Presentamos un protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de bacteriófagos que infectan bacterias del género Arthrobacter. Este protocolo de enriquecimiento produce resultados rápidos y reproducibles para el aislamiento y amplificación de fagos de Arthrobacter a partir de aislados del suelo.
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Artículo de método
Una técnica de enriquecimiento optimizado para el aislamiento de
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Resumen
Resumen
El aislamiento de bacteriófagos a partir de muestras ambientales se ha realizado durante décadas utilizando los principios establecidos por los pioneros de la microbiología. El aislamiento de los fagos que infectan a los huéspedes de Arthrobacter ha sido limitado, tal vez debido a la baja tasa de éxito de muchas técnicas de aislamiento anteriores, lo que ha dado lugar a un grupo infrarrepresentado de fagos de Arthrobacter disponibles para su estudio. La técnica de enriquecimiento descrita aquí, a diferencia de muchas otras, utiliza un extracto filtrado libre de bacterias contaminantes como base para el crecimiento de la bacteria indicadora, Arthrobactersp. KY3901, específicamente. Al eliminar primero las bacterias del suelo, los fagos objetivo no se ven obstaculizados por la competencia con las bacterias nativas del suelo presentes en las muestras iniciales de suelo. Este método de enriquecimiento ha dado como resultado docenas de fagos únicos de varios tipos de suelo diferentes e incluso ha producido diferentes tipos de fagos a partir del mismo aislado de muestra de suelo enriquecido. El uso de este procedimiento puede ampliarse a la mayoría de los medios aeróbicos ricos en nutrientes para el aislamiento de fagos en una gran diversidad de bacterias huésped interesantes.
Introducción
La ubicuidad de las especies Arthrobacter en entornos de suelo ofrece un gran número y diversidad de fagos capaces de ser aislado a partir de esta especie de bacteria huésped. Miembros bacterianas de la familia Acintobacteriaceae son más notables por sus vías catabólicas de degradar compuestos recalcitrantes como la atrazina y varios otros pesticidas y herbicidas 1,2,3. Aunque la mayoría de investigaciones se ha hecho uso de cepas ambientales de Arthrobacter, aislados clínicos de este género se encuentran en la sangre, la orina, los ojos y muchas otras fuentes humanas que muestran toda la heterogeneidad filogenético 4.....
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Protocolo
1. Preparación de las células para el aislamiento de fagos Arthobacter
- Arthrobacter Cultura sp. KY3901 colonias estrías en una Luria Bertaini (LB) placa de agar se incubaron a 30 ° C durante 2-3 días. Escoja una colonia y utilizar un asa estéril para añadirlo a 250 ml de caldo LB en un matraz de cultivo desconcertado e incubar en una incubadora de agitación a 225 rpm a 30 ° C.
- Deje aproximadamente 24 h de crecimiento para obtener células en fase exponencial finales / temprana estacionarias para experimentos de infección del fago. Supervisar el estado de crecimiento bacteriano de cerca para evitar que las células entren ....
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Resultados
Para demostrar la reproducibilidad de la técnica de enriquecimiento mejorado para fagos Arthrobacter, se utilizaron 30 muestras de suelo diferentes en diferentes momentos y lugares durante la primavera y el verano de 2014. De estos 30 muestras de suelo fagos Arthrobacter únicas se obtuvieron a partir de 22 muestras de suelo recogidas mediante este enriquecimiento procedimiento. El procedimiento de enriquecimiento estándar produjo fagos únicos de 3 de las mismas muestras de suelo. Las muestras de enriqu.......
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Discusión
A pesar de muchos intentos anteriores para aislar fagos capaces de infectar ordenadores Arthrobacter, tuvimos poco éxito utilizando procedimientos de enriquecimiento estándar. El método generalizado de enriquecimiento bacteriana desarrollado y adaptado por van Twest y Kropinski 10 para enriquecer fagos a partir de muestras ambientales sigue siendo la base para la mayoría de procedimientos de enriquecimiento. La evidencia de estudios previos sugieren que los métodos de siembra directa han producido pl.......
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Divulgaciones
Autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Los fondos para el desarrollo de este protocolo fue proporcionada por el Consorcio Sureste de Pensilvania para la Educación Superior y el Departamento de Ciencias Cabrini Colegio. Financiamiento y apoyo adicional vino de Arcadia University y la Universidad Immaculata. Agradecemos especialmente a la doctora Karen Snetselaar en la Universidad de San José para tomar amablemente las imágenes de microscopía electrónica de nuestros fagos aislados. Apoyo adicional fue proporcionado por los cazadores del Instituto Médico Howard Hughes de la Alianza de Educación Científica de fagos que subieron Genómica y programa (SEA-FAGOS) Evolutiva Ciencia.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| LB Caldo en polvo | Fisher | BP9722-2 | Lo mejor es pedirlos a granel. |
| Agar granulado | Fisher | BP1423-2 | Lo mejor es pedirlos a granel. |
| Filtros de jeringa de 0,22 mmm | Fisher | 09-719A | |
| Filtros Buchner de 0,22 mmm | Fisher | 430320 | pueden obtener más de 50 ml de líquido cambiando cuidadosamente el tubo receptor. |
| Tubos Eppendorf | Fisher | 05-408-129 | |
| pipetas de 5 ml individuales | Fisher | 13-678-11D | |
| cónicos de 50 ml | Fisher | 76002844 | |
| tubos cónicos de 15 ml | Fisher | 76002845 | |
| 10 ml pipetas individuales | Fisher | 13-676-10J | |
| pipetas de 25 ml individuales | Fisher | 13-676-10K | |
| Papel de filtro cualitativo Whatman | Fisher | 1001-824 |
Referencias
- Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism. J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).
- Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C.
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Reimpresiones y permisos
