El silenciamiento génico por siRNA representa una estrategia experimental conveniente para analizar las funciones biológicas dependientes de BRCA2 con implicaciones inmediatas para comprender mejor la biología del cáncer. Se presenta un método para silenciar eficientemente BRCA2, junto con el procedimiento experimental para detectar y cuantificar cambios en la expresión de la proteína BRCA2 por inmunotransferencia en líneas celulares humanas.
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Resumen
Resumen
El silenciamiento de la proteína BRCA2 supresor de tumores y su detección por análisis bioquímicos convencionales representan un gran desafío técnico debido al gran tamaño de la proteína BRCA2 humano (aproximadamente 390 kDa). Se presenta modificaciones de transfección y inmunotransferencia protocolos estándar siRNA para silenciar BRCA2 humano y detectar la proteína BRCA2 endógeno, respectivamente, en las líneas de células epiteliales humanas. Los pasos clave incluyen una alta proporción de reactivo de transfección siRNA ay dos rondas posteriores de siRNA transfección dentro del mismo experimento. El uso de estas y otras modificaciones en el protocolo estándar logramos consistentemente más de 70% silenciamiento del gen BRCA2 humano a juzgar por el análisis de inmunotransferencia con anticuerpos anti-BRCA2. Además, la desnaturalización de los lisados de células a 55 ° C en lugar de la convencional 70-100 ° C y otras optimizaciones técnicas del procedimiento de inmunotransferencia permite la detección de la proteína BRCA2 intacta incluso when muy bajas cantidades de material de partida están disponibles o cuando los niveles de expresión de proteínas BRCA2 son muy bajos. Silenciamiento eficiente de BRCA2 en las células humanas ofrece una valiosa estrategia para interrumpir la función de BRCA2 en células con BRCA2 intacto, incluyendo las células tumorales, para examinar nuevas vías moleculares y las funciones celulares que pueden ser afectados por mutaciones BRCA2 patógenos en los tumores. La adaptación de este protocolo para el silenciamiento y el análisis de otros "grandes" como proteínas BRCA2 eficiente debe ser fácilmente alcanzable.
Introducción
El gen BRCA2 (cáncer de mama susceptibilidad gen-2) codifica para una proteína supresora de tumores que juega un papel crucial en la reparación de ADN de doble filamento se rompe mediante la regulación de la función de la enzima recombinasa Rad51 1. BRCA2 también ha sido implicado en la modulación de la transcripción y en el control del ciclo celular 2. Mutaciones de la línea germinal en el gen BRCA2 inducen una susceptibilidad autosómica dominante a cáncer de mama y de ovario en mujeres y el cáncer de próstata en hombres, así como predisposición a otros tipos de cáncer 3,4. Sin embargo, a pesar del aumento en el rie....
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Protocolo
1. Preparar soluciones siRNA
- Resuspender 5 nmol de revueltos (Ctrl) y 5 nmol de BRCA2 siRNA gránulos secos en 100 l de RNasa libre de agua (concentración final de siRNA: 50 m). Este es el stock siRNA y debe ser almacenado a -20 ° C en 10 alícuotas.
- Tomar una alícuota de 10 l de la población de siRNA y añadir 40 l de RNasa libre de agua para obtener la solución de trabajo de 10 M siRNA. Esta dilución debe ser almacenado a -20 ° C hasta su uso.
NOTA: La solución de trabajo siRNA no debe someterse a la congelación / descongelación de más de 3 veces.
2. Siembra del epiteliales humanas Líneas Celulares ....
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Resultados
Antes de proceder con un ensayo biológico / bioquímica para examinar el efecto de silenciamiento BRCA2 en las funciones celulares, el primer paso es para confirmar la especificidad de la silenciamiento mediante el uso de un siRNA revueltos (no la orientación siRNA) lado a lado con BRCA2 siRNA (Figura 1A ). Es importante llevar a cabo una segunda ronda de siRNA transfección con una alta relación de siRNA / transfección para conseguir una alta eficiencia del silenciamiento BRCA2. De hech.......
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Discusión
Debido a que las mutaciones en la línea germinal del gen BRCA2 plomo a un mayor riesgo de varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer femenino y masculino de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, y el melanoma 3,4, una serie de estudios se han realizado para entender la función biológica de la proteína BRCA2. La mayoría de estos estudios son principalmente basados en genética debido a dificultades técnicas en el análisis de una proteína gigante como BRCA2. El método descr.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones FIRB-Merit RBNE08YFN3_005 y RBNE08HWLZ_012, y el Ministerio de Economía y Finanzas italiano al CNR para el proyecto "FaReBio di Qualità".
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| BRCA2 siRNA | Dharmacon | L-003462-00 | SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA |
| Ctrl siRNA | Dharmacon | D-001810-10-05 | ON-TARGETplus |
| Reactivo de ARNiMAX de lipofectamina de grupo no objetivo | Life Technologies | 13778075 | Reactivo de transfección |
| OPTI-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | Medio para el procedimiento de transfección |
| NuPAGE Tris-Acetato 3-8% 1,5 mm Gel prefabricado | Life Technologies | EA0378 | Gel para electroforesis de proteínas |
| NuPAGE LDS Búfer de muestra | Life Technologies | NP0007 | Reactivo para electroforesis de proteínas |
| NuPAGE Agente reductor de muestras (10x) | Life Technologies | NP0004 | Reactivo para electroforesis de proteínas |
| NuPAGE Antioxidante | Life Technologies | NP0005 | Reactivo para electroforesis de proteínas |
| HiMark Estándar de proteínas preteñido | Life Technologies | LC5699 | Marcador preteñido para gel electroforesis |
| XCell SureLoc Mini-Cell System | Life Technologies | EI0002 | Equipo para electroforesis/transferencia de proteínas |
| NuPAGE Tris-Acetato SDS Running Buffer | Life Technologies | LA0041 | Reactivo para Western blot |
| Membrana de PVDF | Millipore | IPVH00010 | Reactivo para Western blot |
| NuPAGE Transfer | Buffer Life Technologies | NP0006-1 | Reactivo para Western blot |
| BRCA2 H-300 anticuerpo policlonal conejo | Santa Cruz Biotechnology | sc-8326 | dilución 1:300 |
| Anticuerpo monoclonal beta-tubulina | Sigma Aldrich | T4026-100UL | dilución 1:1.000 |
| Leche desnatada en polvo | Sigma Aldrich | 70166 | Reactivo para Western blot |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | Reactivo para Western blot |
| SuperSignal West Pico/Femto Sustrato quimioluminiscente | Pierce Thermo Scientific | 34080/34096 | Sistema de quimioluminiscencia |
| Células PNT1A | SIGMA Aldrich (para ECACC) | 95012614 | PNT1A epitelio prostático humano normal inmortalizado con células SV40 |
| Nthy | SIGMA Aldrich (para ECACC) | 90011609 | Línea celular Nthy-ori 3-1 Células epiteliales foliculares humanas, tiroideas |
| Proliferación celular Kit I (MTT) | Roche | 11465007001 | Kit para ensayos de proliferación celular |
Referencias
- Thorslund, T., West, S. C. BRCA2: a universal recombinase regulator. Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).
- Yoshida, K., Miki, Y. Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage. Cancer Sci. 95<....
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Reimpresiones y permisos
