Aplicación del ADN específico de la mancha verde de metilo en el etiquetado fluorescente de embriones

Resumen

Se describe un método para la tinción fluorescente de material biológico fijado con la etiqueta específica de ADN verde de metilo. El verde de metilo se utiliza en una solución acuosa diluida y es muy resistente al fotoblanqueo. Su emisión de color rojo lejano permite la obtención de imágenes profundas de las muestras, lo que la hace especialmente adecuada para embriones enteros.

Resumen

El verde de metilo se conoce desde hace mucho tiempo como una tinción histológica con una afinidad específica por el ADN, aunque sus propiedades fluorescentes han permanecido inexploradas hasta hace poco. En este artículo, ilustramos el método para preparar una solución madre acuosa de verde metilo, que cuando se diluye se puede usar como una etiqueta nuclear fluorescente muy conveniente para células y tejidos fijos. Se detallan procedimientos sencillos para etiquetar embriones enteros de pez cebra y pollito, y se muestran ejemplos de imágenes obtenidas. El verde de metilo es excitado al máximo por la luz roja, a 633 nm, y emite con un espectro relativamente agudo que alcanza su punto máximo a 677 nm. Es muy barato, no tóxico, muy estable en solución y muy resistente al fotoblanqueo cuando se une al ADN. Su emisión roja permite obtener imágenes confocales de escaneo de alta resolución inalteradas de núcleos en muestras gruesas. Por último, este protocolo de tinción con verde de metilo es compatible con otros procedimientos de tinción celular, como el marcaje de anticuerpos o el marcaje de filamentos de actina con faloidina conjugada con fluoróforos.

Introducción

La tinción fluorescente de ADN se utiliza amplia y rutinariamente tanto en la investigación biológica como en el diagnóstico clínico, ya sea para el estudio detallado de la estructura nuclear y cromosómica, para contratinción de tejidos y células, o para el estudio de los parámetros del ciclo celular¹. Aunque existen varias tinciones de ADN, las más utilizadas han sido las excitadas por luz ultravioleta y emitidas en azul, que encajan en los sistemas habituales de tres filtros utilizados en la mayoría de los microscopios de epifluorescencia convencionales cuando se combinan con fluoróforos emisores de verde y rojo anaranjado, como proteínas fluorescentes o pequeñas moléculas unidas a los anticuerpos. Entre estas tinciones de ADN emisoras de azul, las más comunes son los agentes aglutinantes de surcos menores DAPI y Hoechst^2,3. No obstante, la incorporación de una amplia variedad de líneas de emisión láser y la detección espectral en los microscopios de barrido láser, ha permitido a los investigadores optar por el uso de tinciones nucleares emisoras de rojo lejano como el yoduro de propidio (PI) o TO-PRO 3⁴. Una ventaja de estas tinciones es que superan el problema de la autofluorescencia que se encuentra en muchas células y tejidos, particularmente en embriones⁵, pero muchos de ellos tienen diferentes problemas como tener perfiles de emisión amplios o ser muy sensibles al fotoblanqueo⁶.

El investigador suizo Friedrich Miescher descubrió el ADN en 1869, extrayéndolo de los núcleos de los glóbulos blancos que se encuentran en el pus. Lo llamó nucleína, y demostró unos años más tarde que formaba precipitados con la tinción relativamente nueva verde de metilo. El verde de metilo está compuesto por tres anillos de anilina, con diferentes grados de metilación, y tiene dos cargas positivas que le permiten unirse fuertemente al surco principal del ADN^7,8. Muy pronto se demostró que la tinción de ADN por verde de metilo era específica, lo que llevó al desarrollo por parte de Unna y Pappenheim de una tinción combinada con pironina, que marca específicamente el ARN. Desde entonces, el verde de metilo pironina se ha utilizado ampliamente en la técnica histológica de rutina⁹.

Hasta hace poco, se sabía muy poco sobre las propiedades fluorescentes del verde de metilo. Nuestro trabajo anterior, sin embargo, ha descubierto algunas de las ventajas espectrales del verde de metilo⁶, como su excitación a 633 nm, un conveniente desplazamiento de Stokes, su emisión en la porción del espectro electromagnético del infrarrojo cercano, una fotoestabilidad más alta que las tinciones de ADN disponibles comercialmente con propiedades espectrales similares y a un costo muy bajo. Es por eso que decidimos probarlo para su uso como un marcador fluorescente de muy alta afinidad y específico para el ADN en tejidos embrionarios y en embriones completos. Además, hasta ahora, la tinción nuclear con verde de metilo se realizaba a pH bajo, lo que dificultaba su combinación con la tinción de anticuerpos. El objetivo del método aquí detallado es disponer de un protocolo de tinción de ADN nuclear fluorescente que supere el inconveniente antes mencionado al realizar el procedimiento de tinción a pH fisiológico, lo que lo convierte en una contratinción adecuada para el inmunomarcaje en secciones y tejidos completos.

Protocolo

1. Purificación del colorante

1. Preparar una solución acuosa al 4% de verde de metilo disolviendo 0,4 g de polvo de manchas en 10 ml de agua destilada. Mezclar bien hasta que esté completamente disolviéndolo.
2. Bajo un humo del capó, se mezcla con al menos 2 partes de cloroformo. Es importante comprobar de antemano si los tubos son resistentes cloroformo.
3. Mezclar bien y centrifugar durante 1 min a 2000 xg para acelerar la separación de fases.
4. Después de la centrifugación, se obtienen una fase superior acuosa con verde de metilo y una fase orgánica inferior con cloroformo y la habitual cristal violeta contaminante.
5. Recuperar la fase superior y repita este paso hasta fase inferior aparece completamente carente de cristal violeta.
6. Al final, la fase superior se recuperó y se diluyó en agua hasta una concentración final de 2% de verde de metilo. Esta solución madre es estable en la mesa de trabajo durante meses y no necesita ser protegido de la luz.

2. Fluorescente tinción nuclear de Whole embriones de pez cebra utilizando metil verde

1. Fijar los embriones durante la noche en 4% de formaldehído (de paraformaldehído) en tampón fosfato salino (PBS).
   NOTA: Esto puede tardar desde un par de horas para la noche, dependiendo del grosor de los embriones. En el ejemplo, hemos arreglado 48 horas después de la fecundación (HPF) embriones de pez cebra durante la noche.
2. Lavar los embriones tres veces en PBS-T (1% Triton X-100 en PBS) durante 5 min. La elevada concentración de detergente permeabiliza la cutícula.
3. Preparar una solución 1: 10.000 de verde de metilo (de 2% solución madre) en PBS-T: 5,000-1. La presencia de detergente durante la incubación es útil para muestras gruesas, tales como embriones de pez cebra y larvas.
4. Incubar los embriones en la solución durante al menos 6 horas a 4 ° C, con agitación suave. Una vez más, el espesor del embrión es el parámetro de calibración para la longitud de la incubación.
5. Lave los embriones 3 times con PBS durante 30 min para eliminar el exceso de detergente. Metil fluorescencia verde sólo es evidente cuando se une al ADN, por lo tanto, el fondo de la molécula no unida es insignificante.
6. Montar en una diapositiva excavado o una cámara casera con solución de montaje (75% de glicerol, 0,1 M Tris · HCl pH 8).
   NOTA: Si la tinción nuclear se va a realizar después de immunolabeling, verde de metilo se puede incorporar a la solución de montaje en la concentración de trabajo, sin necesidad de lavar a la basura.
7. Tienda refrigerada o iniciar imágenes inmediatamente. Realizar de imágenes con un confocal de barrido láser (u otro fluorescencia) microscopio con excitación a 633 nm y filtros de emisión establecidos para registrarse en 650-750 nm teniendo en cuenta que el metil emisión verde alcanza su máximo a 677 nm.
   NOTA: Proporcionamos los datos medidos del perfil de emisión verde de metilo, para ser cargados en el software de adquisición, como material complementario.

3. Fluorescente Nuclear StESP ACIO Plenario polluelo embriones utilizando metil verde

1. Incubar huevos de gallina fertilizados a la etapa de su interés. Fijar los embriones durante la noche en formaldehído al 4% (de paraformaldehído) en PBS a 4 ° C. Lave embriones 3 veces en PBS-T durante 2 horas.
2. Preparar una solución 1: 10.000 de verde de metilo (de 2% solución madre) en PBS-T: 5,000-1. Incubar los embriones en la solución de tinción durante la noche a 4 ° C. Lave los embriones 3 veces en PBS, 1 hora cada uno. Monte en la cámara con 75% de glicerol, 0,1 M Tris, pH 8.

4. Imaging marcados con fluorescencia Núcleos de embriones-enteros montada

1. Preparar una cámara de imágenes pegando varias capas de cinta aislante sobre un portaobjetos de microscopio y cuidadosamente cortar un agujero en él con un bisturí para colocar los embriones en su interior. Esto evitará que los embriones de aplastamiento durante la exploración.
2. Transferir cuidadosamente los embriones a la cámara de imagen y llenar la cámara a la cima con 75% de glicerol, Tris-HCl 0,1 M, pH = 8 a unla formación de burbujas vacío.
3. Cubrir con un # 0 cubreobjetos evitando o eliminando medio desbordante. Selle con esmalte de uñas.
4. Adquirir imágenes de la muestra en un microscopio de fluorescencia equipado con un filtro de excitación 633 o línea de láser.
   NOTA: Los filtros de emisión deben cubrir el máximo 677 emisión de verde de metilo.

Resultados

Tinción nuclear de muestras gruesas. El protocolo aquí descrito permite el logro de la tinción homogénea de estructuras profundas en embriones enteros. Lentes en desarrollo forman núcleos 48 HPF embriones de pez cebra son homogéneamente etiquetados (Figura 1).

Tinción de ADN verde de metilo permite la discriminación de diferencias morfológicas del ciclo celular dependientes tales como la identificación de figuras mitóticas o núcleos apoptóticos (Figura 2a). ...

Discusión

El progresivo desarrollo de las técnicas de microscopía en las últimas décadas, con especial atención a las variaciones de la microscopía fluorescente, ha llevado a la posibilidad de explorar la dinámica y estructura de muestras de tejido intactas, incluidos embriones enteros^10,11. Sin embargo, una limitación importante ha sido la disponibilidad de fluoróforos de buena calidad que se pueden usar para teñir directa y rápidamente las estructuras subcelulares.

Las tinciones de ADN flu...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
Verde de metilo	Dr. G. Grü bler		También probó Sigma-Aldrich 323829, que es un 158127
de microscopía confocal de barrido láser sin paraformaldehído sin cristales Sigma-Aldrich Leica TCS-SP5	Leica Microsystems
Isotiocianato de tetrametilrodamina B	Sigma-Aldrich	P1951
cloroformo	Sigma-Aldrich	372978
Centrífuga 5810 R	eppendorf	5811 000.010
portaobjetos para microscopio	Deltalab D100004
cubreobjetos	Esco optics	R525025