Etiquetado y mediada por virus Trasplante de Medial ganglionar Eminencia (MGE) Las células para<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudios

Resumen

GABAérgicas progenitores interneuronas corticales se dispersan, desarrollar y sinápticamente integrar en una corteza de acogida después del trasplante. Estas células pueden ser fácilmente transducidas antes del trasplante para estudios in vivo de precursores GABAérgicas modificados genéticamente. Aquí, mostramos las técnicas de etiquetado virales para apuntar subgrupos interneuron específicos utilizando líneas de Cre existentes y reporteros Cre-dependientes.

Resumen

GABAérgicas interneuronas corticales, derivados de la medial embrionario y eminencias ganglionares caudales (MGE y CGE), son funcional y morfológicamente diversa. Las incursiones se han hecho en la comprensión de las funciones de los distintos subgrupos de interneuronas corticales, sin embargo, todavía hay muchos mecanismos por resolver que pueden contribuir al desarrollo y maduración de los diferentes tipos de células GABAérgicas. Por otra parte, la señalización GABAérgica alterado puede contribuir a fenotipos de autismo, la esquizofrenia y la epilepsia. Líneas específicas Cre-controladores han comenzado a repartir las funciones de subgrupos interneuron únicas. A pesar de los avances en modelos de ratón, a menudo es difícil de estudiar de manera eficiente GABAérgicas progenitores interneuronas corticales con enfoques moleculares in vivo. Una técnica importante utilizada para estudiar la programación autónoma celular de estas células es el trasplante de células MGE en cortezas de acogida. Estas células trasplantadas migrar considerablemente, diferenciar, unand integrar funcionalmente. Además, las células MGE pueden ser transducidas eficientemente con lentivirus inmediatamente antes del trasplante, lo que permite una multitud de enfoques moleculares. A continuación te detallamos un protocolo para transducir eficazmente células MGE antes del trasplante para el análisis in vivo, utilizando líneas de Cre-controladores disponibles y vectores de expresión Cre-dependientes. Este enfoque es ventajoso, ya que combina la manipulación genética precisa con la capacidad de estas células para dispersar después del trasplante, lo que permite una mayor resolución específica de tipo celular in vivo.

Introducción

GABAérgicas interneuronas corticales comprenden ~ 20-30% de las neuronas en la neocorteza de los mamíferos, mientras que el resto corresponde a excitatorios, neuronas glutamatérgicas principales. Las interneuronas son muy diversos en las propiedades electrofisiológicas, axón y dendritas y morfología sináptica objetivo ^1, y los desequilibrios en el tono excitatorio / inhibitoria son la hipótesis de base de algunos fenotipos de los trastornos neuropsiquiátricos / neurológicos como el autismo, la esquizofrenia y la epilepsia ^2. El objetivo general del protocolo descrito en este documento es proporcionar un medio para modificar genéticamente de mane....

Protocolo

Declaración de Ética: Los siguientes procedimientos han sido aprobados por nuestro protocolo de la institución y de los animales. Asegúrese de obtener la aprobación para todos los procedimientos relacionados con cirugías de supervivencia antes de comenzar los experimentos y verificar todos los protocolos están al día.

1. Preparación Lentivirus (Paso opcional)

1. Dividir tres placas de 10 cm de células HEK293T para cada lentivirus a realizar, en la presencia de 10 ml de DMEM / FBS al 10%, y crecer a ~ 60-70% de confluencia. Se cultivan las células en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO _2.
2. Transfectar ....

Resultados

Dado que las células de MGE tienen la capacidad única para migrar e integrar al ser implantadas en un neocórtex anfitrión ^16, proporcionan un excelente sistema modelo para la manipulación genética antes de los estudios in vivo. En la presente memoria, se muestra cómo se puede aislar de tejido MGE de embriones E13.5 (Figuras 1 y 2), que luego pueden ser transducidas con lentivirus ya sea in vitro o en una manera rápida antes del trasplante para estudios in vivo. MGE .......

Discusión

El uso de GABAérgicas precursores interneuronas corticales de las eminencias ganglionares embrionarias (GES) para las terapias celulares basadas está mostrando promesa para muchas condiciones ^{12 -1 4.} Se necesitan técnicas moleculares precisas para realizar un seguimiento, y expresar genes de interés en subgrupos específicos interneuronas. Aquí se proporciona un protocolo detallado para el etiquetado de las células embrionarias MGE con lentivirus antes del trasplante y mostrar cómo esta técnica puede usarse p.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos y equipos para el trasplante de células MGE
jeringa de 1 ml	REF	309602 BD, Becton Dickinson y compañía
aguja de 30 1/2 G	305106	BD, Becton Dickinson y compañía
Diámetro de precisión para entregar 5 µ l (viene con émbolo)	5-000-1005	Drummond empresa
Parafilm	PM-999	Polysciences, Inc.
Microscopio estereoscópico con brazo **	MZ6	Leica
Digital solo para ratones, instrumento estereotáxico **	51725D	Stoelting company
Micromanipulador fino hidráulico de aceite de un solo eje **	MO-10	Narishige
Biseladora rotativa recubierta de diamante	hecha en casa
		instrumentos
Aceite		Cualquier droguería o farmacia
Cualquier pipeta y puntas que puedan confiarpor medida 1 µ l de volumen
** Estos son los modelos particulares que utilizamos, pero muchas otras configuraciones deberían funcionar
Reactivos opcionales (para hacer lentivirus)
25 mm, 0.45 µ m filter	09-719B	Fisher Scientific
Tubos de centrífuga ultratransparentes (25 x 89 mm)	344058	Beckman Coulter®
Lipofectamina 2000 (tamaño de 1,5 ml)	11668019	Invitrogen
Otros suministros disponibles en el mercado
pMDLg/pRRE que codifica el plásmido gag/pol	12251	Addgene
PRSV-Rev que codifica Rev	12253	Addgene
que codifica el plásmido pMD2.G VSVG	12259	Addgene
pAAV-Flex-GFP	28304	Addgene

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