Aquí, presentamos un modelo de flujo ex vivo en el que se pueden cultivar válvulas cardíacas murinas, lo que permite el estudio de la biología de la válvula.
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Artículo de método
El cultivo de ratón cardíaca válvulas en el sistema de cultivo tisular miniatura
En este artículo
Resumen
Resumen
La enfermedad de las válvulas cardíacas es una carga importante en el mundo occidental y no hay ningún tratamiento efectivo disponible. Esto se debe principalmente a la falta de conocimiento de los mecanismos moleculares, celulares y mecánicos que subyacen al mantenimiento y/o pérdida de la estructura valvular.
Los modelos actuales utilizados para estudiar la biología valvular incluyen cultivos in vitro de células valvulares, endoteliales e intersticiales. Aunque los modelos de cultivo in vitro proporcionan mecanismos celulares y moleculares, los mecanismos implicados en la organización 3D de la válvula siguen sin estar claros. Si bien los modelos in vivo han proporcionado información sobre los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo valvular, la comprensión de la biología valvular adulta sigue siendo difícil de alcanzar.
Con el fin de poder estudiar la regulación de la organización valvular 3D a nivel tisular, celular y molecular, hemos desarrollado el Sistema de Cultivo de Tejidos en Miniatura. En este modelo de flujo ex vivo, la válvula mitral o aórtica se cultiva en su posición natural en el corazón. La configuración y composición natural de la valva se mantienen, permitiendo la respuesta más natural de las células valvulares a los estímulos. Las válvulas siguen siendo viables y responden a las condiciones ambientales cambiantes. Este MTCS puede proporcionar ventajas en el estudio de preguntas que incluyen, entre otras, cómo afecta la organización 3D a la biología valvular, qué factores afectan la organización 3D de la válvula y qué red de vías de señalización regula la organización 3D de la válvula.
Introducción
Enfermedad de las válvulas cardíacas son una causa importante de morbilidad y mortalidad en el mundo occidental; su prevalencia aumenta con la edad y afecta a más del 10% de la población de 75 años y mayores 1. Las válvulas de la parte sistémica del corazón, las válvulas aórtica y mitral, son en su mayoría afectada. Enfermedad de la válvula cardíaca se caracteriza por la pérdida de la estructura altamente organizada de las válvulas, lo que resulta en la alteración de las propiedades mecánicas 2. La integridad estructural tanto, es fundamental para la función de la válvula.
Las valvas de la válvula se componen de célu....
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Protocolo
Este protocolo sigue las directrices LUMC del comité de ética de la investigación animal.
1. Preparación de instrumentos, medio de cultivo, y MTCS
Nota: Realice todas las preparaciones en la campana de flujo laminar. La cámara de perfusión MTCS, trampa de burbujas y el soporte se describen en Lieber et al., 2010 11.
- Desinfectar los fórceps y micro tijeras con etanol al 70%. Preparar una jeringa de 5 ml con una aguja 21G con NaCl estéril de Tyrode Buffer (130 mM, 5,4 mM KCl, mM Hepes 6,0, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, mM glucosa 20, 1,5 mM CaCl ....
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Resultados
La válvula aórtica (Figura 2) o la válvula mitral 11 pueden ser cultivadas durante al menos 3 días. Mediante el cultivo en la posición abierta (que representa la posición sistólica de la válvula aórtica y la posición diastólica para la válvula mitral), las células permanecen viables valvulares. No se observa la muerte celular tal como se determina por la ausencia de células TUNEL positivas (Figura 2H, I) o exfoliados caspasa-3 de expresión (que no se muestra y Lieber et a.......
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Discusión
Los pasos críticos en el cultivo de las válvulas de ratón cardíacas incluyen hacer el tiempo entre la extirpación del corazón desde el ratón y la ligadura en la cámara de perfusión tan corto como sea posible para asegurar la viabilidad y la ligadura de las agujas perpendicular a las válvulas para garantizar la dirección apropiada de la corriente de . Adicionalmente, control del caudal después de la ligadura en la cámara de perfusión sin medio asegura la inserción y la ligación de agujas apropiada. Es fundamental para ma.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este estudio cuenta con el apoyo de la Fundación Holandesa del Corazón y el Instituto Holandés de Medicina Regenerativa.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Águila modificada Medium Life Technologies | 10569-010 | ||
| Suero fetal bovino | Life Technologies | 26140 | |
| Insulina-transferrina-selenio | Life Technologies | 41400-045 | |
| Antibiótico-Antimicótico | Life Technologies | 15240-06 | |
| Seda 7-0 | Ethicon | 768G | |
| Placa | de cultivo de 100 mmGreiner bio-one | 664160 | |
| tubo de 50 ml | Greiner bio-one | 227261 | |
| jeringa de 5 ml | BD | 309649 | |
| 21 G aguja | BD | 304432 | |
| Heparina | LEO | 012866-08 | |
| Pinzas | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Tijeras, Económicas, Tipo Vannas | Tedpella | 1346 | |
| Tubo de silicona | Thermo Scientific | 8060-0020 | Diámetro interno x Diámetro exterior x Pared: 1,59 x 3,18 x 0,79 mm |
| Tubo de silicona para bomba | Masterflex | 96400-13 | Diámetro interno x diámetro exterior x Pared: 0,8 x 1,59 x 0,40 mm |
| Pegamento biocompatible (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| vaporizador de precisión | Drä ger | Vapor 200 | |
| bomba peristáltica de rodillos | Masterflex | 7521-35 | |
| Cabezal de bomba de carga fácil | Masterflex | 7518-00 | |
| Cámara | véase Lieber et al., 2010 | ||
| Trampa | véase Lieber et al., 2010 |
Referencias
- Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2013).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and Cel....
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Reimpresiones y permisos
