Silencios de BRCA2 Para identificar las funciones biológicas novedosas BRCA2 reguladas en células humanas cultivadas

Summary

El silenciamiento génico por siRNA representa una estrategia experimental conveniente para analizar las funciones biológicas dependientes de BRCA2 con implicaciones inmediatas para comprender mejor la biología del cáncer. Se presenta un método para silenciar eficientemente BRCA2, junto con el procedimiento experimental para detectar y cuantificar cambios en la expresión de la proteína BRCA2 por inmunotransferencia en líneas celulares humanas.

Abstract

El silenciamiento de la proteína BRCA2 supresor de tumores y su detección por análisis bioquímicos convencionales representan un gran desafío técnico debido al gran tamaño de la proteína BRCA2 humano (aproximadamente 390 kDa). Se presenta modificaciones de transfección y inmunotransferencia protocolos estándar siRNA para silenciar BRCA2 humano y detectar la proteína BRCA2 endógeno, respectivamente, en las líneas de células epiteliales humanas. Los pasos clave incluyen una alta proporción de reactivo de transfección siRNA ay dos rondas posteriores de siRNA transfección dentro del mismo experimento. El uso de estas y otras modificaciones en el protocolo estándar logramos consistentemente más de 70% silenciamiento del gen BRCA2 humano a juzgar por el análisis de inmunotransferencia con anticuerpos anti-BRCA2. Además, la desnaturalización de los lisados ​​de células a 55 ° C en lugar de la convencional 70-100 ° C y otras optimizaciones técnicas del procedimiento de inmunotransferencia permite la detección de la proteína BRCA2 intacta incluso when muy bajas cantidades de material de partida están disponibles o cuando los niveles de expresión de proteínas BRCA2 son muy bajos. Silenciamiento eficiente de BRCA2 en las células humanas ofrece una valiosa estrategia para interrumpir la función de BRCA2 en células con BRCA2 intacto, incluyendo las células tumorales, para examinar nuevas vías moleculares y las funciones celulares que pueden ser afectados por mutaciones BRCA2 patógenos en los tumores. La adaptación de este protocolo para el silenciamiento y el análisis de otros "grandes" como proteínas BRCA2 eficiente debe ser fácilmente alcanzable.

Introduction

El gen BRCA2 (cáncer de mama susceptibilidad gen-2) codifica para una proteína supresora de tumores que juega un papel crucial en la reparación de ADN de doble filamento se rompe mediante la regulación de la función de la enzima recombinasa Rad51 ^1. BRCA2 también ha sido implicado en la modulación de la transcripción y en el control del ciclo celular ^2. Mutaciones de la línea germinal en el gen BRCA2 inducen una susceptibilidad autosómica dominante a cáncer de mama y de ovario en mujeres y el cáncer de próstata en hombres, así como predisposición a otros tipos de cáncer ^3,4. Sin embargo, a pesar del aumento en el rie....

Protocol

1. Preparar soluciones siRNA

1. Resuspender 5 nmol de revueltos (Ctrl) y 5 nmol de BRCA2 siRNA gránulos secos en 100 l de RNasa libre de agua (concentración final de siRNA: 50 m). Este es el stock siRNA y debe ser almacenado a -20 ° C en 10 alícuotas.
2. Tomar una alícuota de 10 l de la población de siRNA y añadir 40 l de RNasa libre de agua para obtener la solución de trabajo de 10 M siRNA. Esta dilución debe ser almacenado a -20 ° C hasta su uso.
   NOTA: La solución de trabajo siRNA no debe someterse a la congelación / descongelación de más de 3 veces.

2. Siembra del epiteliales humanas Líneas Celulares ....

Results

Antes de proceder con un ensayo biológico / bioquímica para examinar el efecto de silenciamiento BRCA2 en las funciones celulares, el primer paso es para confirmar la especificidad de la silenciamiento mediante el uso de un siRNA revueltos (no la orientación siRNA) lado a lado con BRCA2 siRNA (Figura 1A ). Es importante llevar a cabo una segunda ronda de siRNA transfección con una alta relación de siRNA / transfección para conseguir una alta eficiencia del silenciamiento BRCA2. De hech.......

Discussion

Debido a que las mutaciones en la línea germinal del gen BRCA2 plomo a un mayor riesgo de varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer femenino y masculino de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, y el melanoma ^3,4, una serie de estudios se han realizado para entender la función biológica de la proteína BRCA2. La mayoría de estos estudios son principalmente basados ​​en genética debido a dificultades técnicas en el análisis de una proteína gigante como BRCA2. El método descr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BRCA2 siRNA	Dharmacon	L-003462-00	SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA
Ctrl siRNA	Dharmacon	D-001810-10-05	ON-TARGETplus
Reactivo de ARNiMAX de lipofectamina de grupo no objetivo	Life Technologies	13778075	Reactivo de transfección
OPTI-MEM I Reduced Serum Medium	Life Technologies	31985-070	Medio para el procedimiento de transfección
NuPAGE Tris-Acetato 3-8% 1,5 mm Gel prefabricado	Life Technologies	EA0378	Gel para electroforesis de proteínas
NuPAGE LDS Búfer de muestra	Life Technologies	NP0007	Reactivo para electroforesis de proteínas
NuPAGE Agente reductor de muestras (10x)	Life Technologies	NP0004	Reactivo para electroforesis de proteínas
NuPAGE Antioxidante	Life Technologies	NP0005	Reactivo para electroforesis de proteínas
HiMark Estándar de proteínas preteñido	Life Technologies	LC5699	Marcador preteñido para gel electroforesis
XCell SureLoc Mini-Cell  System	Life Technologies	EI0002	Equipo para electroforesis/transferencia de proteínas
NuPAGE Tris-Acetato SDS Running Buffer	Life Technologies	LA0041	Reactivo para Western blot
Membrana de PVDF	Millipore	IPVH00010	Reactivo para Western blot
NuPAGE Transfer	Buffer Life Technologies	NP0006-1	Reactivo para Western blot
BRCA2 H-300 anticuerpo policlonal conejo	Santa Cruz Biotechnology	sc-8326	dilución 1:300
Anticuerpo monoclonal beta-tubulina	Sigma Aldrich	T4026-100UL	dilución 1:1.000
Leche desnatada en polvo	Sigma Aldrich	70166	Reactivo para Western blot
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379	Reactivo para Western blot
SuperSignal West Pico/Femto Sustrato quimioluminiscente	Pierce Thermo Scientific	34080/34096	Sistema de quimioluminiscencia
Células PNT1A	SIGMA Aldrich (para ECACC)	95012614	PNT1A epitelio prostático humano normal inmortalizado con células SV40
Nthy	SIGMA Aldrich (para ECACC)	90011609	Línea celular Nthy-ori 3-1 Células epiteliales foliculares humanas, tiroideas
Proliferación celular Kit I (MTT)	Roche	11465007001	Kit para ensayos de proliferación celular