Aplicación del ADN específico de la mancha verde de metilo en el etiquetado fluorescente de embriones

Resumen

Se describe un método para la tinción fluorescente de material biológico fijado con la etiqueta específica de ADN verde de metilo. El verde de metilo se utiliza en una solución acuosa diluida y es muy resistente al fotoblanqueo. Su emisión de color rojo lejano permite la obtención de imágenes profundas de las muestras, lo que la hace especialmente adecuada para embriones enteros.

Resumen

El verde de metilo se conoce desde hace mucho tiempo como una tinción histológica con una afinidad específica por el ADN, aunque sus propiedades fluorescentes han permanecido inexploradas hasta hace poco. En este artículo, ilustramos el método para preparar una solución madre acuosa de verde metilo, que cuando se diluye se puede usar como una etiqueta nuclear fluorescente muy conveniente para células y tejidos fijos. Se detallan procedimientos sencillos para etiquetar embriones enteros de pez cebra y pollito, y se muestran ejemplos de imágenes obtenidas. El verde de metilo es excitado al máximo por la luz roja, a 633 nm, y emite con un espectro relativamente agudo que alcanza su punto máximo a 677 nm. Es muy barato, no tóxico, muy estable en solución y muy resistente al fotoblanqueo cuando se une al ADN. Su emisión roja permite obtener imágenes confocales de escaneo de alta resolución inalteradas de núcleos en muestras gruesas. Por último, este protocolo de tinción con verde de metilo es compatible con otros procedimientos de tinción celular, como el marcaje de anticuerpos o el marcaje de filamentos de actina con faloidina conjugada con fluoróforos.

Introducción

La tinción fluorescente de ADN se utiliza amplia y rutinariamente tanto en la investigación biológica como en el diagnóstico clínico, ya sea para el estudio detallado de la estructura nuclear y cromosómica, para contratinción de tejidos y células, o para el estudio de los parámetros del ciclo celular¹. Aunque existen varias tinciones de ADN, las más utilizadas han sido las excitadas por luz ultravioleta y emitidas en azul, que encajan en los sistemas habituales de tres filtros utilizados en la mayoría de los microscopios de epifluorescencia convencionales cuando se combinan con fluoróforos emisores de verde y rojo anaranjado, como proteínas fluorescentes o ....

Protocolo

1. Purificación del colorante

1. Preparar una solución acuosa al 4% de verde de metilo disolviendo 0,4 g de polvo de manchas en 10 ml de agua destilada. Mezclar bien hasta que esté completamente disolviéndolo.
2. Bajo un humo del capó, se mezcla con al menos 2 partes de cloroformo. Es importante comprobar de antemano si los tubos son resistentes cloroformo.
3. Mezclar bien y centrifugar durante 1 min a 2000 xg para acelerar la separación de fases.
4. Después de la centrifugación, se obtienen una fase superior acuosa con verde de metilo y una fase orgánica inferior con cloroformo y la habitual cristal violeta contaminante.
5. Recupe....

Resultados

Tinción nuclear de muestras gruesas. El protocolo aquí descrito permite el logro de la tinción homogénea de estructuras profundas en embriones enteros. Lentes en desarrollo forman núcleos 48 HPF embriones de pez cebra son homogéneamente etiquetados (Figura 1).

Tinción de ADN verde de metilo permite la discriminación de diferencias morfológicas del ciclo celular dependientes tales como la identificación de figuras mitóticas o núcleos apoptóticos (Figura 2a). .......

Discusión

El progresivo desarrollo de las técnicas de microscopía en las últimas décadas, con especial atención a las variaciones de la microscopía fluorescente, ha llevado a la posibilidad de explorar la dinámica y estructura de muestras de tejido intactas, incluidos embriones enteros^10,11. Sin embargo, una limitación importante ha sido la disponibilidad de fluoróforos de buena calidad que se pueden usar para teñir directa y rápidamente las estructuras subcelulares.

Las tinciones de ADN flu.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
Verde de metilo	Dr. G. Grü bler		También probó Sigma-Aldrich 323829, que es un 158127
de microscopía confocal de barrido láser sin paraformaldehído sin cristales Sigma-Aldrich Leica TCS-SP5	Leica Microsystems
Isotiocianato de tetrametilrodamina B	Sigma-Aldrich	P1951
cloroformo	Sigma-Aldrich	372978
Centrífuga 5810 R	eppendorf	5811 000.010
portaobjetos para microscopio	Deltalab D100004
cubreobjetos	Esco optics	R525025

Phalloidin–