Seguimiento temporal de la progresión del ciclo celular El uso de citometría de flujo sin la necesidad de sincronización

Summary

Este protocolo describe el uso de bromodesoxiuridina (BrdU) para permitir la absorción de la seguimiento temporal de las células que estaban en fase S en un punto específico en el tiempo. La adición de colorantes de ADN y el etiquetado de anticuerpos facilita el análisis detallado del destino de las células en fase S en épocas posteriores.

Abstract

Este protocolo describe un método para permitir el seguimiento de las células a través del ciclo celular sin requerir que las células estén sincronizadas. Lograr la sincronización de celdas puede ser difícil para muchos sistemas de celdas. La práctica estándar es bloquear la progresión del ciclo celular en una etapa específica y luego liberar las células acumuladas, produciendo una ola de células que progresan a través del ciclo al unísono. Sin embargo, algunos tipos de células consideran que este bloqueo es tóxico, lo que provoca un ciclo celular anormal o incluso la muerte masiva. La absorción de bromodeoxiuridina (BrdU) se puede utilizar para rastrear la etapa del ciclo celular de células individuales. Las células incorporan este análogo sintético de la timidina, mientras sintetizan nuevo ADN durante la fase S. Al proporcionar BrdU durante un breve período, es posible marcar un grupo de células que estaban en fase S mientras el BrdU estaba presente. Estas células pueden ser rastreadas a través del resto del ciclo celular y en la siguiente ronda de replicación, lo que permite determinar la duración de las fases del ciclo celular sin la necesidad de inducir un bloqueo del ciclo celular potencialmente tóxico. También es posible determinar y correlacionar la expresión de proteínas internas y externas durante las etapas posteriores del ciclo celular. Estos se pueden utilizar para refinar aún más la asignación de la etapa del ciclo celular o evaluar los efectos sobre otras funciones celulares, como la activación de puntos de control o la muerte celular.

Introduction

La evaluación de las características del ciclo celular y los cambios que se producen en las células durante la progresión del ciclo celular es fundamental para la comprensión de muchos aspectos de la biología, en particular la biología del cáncer. Muchos agentes en desarrollo para el tratamiento de tumores malignos tienen efectos profundos sobre la progresión del ciclo celular o inducir la muerte celular a través del ciclo celular dependiente de mecanismos. Con el fin de estudiar la dinámica del ciclo celular o células en una fase particular del ciclo celular, es habitual para sincronizar las células. Sin embargo métodos de sincronización pueden tener efectos perjudi....

Protocol

El protocolo descrito aquí utiliza la línea celular de leucemia linfoblástica aguda NALM6 pero se puede aplicar a otros tipos de células.

1. Soluciones y Reactivos

1. RPMI completo
   1. Añadir 56 ml de suero de ternera fetal (FCS) y 5,5 ml de 200 mM de L-glutamina a una botella de 500 ml de medio RPMI-1640.
2. BrdU de la Solución
   1. Preparar 32,5 mM BrdU (10 mg / ml) en fosfato de Dulbecco Buffered Saline (DPBS).
3. BrdU completo RPMI
   1. Añadir 6,2 l de solución madre de BrdU a 10 ml de RPMI completo.
4. Solución DNasa
   1. Preparar 1 mg de DNasa / ml en DPBS. ....

Results

Esta metodología se puede utilizar para obtener una gama de información. Algunas aplicaciones se describen aquí.

Evaluación de la duración del ciclo celular

Para determinar el tiempo requerido para que las células tránsito a través del ciclo celular, las células se cosecharon a diversos puntos de tiempo tras el pulso de BrdU. Los intervalos entre las evaluaciones pueden ser adaptadas a las células particulares que se analiza. Líneas celulares hematopoyéticas se e.......

Discussion

La capacidad de analizar el ciclo celular es importante para la comprensión de la biología del cáncer y el mecanismo de acción de ambos fármacos y genes que influyen en la proliferación celular y el crecimiento. Mientras que hay una multitud de ensayos que miden la proliferación de células según se informa, la mayoría sólo proporciona una medida que indica las células número presente. Estos incluyen ensayos que miden el número de células por visualización directa y el recuento, la actividad metabólica o la concentración.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de flujo BrdU de APC	BD Biosciences	552598	Contiene anticuerpo BrdU, 7-AAD y BD Tampón Cytofix/Cytoperm (denominado tampón de fijación)
BD Cytoperm Tampón de permeabilización Plus	BD Biosciences	561651	denominado tampón de permeabilización
BD Perm/Wash BD	Biosciences	554723	denominado tampón de lavado
DNase	Sigma	D-4513
BD Falcon 12 x 75  mm Tubos FACS	BD Biosciences	352008
BD Pharmingen Tampón de manchas	BD Biosciences	554656
BD LSR Fortessa citómetro de flujo	BD Biosciences	FORTESSA
Pipetman	Gilson	P2, P20, P100, P1000
RPMI 1.640 c/o L-Gln 500 ml	Lonza	12-167F
DPBS	Lonza	17-512F
Suero Fetal Bovino	FisherBiotec	FBS-7100113
L-Glutamina	Sigma	G7513-100ML
5-Bromo-2′-deoxyuridina	Sigma	B5002-1G
Falcon TC 150  cm2 Matraces ventilados	BD Biosciences	355001
Pipetas 25  ml	Greiner	760180
Pipetas Aersol 200  y micro; l	Interpath	24700
Aersol Pipetas 1  ml	Interpath	24800
Centrífuga	Spintron	GT-175R
Incubadora 2	Binder	C 150
AF488 anti-histona H3 Phospho (Ser10)	Señalización celular	9708S
Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Señalización de células mAb de conejo		2197S
Phospho-Chk1 (Ser345) ( 133D3) Señalización de células mAb de conejo		2348S
NALM6	DSMZ	ACC-128