coestimuladora, y la se....

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Protocolo

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Todos los procedimientos experimentales se realizaron utilizando los protocolos aprobados por la Oficina de Salud y Seguridad Ambiental de la Universidad Rosalind Franklin de Medicina y Ciencia. C57BL / 6 ratones (adquirida de NCI) que se utiliza para este protocolo fueron alojados en condiciones libres de patógenos específicos, y todos los experimentos con animales se realizaron usando protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) en la Universidad Rosalind Franklin de Medicina y Ciencia.

1. Preparación del instrumental, insumos y reactivos

  1. Coat de 48 pocillos o placas de 24 pocillos con....

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Resultados

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El punto de tiempo para el análisis de la diferenciación puede variar dependiendo de la condición Th está probando así como la fuerza de la activación del receptor de células T. Después de 2-3 días de diferenciación, las células pueden ser visualizadas por microscopía de luz para determinar el grado de proliferación de células T. Wells expositoras extensa proliferación y de agrupación de células más probable es estar listo para el análisis en el día 4. Condiciones de diferenciación que dependen de la adición de IL-2 exó.......

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Discusión

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Mientras que el bazo contiene células Th ingenuo, la proporción de esta población en los ganglios linfáticos es mucho mayor. No identificar correctamente y extirpar los ganglios linfáticos en este protocolo se traducirá en un pobre rendimiento de células ingenuas. Esto puede ser especialmente difícil en ratones más viejos o los ratones machos que tienen más tejido adiposo. Como se muestra en la Figura 1, la fijación adecuada y la fijación de las extremidades y la piel de animales permitirá más fácil la .......

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Divulgaciones

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Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer a todos los miembros del laboratorio de Reynolds en Rosalind Franklin de la Universidad de Medicina y Ciencia, y el laboratorio de Chen Dong de la Universidad del Centro Oncológico MD Anderson de Texas para la optimización de este protocolo. Este trabajo fue apoyado por una beca para JMR de los Institutos Nacionales de la Salud (K22AI104941).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
RPMI completo:Calentar en un baño de agua de 37 oC antes de usar
RPMI 1640 MediaLife Technologies11875119
10 % FBSLife Technologies26140-079
1000X 2-mercaptoetanolLife Technologies21985023
100X Pen/StrepLife Technologies15140122
100X L-glutaminaLife Technologies25030081
malla de nailon de 120 micrasAmazonCMN-0120-10YDCorte en cuadrados de 2 cm2 y autoclave
Alternativa: filtros de celdas de 100 micrasFisher08-771-19Alternativa al corte de malla de nailon
tampón de funcionamiento autoMACSMiltenyi130-091-221Calentar en un baño de agua de 37 oC antes
de usar la solución de enjuague autoMACSMiltenyi130-091-222Calentar en un baño de agua de 37 oC antes de usar
perlas de CD4Miltenyi130-049-201
Tampón de lisis ACKLife TechnologiesA10492-01
Citocinas:
Humano (h) IL-2Peprotech200-02
Ratón recombinante (rm) IL-4Peprotech214-14
rmIL-6R & D Systems406-ML-025
rmIL-12Peprotech210-12
hTGFbR & D Systems240-B-010
Anticuerpos:
2C11 (anti-CD3)BioXcellBE0001-1
37.51 (anti-CD28)BioXcellBE0015-1
11B11 (anti-IL-4)BioXcellBE0045
XMG1.2 (anti-IFNg)BioXcellBE0055
anti-CD62L-FITCBioLegend104406Úselo a 1:100
anti-CD25-PE102008Úselo a 1:400
anti-CD4-PerCP100434Úselo a 1:1000
anti-CD44-APCBioLegend103012Úselo a 1:500
Especiato   12-miristato 13 acetato (PMA)Sigma-AldrichP-8139Prepare un stock a 0,1 mg/ml en DMSO y congele las alícuotas a -20 oC
IonomicinaSigma-AldrichI-0634Preparar un stock a 0,5 mg/ml en DMSO y congelar alícuotas a -20 oC
Brefeldin AeBioscience00-4506-51Usar a 1:1000

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).
  2. Dong, C., Flavell, R. A.

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