C. elegans es un organismo modelo atractivo para estudiar las vías de transducción de señales involucradas en la resistencia al estrés oxidativo. Aquí proporcionamos un protocolo para medir la resistencia al estrés oxidativo de animales C. elegans en fase líquida, utilizando varios agentes oxidantes en placas de 96 pocillos.
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Artículo de método
Medición de la resistencia de estrés oxidativo
En este artículo
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Resumen
Resumen
El estrés oxidativo, que es el resultado de un desequilibrio entre la producción y la desintoxicación de especies reactivas del oxígeno, es un importante contribuyente a trastornos humanos crónicas, incluyendo enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas, diabetes, envejecimiento, y cáncer. Por lo tanto, es importante para estudiar el estrés oxidativo no sólo en sistemas celulares, sino también el uso de organismos enteros. C. elegans es un organismo modelo atractivo para estudiar la genética de las vías de transducción de señales de estrés oxidativo, que se conservan altamente evolutivamente.
Aquí, ofrecemos un protocolo para medir la resistencia al estrés oxidativo en C. elegans en líquido. Reactivos Brevemente, ROS inductores como el paraquat (PQ) y H 2 O 2 se disuelven en tampón M9, y las soluciones se dividen en partes alícuotas en los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos. L4 Sincronizada / joven C. elegans animales se transfieren a los pocillos (5-8 animales / pocillo) y se mide la supervivenciacada hora hasta que la mayoría de los gusanos están muertos. Cuando se realiza un ensayo de resistencia al estrés oxidativo usando una baja concentración de factores de estrés en las placas, el envejecimiento podría influir en el comportamiento de los animales sobre el estrés oxidativo, lo que podría dar lugar a una interpretación errónea de los datos. Sin embargo, en el ensayo descrito en el presente documento, este problema es poco probable que ocurra ya que se están utilizando sólo L4 / animales adultos jóvenes. Por otra parte, este protocolo es de bajo costo y los resultados se obtienen en un día, lo que hace que esta técnica atractiva para pantallas genéticos. En general, esto le ayudará a entender las vías de transducción de señales de estrés oxidativo, lo que podría traducirse en una mejor caracterización de los trastornos humanos con el estrés oxidativo asociado.
Introducción
En eucariotas, la fosforilación oxidativa que tiene lugar en la cadena de transporte de electrones de la mitocondria es el principal motor de la producción de energía en forma de ATP. Especies reactivas del oxígeno (ROS) son un subproducto natural de este proceso. A pesar de su importante papel como moléculas de señalización, excesiva ROS puede conducir a daños en el ADN, carbonilación de proteínas, y la oxidación de los lípidos. Un desequilibrio entre la producción y la desintoxicación ROS causa el estrés oxidativo, que conduce a agotamiento de la energía, el daño celular, y desencadena la muerte celular 1,2. El estrés oxidativo contribuye al envejecimien....
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Protocolo
1. Preparación de los reactivos
- Preparación de los medios de comunicación para C. crecimiento elegans (en este caso, los animales de tipo salvaje y los animales FLCN-1 (ok975) mutantes).
- Prepárese Modificado Sólo Bacto-peptona (MYOB) mezcla seca de Youngren que contiene 5,5 g de Tris HCl, 2,4 g de base Tris, 31 g de Bactopetone, 20 g de NaCl y 0,08 g de colesterol. Mezclar bien con agitación.
NOTA: Esta mezcla es suficiente para preparar 10 litros de medio MYOB.
NOTA: placas de medio de crecimiento normal (NGM) podrían utilizarse en lugar de placas de 27 MYOB. Sin embargo, el mismo tipo de placas....
- Prepárese Modificado Sólo Bacto-peptona (MYOB) mezcla seca de Youngren que contiene 5,5 g de Tris HCl, 2,4 g de base Tris, 31 g de Bactopetone, 20 g de NaCl y 0,08 g de colesterol. Mezclar bien con agitación.
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Resultados
La comparación de tipo salvaje C. elegans para FLCN-1 (ok975) animales mutantes
Aquí hemos utilizado PQ 100 mM para determinar la resistencia de tipo salvaje C. elegans animales en comparación con FLCN-1 (ok975) que se ha demostrado para resistir el estrés oxidativo, el calor y la anoxia 23. Después de 4 horas de tratamiento, el 48,3% de los de tipo salvaje sobrevivido en comparación con el 77,8% de supervivencia en-1 FLCN (ok975) anima.......
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Discusión
C. elegans es un organismo modelo atractivo para estudiar la resistencia al estrés oxidativo genéticamente in vivo, ya que puede ser fácilmente cultivada, y rápidamente conduce a un gran número de descendencia genéticamente idéntica. Múltiples métodos para medir la resistencia al estrés oxidativo se han descrito anteriormente y se basan en la administración de suplementos de placas de cultivo con varias fuentes de ROS tales como PQ, rotenona, H 2 O 2, y juglone 25,26,29-32.
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Reconocemos el Centro de Genética Caenorhabditis para C. cepas elegans. El apoyo financiero fue proporcionado por el Instituto de Investigación de Fox Terry. También reconocemos el apoyo otorgado a EP de la Rolande y Marcel Gosselin Graduate Beca y la beca de formación CIHR / FRSQ en FRN53888 investigación del cáncer del Programa de Formación de Investigación del Cáncer de McGill Integrado.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agar de grado bacteriológico | Multicell | 800-010-LG | |
| Peptona bacteriológica | Oxoid | LP0037 | |
| Cloruro de sodio grado biotecnológico | Bioshop | 7647-14-5 | |
| Colesterol | Sigma | C8503-25G | |
| UltraPure trichidrato de tris | Invitrogen | 15506-017 | |
| Tris aminometano | Bio Basic Canada Inc | 77-86-1 | |
| IPTG | Santa Cruz Biotechnology | sc-202185A | |
| Ampicilina | Bioshop | 69-52-3 | |
| Extracto de levadura | Bio Basic Inc. | 8013-01-2 | |
| Dicloruro de viológeno de metilo hidrato | Aldrich química | 856177-1G | |
| Placa de Petri 60 x15 mm | Pipeta FB0875713A | ||
| 10 ml | Fisher | 1367520 | |
| Fosfato de potasio monobásico | G-Biosciences | RC-084 | |
| Sulfato de magnesio heptahidratado | Sigma | M-5921 | |
| Fosfato de sodio dibásico | Bioshop | 7558-79-4 | |
| Discovery v8 microscopio | |||
| 96 pocillos placa | |||
| flcn-1 fuente de ARNi | Biblioteca |
Referencias
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Curr Biol. 24, R453-R462 (2014).
- Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, 936486(2012).
- Finkel, T., Holbrook, N. J.
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
A reference was corrected in the publication of Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates. There was an error with reference 34 in the Citations section. It has been updated from:
Allen, E., Walters, I.B., Hanahan, D. Brivanib a dual FGF/VEGF inhibitor,is active both first and second line againstmouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance toVEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, (16) 5299-310 (2011).
to:
Allen, A. T., Maher, K. N., Wani, K. A., Betts, K. E., & Chase, D. L. Coexpressed D1- and D2-like dopamine receptors antagonistically modulate acetylcholine release in Caenorhabditis elegans. Genetics. 188, 579-590 (2011).
