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Artículo de método

Etiquetado y mediada por virus Trasplante de Medial ganglionar Eminencia (MGE) Las células para

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DOI:

10.3791/52740

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23 de abril de 2015

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1Department of Psychiatry, University of California San Francisco, 2Department of Neurological Surgery, University of California San Francisco

En este artículo

Resumen

GABAérgicas progenitores interneuronas corticales se dispersan, desarrollar y sinápticamente integrar en una corteza de acogida después del trasplante. Estas células pueden ser fácilmente transducidas antes del trasplante para estudios in vivo de precursores GABAérgicas modificados genéticamente. Aquí, mostramos las técnicas de etiquetado virales para apuntar subgrupos interneuron específicos utilizando líneas de Cre existentes y reporteros Cre-dependientes.

Resumen

GABAérgicas interneuronas corticales, derivados de la medial embrionario y eminencias ganglionares caudales (MGE y CGE), son funcional y morfológicamente diversa. Las incursiones se han hecho en la comprensión de las funciones de los distintos subgrupos de interneuronas corticales, sin embargo, todavía hay muchos mecanismos por resolver que pueden contribuir al desarrollo y maduración de los diferentes tipos de células GABAérgicas. Por otra parte, la señalización GABAérgica alterado puede contribuir a fenotipos de autismo, la esquizofrenia y la epilepsia. Líneas específicas Cre-controladores han comenzado a repartir las funciones de subgrupos interneuron únicas. A pesar de los avances en modelos de ratón, a menudo es difícil de estudiar de manera eficiente GABAérgicas progenitores interneuronas corticales con enfoques moleculares in vivo. Una técnica importante utilizada para estudiar la programación autónoma celular de estas células es el trasplante de células MGE en cortezas de acogida. Estas células trasplantadas migrar considerablemente, diferenciar, unand integrar funcionalmente. Además, las células MGE pueden ser transducidas eficientemente con lentivirus inmediatamente antes del trasplante, lo que permite una multitud de enfoques moleculares. A continuación te detallamos un protocolo para transducir eficazmente células MGE antes del trasplante para el análisis in vivo, utilizando líneas de Cre-controladores disponibles y vectores de expresión Cre-dependientes. Este enfoque es ventajoso, ya que combina la manipulación genética precisa con la capacidad de estas células para dispersar después del trasplante, lo que permite una mayor resolución específica de tipo celular in vivo.

Introducción

GABAérgicas interneuronas corticales comprenden ~ 20-30% de las neuronas en la neocorteza de los mamíferos, mientras que el resto corresponde a excitatorios, neuronas glutamatérgicas principales. Las interneuronas son muy diversos en las propiedades electrofisiológicas, axón y dendritas y morfología sináptica objetivo 1, y los desequilibrios en el tono excitatorio / inhibitoria son la hipótesis de base de algunos fenotipos de los trastornos neuropsiquiátricos / neurológicos como el autismo, la esquizofrenia y la epilepsia 2. El objetivo general del protocolo descrito en este documento es proporcionar un medio para modificar genéticamente de manera eficiente GABAérgicas progenitores interneuronas corticales antes del trasplante para análisis in vivo.

Interneuronas corticales GABAérgicas nacen en las eminencias ganglionares medial y caudal (MGE y CGE, respectivamente) 3,4, así como el área preóptica 5. Progenitores interneuronas corticales se someten a larga distancia migración tangencial seguidopor la migración radial para llegar a sus objetivos finales. Al llegar a sus destinos, estas interneuronas corticales deben integrar correctamente en la red neuronal existente, y cada subgrupo interneuron única contribuirán a los circuitos corticales de maneras específicas. Cuatro subgrupos principales se pueden distinguir por marcadores moleculares: somatostatina derivados de MGE (SST) + y parvalbúmina (PV) + subgrupos, y péptido derivado de CGE vasoactivo intestinal (VIP) + y + Reelin; SST - 6 subgrupos. Diferentes subgrupos interneuronas corticales nacen en diferentes tiempos durante el desarrollo embrionario en el MGE y CGE 7, 8. Estos y otros marcadores de interneuronas GABAérgicas corticales se han utilizado para generar líneas Cre-controlador específico para muchos de estos subgrupos 9-11.

El trasplante de progenitores MGE ha surgido como una terapia basada en células potencial para el tratamiento de trastornos que pueden ser causados ​​por desequilibriosen excitación / inhibición de 12 - 24. Estos beneficios terapéuticos pueden deberse en parte a la capacidad única de los progenitores MGE (a dispersarse, diferenciar e integrar en un cerebro huésped), o potencialmente debido a que muchos peri-somáticas células fotovoltaicas inhibidora + se derivan de la MGE. MGE células también pueden ser rápida y eficientemente transducidas con lentivirus antes del trasplante 15, permitiendo que las células que se modifican genéticamente in vitro para estudiar in vivo. La razón fundamental para el desarrollo de este enfoque era superar obstáculos en el estudio GABAérgica desarrollo interneuronas corticales y maduración. En particular, MGE trasplante permitió a los investigadores a estudiar el desarrollo de las células mutantes in vivo, cuando el ratón mutante tendría de otro modo muerto en un punto de tiempo temprano. Por otra parte, mediante la introducción de genes de interés antes del trasplante, los efectos de genes específicos en un fenotipo mutante podrían evaluarse en un effmanera ciente.

Aquí, ofrecemos un protocolo detallado para la transducción de células MGE con lentivirus previas al trasplante. Además, se muestra cómo esta técnica se puede adaptar para expresar un gen de interés en subgrupos específicos interneuronas de un grupo heterogéneo de precursores interneuronas corticales, utilizando una combinación de los lentivirus de expresión Cre-dependientes y disponibles líneas de ratones Cre-conductor. Por otra parte, este protocolo introduce técnicas y una plataforma para los investigadores de modificar genéticamente GABAérgicas precursores interneuronas corticales para estudios in vivo de una manera única. Una ventaja de esta técnica sobre otros enfoques actuales es que las células trasplantadas MGE se dispersarán lejos del sitio de la inyección. También, a diferencia de las inyecciones virales focales, después de las células MGE dispersan su morfología es más fácil de evaluar. Este enfoque se puede utilizar para estudiar el efecto de la introducción de genes de interés en las células de tipo salvaje o mutantes, la introducción de un tipo específico de célulareportero para evaluar la morfología, o potencialmente para estudiar el efecto de los alelos de la enfermedad in vivo.

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Protocolo

Declaración de Ética: Los siguientes procedimientos han sido aprobados por nuestro protocolo de la institución y de los animales. Asegúrese de obtener la aprobación para todos los procedimientos relacionados con cirugías de supervivencia antes de comenzar los experimentos y verificar todos los protocolos están al día.

1. Preparación Lentivirus (Paso opcional)

  1. Dividir tres placas de 10 cm de células HEK293T para cada lentivirus a realizar, en la presencia de 10 ml de DMEM / FBS al 10%, y crecer a ~ 60-70% de confluencia. Se cultivan las células en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2.
  2. Transfectar las siguientes plásmidos de ADN (10 g totales) en cada placa usando cualquier reactivo de transfección: 6,4 g CAG-Flex-GFP vector lentiviral (secuencia del vector de ADN proporcionadas en la Tabla 1), 1,2 g pMD2.G (codifica VSV-G), 1.2 g pRSV-Rev, y 1,2 mg pMDLg / pRRE. Los tres vectores de empaquetamiento lentiviral están disponibles comercialmente (Tabla
    Nota: Este enfoque particular utiliza lentivir tercera generaciónvectores col sino vectores segunda generación y plásmidos asociados también trabajarán.
  3. Preparar un recipiente de desechos con una solución de lejía al 10% dentro de una campana de BSL2 certificada para inactivar cualquier solución o dispositivos que contactaron o contienen lentivirus. A continuación, eliminar por completo los medios de comunicación 4-6 horas después de la transfección en la solución de cloro, reemplace con el mismo volumen de los nuevos medios, y permiten que las células crezcan.
  4. Después de 4 días, recoger los medios de comunicación en 50 ml tubos cónicos y se centrifuga a 1000 xg durante 15 min para sedimentar los residuos celulares. A continuación, filtrar el sobrenadante a través de una membrana de 0,45 micras. Cualquier filtro de unión de baja proteína, como PVDF, funciona bien. Precaución: lugar tanto de residuos sólidos y líquidos viral en la solución de lejía.
  5. Cargar 30 ml filtraron sobrenadante en tubos de ultracentrífuga y en una ultracentrífuga. Se centrifuga a 100.000 xg durante 2,5 horas a 4 ° C. Abra los tubos de centrífuga en una campana BSL2 y quitar sobrenadante en 10% Bleach. Añadir ~ 100 l de PBS a la pellet, que da títulos de 1x10 ^ 7-8 unidades infecciosas / ml. Alícuota del día y almacenar siguiente a -80 ºC. Alícuotas de lentivirus son estables a -80 ° C durante al menos seis meses.
  6. Consideración importante: Muchas instituciones tienen ahora núcleos virales. Adquirir virus concentrado con un título mínimo de 1x10 7 unidades infecciosas / ml, para obtener resultados óptimos.

2. Los ratones donantes para MGE Disección

  1. En primer lugar, establecer un apareamiento cronometrada entre una línea Cre-expresión de interés y, o bien un tipo salvaje (WT) ratón o un ratón que exprese un reportero después de la recombinación mediada por Cre.
    Nota: Muchas líneas de Cre-conductor son los transgénicos y son mantenidos y criados en el estado hemicigotos. Por lo tanto, sólo la mitad de los embriones contendrá el transgen Cre. El ADN puede ser preparada rápidamente a partir de los embriones durante un corto PCR para detectar el alelo Cre. La CRE + embriones pueden ser cosechadas de manera que sólo se utiliza el tejido MGE del genotipo deseado. Alternativamente, un reportero Cre-dependiente puede ser utilizado, para seleccionar los embriones para la disección MGE y el trasplante.
  2. Calcular qué día corresponderá a E13.5. Si los animales se emparejaron la víspera, el día de la clavija es 0,5. Solicitar ratones oportuna embarazadas o una hembra con crías WT P1 con el fin de tener tiempo postnatal (P) 1 ratones en el día que el tejido del donante será E13.5. Alternativamente, configure estos apareamientos en casa una semana antes de emparejar los animales donantes.
    Nota: La primera estrategia de generar tanto E13.5 y embriones P1 / cachorros para el mismo día es a menudo difícil de hacer con fiabilidad.

3. Preparación de los medios de comunicación, herramientas y equipos.

  1. Preparar los reactivos y herramientas para la preparación de células MGE (Tabla 2).
    1. Preparar una superficie limpia y colocar pinzas limpias, tijeras y ya sea un cuchillo o unas pinzas finas microquirúrgico (para la disección de tejidos precisa) en la superficie.
    2. Preparar la solución salina equilibrada de Hank (HBSS), fo disección, y medio de Eagle modificado por Dulbeco (DMEM) con 10% surem bovino fetal (FBS), para la transducción.
    3. Preincubación de 20-30 ml de DMEM / FBS al 10% en un 37 ° C tejido cultura incubadora durante aproximadamente 1 hora. La tapa debe aflojarse para permitir el intercambio de gases y el equilibrio del pH de los medios de comunicación.
      Nota: La preincubación de medios se puede preparar justo antes de comenzar la disección.

4. MGE Preparación celular

  1. Sacrificar el ratón embarazadas según un animal protocolo aprobado y la toma de embriones en una placa de Petri de 10 cm que contiene helado HBSS.
  2. Retire el cerebro de cada embrión utilizando un microscopio de disección (hacer uno a la vez, dejando el resto de los embriones en HBSS enfriado con hielo) y luego proceder a cortar el tejido MGE.
    Nota: se detalla a continuación, y en la Figura 1, son pasos clave que muestran cómo quitar el MGE. Además, la Figura 2 es una película que muestra toda la disecciónprocedimiento.
    1. Coloque el cerebro con la parte ventral hacia arriba (Figuras 1A, A '). Nota: también está bien tener la cara dorsal hacia arriba. Cortar el cerebro en medio a lo largo del plano sagital para generar dos piezas. Un ejemplo hemiseccionaron cerebro se muestra (Figuras 1B, B '), observe que dorsal (la corteza suprayacente) y ventral de la cubierta del cerebro y rodear el tejido eminencia ganglionar (GE).
    2. A continuación, con una mano dominante, mantenga bien muy finos fórceps o un stabknife (Tabla 2), mientras que la inmovilización del hemisferio con fórceps en poder de una mano no dominante. (Cara medial del hemisferio debe estar hacia arriba). Desdoble el dorsal y ventral tejido con pinzas y un cuchillo puñalada para revelar el tejido subyacente GE (Figura 1C y diagramado en la Figura 1 C ').
      Nota: La eliminación de algunos medios de comunicación de la placa de Petri disección puede hacer que sea más fácil para estabilizar el tejido mientras performing la disección MGE.
    3. Haga cortes rectos con la stabknife o unas pinzas finas para separar el CGE, LGE y tejidos septales (ver ejemplo cortes denotados por el rojo las líneas de puntos, figuras 1D y D '). Estos cortes se pueden realizar en cualquier orden.
      Nota: Imagine la MEG como una 'caja' que se corta el tejido circundante. Si lo hace, ayuda a reproducible hacer recortes similares para cada disección, lo que reduce la variabilidad en las disecciones de tejidos.
    4. Por último, gire el MGE en su lado y recorte el fondo (lo que fue la cara lateral del cerebro). Esto elimina la zona del manto de la MGE (descartar en las Figuras 1E y 1E ') del resto de la MGE. El aspecto restante de MGE contiene zona principalmente ventricular y porciones de la zona subventricular del MGE, que contiene casi todas las células progenitoras MGE. Continúe con este tejido.
  3. Consideración importante: la adición de gel de silicona a la parte inferior de un plato petri can servir como una superficie disección excelente, ya que protege las delicadas puntas de fórceps y proporciona una superficie suave para fijar el tejido con unas pinzas.

4.3 Las estrategias adicionales para MGE disección.

  1. Cortar la piel del embrión usando fórceps como tijeras para eliminar rápidamente el cerebro. A medida que el embrión establece en su lado, mantener el tejido en la base de la cabeza con las pinzas que se utilizan para anclar el tejido. Primero, corte ventral anterior al cerebro y posterior ventral al cerebro, y luego conectar los dos cortes a lo largo del lado del embrión. Luego agarra la solapa de piel y tirar de ella sobre la parte superior del cerebro. El cerebro puede entonces ser disecado rápidamente lejos del tejido restante.
  2. Alternativamente, anclar el aspecto posterior de todo el cerebro detrás de la corteza. Mientras tanto, sujete cada hemisferio en la cara caudal más dorsal de la corteza y rasgar la corteza lejos del tejido anclado en una dirección anterior. De este modo, tanto cOrtices pueden ser retirados y las eminencias ganglionares bilaterales se revelan, todavía unido al resto de la preservación de la anatomía del tejido medial-lateral.
  3. Cambie al cuchillo puñalada para hacer cortes precisos de todo el MGE en cada hemisferio. Utilice un conjunto separado limpio de fórceps para recoger el MGE o una pipeta con una punta grande (es decir., P1000).
    Nota: Mantenga el tejido recogido lejos de todo otro material disecado, como algunos medios de comunicación se transfiere inevitablemente cuando se recoge el MGE.
  4. Recoger el MGE y poner el tejido en un tubo de recogida de 1,5 ml contiene DMEM / FBS al 10%, (un volumen de 500 l es suficiente para recoger los MGEs). Repita para el otro hemisferio y el lugar en el mismo tubo de recogida. Mantener las muestras en hielo hasta que se recoge todo el tejido.

5. Lentiviral del etiquetado y Trasplante

  1. Mueva los tubos de tejido MGE en una campana BSL2 certificado y eliminar los medios de comunicación.
    Nota: LaTejido MGE es lo suficientemente grande como para ser visible al ojo y se depositan en el fondo del tubo lo que permite a los medios de comunicación en frío deberán ser removidos fácilmente y suavemente.
  2. Añadir ~ 500 ul de medio DMEM / 10% de FBS, que se preincubó en una cultura incubadora a 37 ° C el tejido. A continuación, añadir polibreno para facilitar la transducción a cada tubo a una concentración final de 8 mg / ml. Se tritura el tejido MGE para crear una única suspensión celular, usando una punta de pipeta P1000. Por último, añadir ~ 15-20 l de lentivirus concentrada a cada tubo.
  3. Consideración importante: Una trituración de 10-12 veces es suficiente para romper el tejido MGE de un solo embrión, pero más trituraciones puede ser necesaria si múltiples MGEs se agrupan juntos. Pruebe diferentes condiciones de trituración para determinar lo que funciona mejor.
  4. Cierre bien cada tubo, invierta para mezclar, de lugar todos los tubos en una incubadora a 37 °. Se incuban las células en lentivirus durante al menos 30 min y hasta 1 hr. Tiempos más largos han dado como resultado dela viabilidad celular arrugado. Invertir los tubos cada 10 minutos hasta que se acabe el tiempo.
  5. Después de la incubación con lentivirus, retirar los tubos de la incubadora y se centrifuga a ~ 700 xg durante 3 min para sedimentar las células. En la capilla BSL2, separar el sobrenadante y desechar en un 10% de lejía. A continuación, añadir 1 ml de DMEM / FBS al 10% y triturar la pastilla 2-3 veces para lavar y centrifugar de nuevo a la misma velocidad para sedimentar las células. Repita este paso de lavado 2-3 veces más para eliminar el exceso de virus.
    Nota: Realice los pasos de centrifugación a 4 ° C, sin embargo, la viabilidad reducida no se ha observado cuando giros cortos se llevan a cabo a temperatura ambiente.
  6. Después del último lavado, eliminar la mayor cantidad de medios de comunicación como sea posible y poner a cada tubo en hielo. Debido a los medios de comunicación residual sobre los lados del tubo, ~ 2-3 l de los medios de comunicación acabará cubriendo el sedimento celular en el momento en el procedimiento de trasplante ha comenzado.

6. Trasplante y Validación

  1. Adquirir cachorros P1 acogida y preparar el procedimientoárea por pulverización hacia abajo con etanol al 70%. Para mantener la esterilidad durante el procedimiento se recomienda para realizar estos procedimientos en una sala dedicada procedimiento de limpieza. Además, utilizan ya sea instrumental quirúrgico tratado al autoclave esterilizar superficies que los cachorros se pondrá en contacto con el uso de etanol al 70%. Un ejemplo de equipo representante necesaria para realizar los trasplantes y una zona de procedimiento representativo se muestra en la Figura 3.

Nota: Si bien este procedimiento es una inyección de volúmenes pequeños, y no un procedimiento quirúrgico que requiera una incisión, herida abierta o suturas, todavía se recomienda que una nueva micropipeta se utiliza para cada ratón a inyectar. Las micropipetas son esterilizado por calor cuando se tira y biselada en una superficie que se pulveriza con etanol al 70% se almacena en un recipiente sellado.

  1. Generar micropipetas para tener un diámetro en la punta entre 40-80 micras. A raíz de estas dimensiones rendirá óptimaresultados. Calor esterilizar las micropipetas cuando se tira y biselado en una superficie y rocíe con etanol al 70% antes de almacenar las micropipetas en un recipiente sellado.
    Nota: Como alternativa, si el acceso a los dispositivos necesarios para crear estas agujas (Tabla 2) es limitante, utilice ningún otro dispositivo de inyección. Sin embargo, éstos pueden no ser tan adecuado como las micropipetas debido a diferentes diámetros.
  2. Elaborar aceite mineral en una jeringa de 1 ml, y con una aguja de 30 G 1/2, llenar la pipeta de vidrio completamente con aceite mineral. A continuación, montar el émbolo en el dispositivo estereotáxica, luego coloque la pipeta de vidrio al dispositivo estereotáxica y carga sobre el émbolo. Uso de la unidad hidráulica, mover el émbolo hasta la mitad de la pipeta de vidrio, la eliminación de aceite mineral que se derrama fuera con una limpia una toalla de papel limpia.
    1. Alternativamente a la utilización de una jeringa, sumergir el extremo posterior de la pipeta en aceite mineral y llenado por acción capilar. Para evitar las burbujas de aire en el pipeteee, mantener la presión positiva en la jeringa hasta que esté completamente fuera de la pipeta de vidrio.
      Nota: Otros dispositivos pueden ser utilizados con éxito para trasplantar células MGE 14. Cualquier dispositivo que puede suministrar un volumen de menos de o cerca de 100 obras nl así para este procedimiento.
  3. A continuación, usar una toalla de papel estéril, o cualquier material absorbente, con la esquina torcido en una punta fina para quitar delicadamente el exceso de medios de comunicación por encima de la pastilla de células MGE. Este paso se concentra la densidad de las células de modo que los volúmenes de inyección más pequeños pueden ser alcanzados. A continuación, utilizar un volumen bajo (se prefiere P2) de la pipeta para extraer lentamente el sedimento celular y triturar 1-2 veces antes de pasar la suspensión celular sobre una superficie hidrófoba. El volumen debe ser un poco menos de 1 l. Mueva la punta de la aguja en la suspensión celular y el uso de la unidad hidráulica, elaborar la suspensión de células en la pipeta.
  4. Anestesiar un cachorro P1 a través de la hipotermia (envolver en un guante de látex y poner en hielo durante ~ 2-4 min).Comprobar la eficacia de la anestesia con un estímulo nocivo. Pellizque la piel entre los dedos de los pies con unas pinzas finas: el cachorro debe ser responder si pellizcado. Luego, coloque el cachorro sobre un molde que está en el dispositivo de inyección, a continuación, hacer que la piel tensa tirando hacia atrás la piel de la cabeza y asegurar con cinta estándar de laboratorio.
    Nota: Aunque la hipotermia es muy eficaz en ratones recién nacidos y los resultados en la baja tasa de mortalidad, los procedimientos deben realizarse rápidamente, ya que las crías comenzarán a recuperarse en menos de 10 min. Además, 4 minutos en hielo es un límite superior de lo que puede ser tolerado. Trate sólo para inducir la hipotermia una vez si se requiere un tiempo más largo para inyecciones. Sin embargo, si un cachorro se recupere pronto, primero permitir que el cachorro se recupere por completo antes de inducir la hipotermia nuevo. Por otra parte, sólo inducir hipotermia una vez más para realizar inyecciones. Los cachorros se recuperarán dentro de 5 a 10 min de la hipotermia. Esto se puede facilitar mediante la colocación de los cachorros con basura y mamá o colocando el cachorro en un surfac calientee para recuperarse.
  5. Utilizando un dispositivo estereotáxico, posicionar la punta de la pipeta de vidrio en la superficie en la cabeza del perrito, perpendicular a la superficie de la cabeza. Cuando la pipeta está en contacto con la cabeza, considerar esto como "0". A continuación, empuje la pipeta a través de la superficie de la piel y el cráneo en la corteza, a continuación, insertar y retraer la pipeta ~ 2 veces antes de detenerse. Para una óptima orientación de las células en el neocórtex, las inyecciones se realizan cuando la micropipeta es a una profundidad de 0,1 mm. Sin embargo, esto debe ser optimizado por el usuario (ver nota más abajo).
    Nota: Si bien esta profundidad se dirige de forma fiable las capas más profundas neocortical con los dispositivos descritos anteriormente, a pocas profundidades se deben probar determinadas empíricamente. Además, una gama de profundidades en diferente posición rostro-caudal y medio-lateral debe ser analizada para determinar qué profundidad es óptima en cada sitio. Además, la punción inicial debe ser rápida, como la penetración lenta en el neocórtex disminuye la capacidad de cleanly penetrar en el tejido. Pruebe diferentes velocidades cuando se empieza este procedimiento para encontrar lo que funciona mejor. Además, para las coordenadas de prueba, no hay sustituto real para el uso de células marcadas, como colorantes han sido poco fiables para indicar su posición.
  6. Una vez que la aguja está en posición, girar el dispositivo hidráulico para avanzar el émbolo en la pipeta de vidrio, empujando un volumen conjunto de suspensión de células en la corteza. Inyectar 50-70 nls por sitio. Repita este procedimiento en 3-6 sitios diferentes en los distintos niveles rostral-caudal si el objetivo es obtener una amplia distribución de las células de todo el neocórtex.
    Nota: Los volúmenes de 100 nl o mayor pueden causar lesiones y conducir a grandes grupos de células inyectadas que no pueden migrar eficazmente fuera de la zona de la inyección. Por lo tanto, el volumen de inyección más pequeños (~ 70 nl o menos) son óptimas, sobre más sitios si el tiempo lo permite.
  7. Cuando las inyecciones son, retire el cachorro desde el escenario y marcarlo (clipping dedo del pie es una manera confiable para identificar la pups más tarde). Una vez que el cachorro se ha recuperado y es capaz de moverse por sí mismo (esto ocurre a pocos minutos de las retire de la etapa), puso de nuevo con la madre y la camada.
    Nota: Dado que este es un procedimiento mínimamente invasivo no hay procedimientos post-quirúrgicas, una vez que el cachorro se mueve libremente y se calienta. Sin embargo, los cachorros deben ser revisados, no sólo después de la intervención, sino también al día siguiente para asegurarse de que no presentan signos de deterioro de la salud.
  8. Antes de iniciar el procedimiento en la siguiente pup, rocíe el área con etanol al 70% para mantener un área de trabajo estéril. Permita que los cachorros inyectados para desarrollar y luego evaluar el tejido en la etapa de desarrollo apropiada (s).

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Resultados

Dado que las células de MGE tienen la capacidad única para migrar e integrar al ser implantadas en un neocórtex anfitrión 16, proporcionan un excelente sistema modelo para la manipulación genética antes de los estudios in vivo. En la presente memoria, se muestra cómo se puede aislar de tejido MGE de embriones E13.5 (Figuras 1 y 2), que luego pueden ser transducidas con lentivirus ya sea in vitro o en una manera rápida antes del trasplante para estudios in vivo. MGE ...

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Discusión

El uso de GABAérgicas precursores interneuronas corticales de las eminencias ganglionares embrionarias (GES) para las terapias celulares basadas está mostrando promesa para muchas condiciones 12 -1 4. Se necesitan técnicas moleculares precisas para realizar un seguimiento, y expresar genes de interés en subgrupos específicos interneuronas. Aquí se proporciona un protocolo detallado para el etiquetado de las células embrionarias MGE con lentivirus antes del trasplante y mostrar cómo esta técnica puede usarse p...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por becas de JLRR de: Autism Speaks, Nina Irlanda, Weston Havens Fundación, NIMH R01 MH081880, y NIMH R37 MH049428. PRW fue apoyado por una beca del Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán. SFS fue apoyada por F32 (MH103003).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivos y equipos para el trasplante de células MGE
jeringa de 1 mlREF309602 BD, Becton Dickinson y compañía
aguja de 30 1/2 G305106BD, Becton Dickinson y compañía
Diámetro de precisión para entregar 5 µ l (viene con émbolo)5-000-1005Drummond empresa
ParafilmPM-999Polysciences, Inc.
Microscopio estereoscópico con brazo **MZ6Leica
Digital solo para ratones, instrumento estereotáxico **51725DStoelting company
Micromanipulador fino hidráulico de aceite de un solo eje **MO-10Narishige
Biseladora rotativa recubierta de diamantehecha en casa
instrumentos
AceiteCualquier droguería o farmacia
Cualquier pipeta y puntas que puedan confiarpor medida 1 µ l de volumen
** Estos son los modelos particulares que utilizamos, pero muchas otras configuraciones deberían funcionar
Reactivos opcionales (para hacer lentivirus)
25 mm, 0.45 µ m filter09-719BFisher Scientific
Tubos de centrífuga ultratransparentes (25 x 89 mm)344058Beckman Coulter®
Lipofectamina 2000 (tamaño de 1,5 ml)11668019Invitrogen
Otros suministros disponibles en el mercado
pMDLg/pRRE que codifica el plásmido gag/pol12251Addgene
PRSV-Rev que codifica Rev12253Addgene
que codifica el plásmido pMD2.G VSVG12259Addgene
pAAV-Flex-GFP28304Addgene
científicaExtractor de pipetas de aguja 730 Kopf mineral

Referencias

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