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DOI:

10.3791/52849

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12 de agosto de 2015

 ,  , 
1Institute of Biomembranes and Bioenergetics, National Research Council

En este artículo

Resumen

El silenciamiento génico por siRNA representa una estrategia experimental conveniente para analizar las funciones biológicas dependientes de BRCA2 con implicaciones inmediatas para comprender mejor la biología del cáncer. Se presenta un método para silenciar eficientemente BRCA2, junto con el procedimiento experimental para detectar y cuantificar cambios en la expresión de la proteína BRCA2 por inmunotransferencia en líneas celulares humanas.

Resumen

El silenciamiento de la proteína BRCA2 supresor de tumores y su detección por análisis bioquímicos convencionales representan un gran desafío técnico debido al gran tamaño de la proteína BRCA2 humano (aproximadamente 390 kDa). Se presenta modificaciones de transfección y inmunotransferencia protocolos estándar siRNA para silenciar BRCA2 humano y detectar la proteína BRCA2 endógeno, respectivamente, en las líneas de células epiteliales humanas. Los pasos clave incluyen una alta proporción de reactivo de transfección siRNA ay dos rondas posteriores de siRNA transfección dentro del mismo experimento. El uso de estas y otras modificaciones en el protocolo estándar logramos consistentemente más de 70% silenciamiento del gen BRCA2 humano a juzgar por el análisis de inmunotransferencia con anticuerpos anti-BRCA2. Además, la desnaturalización de los lisados ​​de células a 55 ° C en lugar de la convencional 70-100 ° C y otras optimizaciones técnicas del procedimiento de inmunotransferencia permite la detección de la proteína BRCA2 intacta incluso when muy bajas cantidades de material de partida están disponibles o cuando los niveles de expresión de proteínas BRCA2 son muy bajos. Silenciamiento eficiente de BRCA2 en las células humanas ofrece una valiosa estrategia para interrumpir la función de BRCA2 en células con BRCA2 intacto, incluyendo las células tumorales, para examinar nuevas vías moleculares y las funciones celulares que pueden ser afectados por mutaciones BRCA2 patógenos en los tumores. La adaptación de este protocolo para el silenciamiento y el análisis de otros "grandes" como proteínas BRCA2 eficiente debe ser fácilmente alcanzable.

Introducción

El gen BRCA2 (cáncer de mama susceptibilidad gen-2) codifica para una proteína supresora de tumores que juega un papel crucial en la reparación de ADN de doble filamento se rompe mediante la regulación de la función de la enzima recombinasa Rad51 1. BRCA2 también ha sido implicado en la modulación de la transcripción y en el control del ciclo celular 2. Mutaciones de la línea germinal en el gen BRCA2 inducen una susceptibilidad autosómica dominante a cáncer de mama y de ovario en mujeres y el cáncer de próstata en hombres, así como predisposición a otros tipos de cáncer 3,4. Sin embargo, a pesar del aumento en el riesgo de desarrollar cáncer, mutaciones BRCA2 que suprimen o reducen la función BRCA2 pueden hacer que las células cancerosas sean más vulnerables a los agentes quimioterapéuticos que causan daño en el ADN de 5-7. Cánceres esporádicos presentan una baja tasa de mutaciones BRCA2 (<3%) a pesar de los niveles reducidos de la proteína BRCA2 han sido detectados en algunos tipos de cáncer, lo que sugiere que la proteína BRCA2se puede perder durante la tumorigénesis en cánceres esporádicos a través de mecanismos no mutacional dependientes 7,8. Por lo tanto, es importante para entender completamente las funciones de BRCA2 en el contexto de la biología del cáncer, así como en otros entornos biológicos.

Una poderosa herramienta utilizada para identificar nuevas funciones de un gen en células de mamífero es silenciar su expresión. Como un ejemplo, silenciamiento de la expresión de BRCA2 en una variedad de células epiteliales normales ha conducido recientemente a la identificación de una nueva función de BRCA2 como regulador de la resistencia a la anoikis, un paso importante durante la adquisición de la capacidad invasiva de células de cáncer metastásico y 9. El silenciamiento génico puede conseguirse mediante la introducción en las células ya sea de interferencia (SI) de ARN pequeño o corto horquilla (sh) moléculas de ARN dirigidas a la gen específico. La alta potencia de siRNA y su facilidad de uso lo convierten en la herramienta preferente para silenciar a los experimentos encaminados a la obtención de nuevos conocimientos sobre los procesos biológicos críticos unnd para identificar nuevas dianas terapéuticas. Sin embargo, desmontables eficiente de la expresión génica puede no ser fácilmente alcanzable para todos los genes y puede ser muy variable dependiendo del tipo de célula. Debido a una disminución en los niveles de proteína intracelular es el fenotipo más relevante bajo investigación, es crucial para cuantificar el silenciamiento de genes por análisis de inmunotransferencia del producto del gen. Con este sentido, la proteína BRCA2 presenta otro desafío: ser una proteína grande (aproximadamente 390 kDa), existen dificultades técnicas para el análisis bioquímico convencional, incluyendo inmunotransferencia.

Presentamos aquí un protocolo optimizado para silenciamiento eficiente de BRCA2 en líneas de células epiteliales humanas y para la detección rápida y exitosa de la proteína BRCA2 desmontables por inmunotransferencia análisis.

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Protocolo

1. Preparar soluciones siRNA

  1. Resuspender 5 nmol de revueltos (Ctrl) y 5 nmol de BRCA2 siRNA gránulos secos en 100 l de RNasa libre de agua (concentración final de siRNA: 50 m). Este es el stock siRNA y debe ser almacenado a -20 ° C en 10 alícuotas.
  2. Tomar una alícuota de 10 l de la población de siRNA y añadir 40 l de RNasa libre de agua para obtener la solución de trabajo de 10 M siRNA. Esta dilución debe ser almacenado a -20 ° C hasta su uso.
    NOTA: La solución de trabajo siRNA no debe someterse a la congelación / descongelación de más de 3 veces.

2. Siembra del epiteliales humanas Líneas Celulares

  1. Retire el medio de crecimiento de las líneas celulares epiteliales humanas que crecen como monocapas de células en placas de cultivo de tejidos en un incubador humidificado a 37 ° C, 5% de CO 2.
  2. Lavar las células en la placa una vez con PBS (RT 10 ml de PBS para una placa de 100 mm).
  3. Para separar las células de la placa,añadir 2 ml de 0,25% de tripsina / EDTA 0,53 mM solución e incubar 3-5 min dependiendo del tipo de célula.
  4. Antes de recolectar las células desprendidas, neutralizar la tripsina mediante la adición de 2 ml de medio de crecimiento completo que contenía suero bovino fetal al 10%.
  5. Transferir las células a un tubo de 15 ml.
  6. Centrifugar las células a 320-330 xg durante 3 min a 4 ° C en un rotor de cubeta oscilante.
  7. Resuspender los sedimentos celulares en 5 ml de medio de antibióticos libres.
  8. Contar las células bajo el microscopio en una cámara de Burker o mediante el uso de un sistema de conteo automatizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  9. Semilla las células en placas de 6 pocillos a ser alrededor del 80% de confluencia después de 24 horas (0,5 a 1 x 10 6 células en 2 ml de medio para cada pocillo). El número de células óptimas que se sembró pueden variar dependiendo de las líneas celulares específicos y la tasa de crecimiento.
    NOTA: No agregue los antibióticos en el medio en este punto porque los antibióticos interfieren negativamente con la eficiencia de transfección. Es muy importante que las células están en pases de cultivo bajo (<10) para lograr una alta eficiencia de transfección de ARNsi BRCA2.

3. transfectar células con siRNA

  1. Veinticuatro horas después de la siembra de las células, proceder con la primera ronda de la transfección.
    1. Diluir 6 l de 10 siRNA transfección reactivo específico basado en lípidos en 130 l de medio de suero reducido.
    2. Diluir 3 l de 10 mM siRNA (30 pmol) en 130 l de medio de suero reducido.
    3. Combine el siRNA diluida con el reactivo de transfección se diluye y se incuba durante 5-10 minutos a temperatura ambiente.
    4. Durante la incubación, retirar el medio de las células y añadir 2 ml de medio fresco pre-calentado a 37 ° C (sin antibióticos).
    5. Añadir 250 l de los complejos de reactivo de transfección siRNA-a las células (esta cantidad es para un solo pocillo de una placa de 6 pocillos).
    6. Se incuban las células en un incubador humidificado a 3776; C con 5% de CO 2.
  2. Después de 24 horas, proceder a la segunda ronda de transfección repitiendo los pasos 3.1.1-3.1.5 con la siguiente modificación para el paso 3.1.2: diluir 5 l de 10 mM siRNA (50 pmol) en 130 l de medio de suero reducido.
    1. Se incuban las células durante 1-2 días a 37 ° C antes del análisis.
      NOTA: Dos rondas de transfecciones y uso de una relación de reactivos de alta siRNA / transfección en la segunda ronda son esenciales para conseguir una alta eficiencia de silenciamiento BRCA2.

4. lisar células para el análisis de inmunotransferencia

  1. Preparar tampón de lisis fresco con PBS (pH 7,4) que contiene 1% de la no iónico, no desnaturalizante octilfenoxipolietoxietanol detergente, pirofosfato de sodio 5 mM, ortovanadato de sodio 1 mM, fluoruro de sodio 10 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 2 mM, 10 mg / ml de leupeptina, 10 g / ml de aprotinina. Guárdelo en hielo.
  2. Retire el medio de las células y wcenizas ellos una vez con PBS frío (2 ml / pocillo) en la placa. Para evitar cualquier arrastre PBS, retire completamente de la placa.
  3. Añadir 200 l de tampón de lisis a cada pocillo.
    NOTA: Si las células tienen que ser utilizados también para otros ensayos, trypsinize las células como se describe en el paso 2.1 a 2.6 y resuspender las células en tampón apropiado / medio de acuerdo a la aplicación a utilizar.
  4. Girar suavemente la placa para distribuir uniformemente el tampón de lisis y se incuba durante 15 min a 4 ° C en un rotador.
  5. Recoger el lisado celular en un tubo de microcentrífuga en hielo utilizando un rascador de células.
  6. Centrifugar a 17900 xg durante 25 min a 4 ° C y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo.
  7. Medir la concentración de proteína usando un ensayo de proteína disponible comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Análisis de inmunotransferencia 5. BRCA2

  1. Preparar el tampón de desarrollo diluyendo 50 ml de 20x Tris-Acetato SDS corriendo bUffer (Tricina 50 mM, 50 mM Tris Base, 0,1% SDS, pH 8,24) con 950 ml de agua destilada.
  2. Preparar la muestra como sigue: añadir 15 g de lisado celular total, 5 l de tampón de muestra 4x que contienen dodecil sulfato de litio a pH 8,4, 2 l de 10x muestra de agente reductor (0.5 M DTT), y tampón de lisis hasta un volumen final de 20 l.
    NOTA: Este protocolo permite la detección de BRCA2 en líneas de células normales también cuando se utiliza una menor cantidad de proteínas totales (hasta 5 g).
  3. Desnaturalizar las muestras a 55 ° C durante 10 min.
    NOTA: Es fundamental utilizar 55 ° C. Dado que la proteína BRCA2 es termosensible 11, las temperaturas de desnaturalización más altos dan lugar a la pérdida constante de larga duración intacta (390 kDa) proteína BRCA2.
  4. Configurar la cámara electroforética de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  5. Cargar las muestras y 10 l de alto peso molecular pre-manchado estándar de la proteína en un gel prefabricado (Tris-acetato 3-8%) y funcionar a 120 V para abcabo de 2 h 12. Detener la ejecución de electroforesis antes del 55 kDa marcador azul deja el gel prefabricado.
  6. Preparar el tampón de transferencia con 50 ml de tampón de transferencia de 20x, 100 ml de 100% de metanol y 850 ml de agua.
  7. Activar membrana de PVDF (0,45 micras de tamaño de poro) por inmersión en metanol al 100% durante 5 minutos, enjuague con agua destilada y se equilibre en tampón de transferencia al menos durante 5 minutos. Remojar las esponjas del aparato de transferencia en tampón de transferencia a 4 ° C hasta su uso.
  8. Cuando la corrida electroforética es más, armar el sándwich en la pila de la transferencia en el siguiente orden (de abajo arriba): tres esponjas saturadas en tampón de transferencia, una hoja de papel de grado 3MM saturado en tampón de transferencia, el gel, membrana de PVDF se activa, uno 3MM hoja de papel de grado saturado en tampón de transferencia, tres esponjas saturado en tampón de transferencia 13,14. Coloque la pila en las proteínas de aparatos y de transferencia a 350 mA durante 4 horas a 4 ° C oa 180 mA durante la noche a 4 ° C.
    NOTA: Ser BRCA2 una proteína muy grande, es crucial para extender el tiempo de transferencia de 1 hr (como se sugiere por el fabricante y la mayoría de los protocolos de transferencia) a 4 hr o durante la noche para asegurar la transferencia completa de proteínas de alto peso molecular. Además, debido al tiempo de transferencia de largo, es esencial para realizar la transferencia en una habitación fría a 4 ° C para minimizar el sobrecalentamiento y facilitar el desmontaje sandwich. Sistemas de transferencia semi-secos no son buenas para la transferencia de las proteínas de gran tamaño.
  9. Después de la transferencia, lavar la membrana con TBS, bloquearlo durante 1 hora a RT en TBS-Tween 0,25% (TBS-T) que contiene leche en polvo desnatada al 5% y la sonda durante la noche a 4 ° C con anticuerpo policlonal de conejo anti-l 30 BRCA2 ( 200 g / ml), se diluyó en 9 ml de TBS-T + 5% leche en polvo desnatada [1: 300 (v / v) de dilución].
  10. Se lava la membrana tres veces (10 min cada una) con TBS-T, entonces incubar el filtro durante 1 hora con 1 l de rábano picante conjugada con peroxidasa anti-conejo anticuerpo secundario diluido en 10 ml de TBS-T + 5% leche en polvo desnatada. A partir de entonces, lavar la membrana tres veces (10 min cada uno) con TBS-T.
  11. Realizar inmunodetección por ECL para revelar proteína BRCA2 mediante un aumento de quimioluminiscencia (ECL) Western Blot reactivo de detección, siguiendo las instrucciones del fabricante. Visualizar bandas immunochemiluminescent en alta resolución de películas ECL.
  12. Realizar la inmunodetección con un anticuerpo para un gen de mantenimiento, como β-tubulina (55 kDa), en el mismo filtro como control de carga mediante el uso de un anticuerpo monoclonal para β-tubulina diluido a 1: 1000 (10 l de anticuerpo anti-tubulina en 10 ml TBS-T + 5% de leche seca no grasa) durante 1 hora a RT. Lavar y se incuba el anticuerpo secundario como se describe para BRCA2 (5.10 a 5.11), excepto para el uso de rábano picante conjugado con peroxidasa anti-ratón en lugar de anti-anticuerpo secundario de conejo.
  13. Adquirir una imagen digital de las películas impresionadas con bandas immunochemiluminescent y analizar la intensidad de la banda de imagen dedicada software de análisis (por ejemplo,., ImageJ).

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Resultados

Antes de proceder con un ensayo biológico / bioquímica para examinar el efecto de silenciamiento BRCA2 en las funciones celulares, el primer paso es para confirmar la especificidad de la silenciamiento mediante el uso de un siRNA revueltos (no la orientación siRNA) lado a lado con BRCA2 siRNA (Figura 1A ). Es importante llevar a cabo una segunda ronda de siRNA transfección con una alta relación de siRNA / transfección para conseguir una alta eficiencia del silenciamiento BRCA2. De hech...

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Discusión

Debido a que las mutaciones en la línea germinal del gen BRCA2 plomo a un mayor riesgo de varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer femenino y masculino de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, y el melanoma 3,4, una serie de estudios se han realizado para entender la función biológica de la proteína BRCA2. La mayoría de estos estudios son principalmente basados ​​en genética debido a dificultades técnicas en el análisis de una proteína gigante como BRCA2. El método descr...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones FIRB-Merit RBNE08YFN3_005 y RBNE08HWLZ_012, y el Ministerio de Economía y Finanzas italiano al CNR para el proyecto "FaReBio di Qualità".

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BRCA2 siRNADharmaconL-003462-00SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA
Ctrl siRNADharmacon  D-001810-10-05ON-TARGETplus
Reactivo de ARNiMAX de lipofectamina de grupo no objetivo Life Technologies13778075Reactivo de transfección
OPTI-MEM I Reduced Serum MediumLife Technologies31985-070Medio para el procedimiento de transfección
NuPAGE Tris-Acetato 3-8% 1,5 mm Gel prefabricadoLife TechnologiesEA0378Gel para electroforesis de proteínas
NuPAGE LDS Búfer de muestra Life TechnologiesNP0007Reactivo para electroforesis de proteínas
NuPAGE Agente reductor de muestras (10x)Life TechnologiesNP0004Reactivo para electroforesis de proteínas
NuPAGE AntioxidanteLife TechnologiesNP0005Reactivo para electroforesis de proteínas
HiMark Estándar de proteínas preteñidoLife TechnologiesLC5699Marcador preteñido para gel electroforesis
XCell SureLoc Mini-Cell  SystemLife TechnologiesEI0002Equipo para electroforesis/transferencia de proteínas
NuPAGE Tris-Acetato SDS Running BufferLife TechnologiesLA0041Reactivo para Western blot
Membrana de PVDFMilliporeIPVH00010Reactivo para Western blot
NuPAGE TransferBuffer Life TechnologiesNP0006-1Reactivo para Western blot
BRCA2 H-300 anticuerpo policlonal conejoSanta Cruz Biotechnologysc-8326dilución 1:300
Anticuerpo monoclonal beta-tubulinaSigma AldrichT4026-100ULdilución 1:1.000
Leche desnatada en polvoSigma Aldrich70166Reactivo para Western blot
Tween-20Sigma AldrichP1379Reactivo para Western blot
SuperSignal West Pico/Femto Sustrato quimioluminiscentePierce Thermo Scientific34080/34096Sistema de quimioluminiscencia
Células PNT1ASIGMA Aldrich (para ECACC)95012614PNT1A epitelio prostático humano normal inmortalizado con células SV40
NthySIGMA Aldrich (para ECACC)90011609Línea celular Nthy-ori 3-1 Células epiteliales foliculares humanas, tiroideas
Proliferación celular Kit I (MTT)Roche11465007001Kit para ensayos de proliferación celular

Referencias

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Silenciamiento de BRCA2transfecci n de siRNAWestern blotdetecci n de prote naspreparaci n de lisado celularprote nas de alto peso molecularan lisis de supresores tumoraleseficiencia del knockdown g nicooptimizaci n del inmunoblotrelaci n de transfecci n de siRNA

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