Artículo de método

Simultáneo Ex vivo Pruebas funcionales de dos retinas por In vivo Sistema Electrorretinograma

DOI:

10.3791/52855

⸱

6 de mayo de 2015

 , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Washington University in St. Louis

En este artículo

Resumen

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Ex vivo ERG se puede utilizar para registrar la actividad eléctrica de las células de la retina directamente a partir de retinas intactas aisladas de animales o humanos. Demostramos aquí cómo los sistemas ERG in vivo comunes se pueden adaptar para registros ERG ex vivo con el fin de diseccionar la actividad eléctrica de las células de la retina.

Resumen

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Una señal de electrorretinograma (ERG) in vivo se compone de varios componentes superpuestos que se originan en diferentes tipos de células de la retina, así como de ruido de fuentes extrarretinianas. Ex vivo El ERG proporciona un método eficaz para diseccionar la función de las células de la retina directamente a partir de una retina aislada intacta de animales o de los ojos de un donante. Además, el ERG ex vivo puede utilizarse para probar la eficacia y la seguridad de posibles agentes terapéuticos en el tejido de la retina procedente de animales o humanos. Aquí mostramos cómo se pueden utilizar los sistemas ERG in vivo disponibles en el mercado para realizar registros ERG ex vivo a partir de retinas de ratón aisladas. Combinamos las unidades de estimulación lumínica, electrónica y de calefacción de un sistema in vivo estándar con soporte de muestras diseñado a medida, sistema de perfusión controlado por gravedad y blindaje contra ruido electromagnético para registrar señales ERG ex vivo de bajo ruido simultáneamente desde dos retinas con el software de adquisición incluido en el software comercial in vivo Sistemas. Además, demostramos cómo utilizar este método en combinación con tratamientos farmacológicos que eliminan componentes específicos de ERG con el fin de diseccionar la función de ciertos tipos de células de la retina.

Introducción

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Electrorretinograma (ERG) es una técnica bien establecida que puede utilizarse para registrar la actividad eléctrica de la retina provocado por la luz. La señal de ERG se genera principalmente por cambios de voltaje causadas por las corrientes radiales (a lo largo del eje de los fotorreceptores y células bipolares) que fluye en el espacio extracelular resistiva de la retina. La primera señal de ERG fue grabado en 1865 por Holmgren desde la superficie de un ojo de pez 1. Einthoven y Jolly 1908 2 dividen la respuesta ERG a la aparición de la luz en tres ondas diferentes, llamado a-, b-, y c-ondas, que ahora se conoce para reflejar principalmente la actividad de los fotorreceptores, células bipolares EN, y el epitelio de pigmento células, respectivamente 3-8. ERG se puede grabar desde los ojos de animales o humanos (in vivo) anestesiados, desde aislada preparación ojo 9, a través de la retina intacta aislada (ex vivo) 3,10-15 oa través de las capas de la retina específicas con microelectrodos (localERG) 4,16. De estos, in vivo ERG es actualmente el método más utilizado para evaluar la función de la retina. Es una técnica no invasiva que se puede utilizar con fines de diagnóstico o para seguir la progresión de enfermedades de la retina en animales o pacientes. Sin embargo, en vivo grabaciones ERG producen una señal compleja con varios componentes superpuestos, a menudo contaminados por el ruido extraoculares fisiológico (por ejemplo, la respiración y la actividad cardíaca).

ERG local se puede utilizar para grabar la señal a través de capas específicas de la retina, pero es el más invasivo y tiene la relación más baja de señal a ruido (SNR) en comparación con las otras configuraciones de grabación de ERG. ERG local también es técnicamente exigente y requiere equipos costosos (por ejemplo, microscopio y micromanipuladores). Transretinal ERG de la intacto, aislado retina (ex vivo ERG) ofrece un compromiso entre in vivo y métodos locales ERG permitiendo estable y higgrabaciones h SNR de retinas intactas de animales o seres humanos 17. Recientemente, este método ha sido utilizado con éxito para estudiar varilla y fotorreceptor cono función en retinas de mamíferos, primates y humanos 18-20. Además, debido a la ausencia de epitelio pigmentario de la retina ex vivo, se retira el componente de la onda c positivo de la señal de ERG y un componente prominente PIII lento negativo se revela en las grabaciones ex vivo. El componente lento PIII se ha demostrado que proceden de la actividad de las células gliales de Müller en la retina 21-23. Por lo tanto, ex vivo ERG método también podría ser usado para estudiar las células de Müller en la retina intacta. Varios estudios también han demostrado que los ex vivo grabaciones ERG se podrían utilizar para medir la concentración de agentes farmacológicos alrededor de la retina 24 y probar la seguridad y eficacia de los fármacos 25-27.

Comercial múltiple en sistemas in vivo están disponibles yutilizado en muchos laboratorios que no necesariamente tienen amplia experiencia electrofisiología. En contraste, los dispositivos ex vivo no han estado disponibles hasta hace poco 17 y como resultado sólo muy pocos laboratorios están tomando actualmente ventaja de esta técnica de gran alcance. Sería beneficioso para hacer grabaciones ex vivo ERG a disposición de más laboratorios con el fin de avanzar en nuestro conocimiento sobre la fisiología de la retina y la patología, y desarrollar nuevas terapias para enfermedades que causan ceguera. Se demuestra aquí una sencilla y asequible dispositivo ex vivo ERG 17 y mostrar cómo se puede utilizar en combinación con varios sistemas vivo ERG disponibles en el mercado para grabar en la señalización de varilla y el cono mediada (a- y b-ondas) y la función de las células de Müller (lento PIII) desde intactas las retinas de ratones de tipo salvaje.

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Protocolo

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Todos los protocolos experimentales fueron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por la Comisión de Estudios de Animales institucional de la Universidad de Washington.

1. Configuración de la perfusión y de muestras

  1. Preparar la solución para perfusión retina fresco en el día del experimento. Utilice agua destilada y desionizada. Utilice una de las tres soluciones siguientes.
    1. Prepare Bicarbonato que contiene "solución (1 L): 1 botella de Ames Ames medios de comunicación y 1,9 g de NaHCO 3,
    2. Preparar la solución de Locke (en mM): 112,5 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl 2, 1,2 CaCl 2, 10,0 HEPES, 20,0 NaHCO 3, 3,0 Na succinato, 0,5 Na glutamato, 0,02 EDTA, y 10,0 glucosa, 0,1% de vitaminas MEM y amino ácidos
    3. Solución de Ringer tamponada con HEPES Preparar (en mM): NaCl 133,3, KCl 3,3, 2,0 MgCl2, 1,0 CaCl 2, 10,0 glucosa, 0,01 EDTA, 12,0 HEPES, pHajustado a 7,5 con ~ 5,8 ml de NaOH 1 M, añadir 0,72 g / L de medio de cultivo Leibovitz L-15. Utilice 20 - 50 M DL-AP4 y 50 - 100 mM BaCl 2 para aislar la respuesta de los fotorreceptores con cualquier medio de perfusión.
  2. Preparar la solución para los electrodos 28 (en mM): NaCl 140,0, KCl 3,6, 2,4 MgCl2, 1,2 CaCl 2, 3, HEPES 0,01 EDTA y ajustar el pH a 7.4 a 7.5 con NaOH. Solución de electrodo se puede almacenar a temperatura ambiente durante varios meses.
  3. Preparar y poner a prueba el soporte de la muestra.
    1. Pegue el papel de filtro negro / gris en la parte superior de las cúpulas de la parte inferior del soporte de la muestra (ver Figura 1 A). Spread de dos componentes 5 min pegamento epoxi cuidadosamente alrededor de los bordes de las tapas planas de las cúpulas. Si es necesario, hacerlo bajo microscopio de disección.
    2. Espere hasta que el pegamento es casi seco (unos 4 minutos) y pulse el papel de filtro en las cúpulas utilizando un elemento plano. Papel de filtro pegamento al menos un día antes del experimento. Lospapel de filtro se puede utilizar varias veces, pero debe ser reemplazado después de un mes de grabaciones. Utilice etanol al 70% para limpiar cuidadosamente las cúpulas de cualquier residuo de pegamento antes de instalar el papel de sustitución.
    3. Llenar los canales de electrodos con una solución de electrodo tratando de evitar las burbujas de aire y el tornillo electrodos de pellets cerrados con un adaptador roscado en los canales de los electrodos (ver figuras 1A y B). Conecte las piezas superior e inferior del soporte de la muestra con cuatro tornillos y llenar las líneas de perfusión con solución de electrodo.
    4. Medir la resistencia y la tensión entre los conductores de cada par de electrodos con un multímetro (Figura 1B). La resistencia debe ser inferior a 100 Ωk y la tensión por debajo de 10 mV si los canales son sin burbujas y los electrodos están en buenas condiciones.
  4. Verter 400 a 700 ml de medio de perfusión en la botella de vidrio. Separar otros 300 ml a utilizar en la disección de las retinas y sla rompió en una nevera. Ajuste el tubo de perfusión en el bloque intercambiador de calor y coloque el bloque precalentado en la placa de calefacción (ver Figura 1D).
  5. Incluya la botella con una tapa que tiene conexiones a CO 2 / O 2 gas (si se utiliza de Ames o Locke) y para la tubería de perfusión (ver Figura 1D). Precaliente la botella con los medios de comunicación a 37 o C y colocarlo en la placa de calentamiento o en la parte superior de la unidad de estimulación de la luz en el baño de agua a 37-39 ° C 17.
    1. Primer de las líneas de perfusión llenándolos de medios de perfusión para iniciar el flujo por gravedad.
      1. En el sistema de LKC, colocar la botella en la parte superior de la unidad estimuladora 17 para proporcionar un flujo gravitacional significativo que se ajusta entonces por los reguladores de caudal sin ser afectado por el nivel de reducción de la solución de perfusión en la botella durante el experimento.
      2. En el sistema Ocuscience, coloque el perfusion botella dentro de la jaula de Faraday con el fin de minimizar el ruido y colocar líneas de salida largo de perfusión desde el portamuestras (véase el paso 2.8) muy por debajo del nivel del soporte de la muestra (y la botella de perfusión) para aumentar la unidad gravitatoria de la solución. Proteja estas líneas de salida y conectar el blindaje a tierra del amplificador para evitar el acoplamiento del ruido electromagnético a la señal de ERG.
  6. Ajuste la perfusión de 3-5 ml / min mediante el uso de reguladores de caudal. Conecte 5% de CO 2/95% O 2 gas de un cilindro con regulador adecuado y ajustar el caudal para garantizar burbujeo constante de los medios de comunicación en la botella a través de un difusor de aire.

Preparación 2. Muestra

  1. Ensamble instrumentos de disección limpias y afiladas incluyendo micro tijeras con filo recto, uno o dos de 45 o pinzas, cuchillas de afeitar y una pieza rectangular de papel de filtro.
  2. Vierta aproximadamente 200 ml de perfu fríaSion solución en una gran placa de Petri de modo que toda la parte inferior del soporte de muestra (incluyendo las cúpulas) se puede sumergir en la solución. Este paso es importante cuando el montaje de las retinas de las cúpulas (véase el paso 2.6). Aunque algunas soluciones están diseñadas para ser saturado con carbógeno (5% de CO2 / 95% de O 2), esto no es esencial para los fines de disección y no se hizo en los experimentos descritos aquí.
  3. Para un experimento típico, mantener a los animales en 12/12 horas ciclo de oscuridad / luz y la oscuridad-adaptarlos por 6 - 12 horas antes de las grabaciones. La eutanasia a los animales por inhalación de CO 2 seguido por dislocación cervical bajo tenue luz roja y hacer todos los siguientes procedimientos previstos en luz roja o infrarrojos dim (utilizar por ejemplo, el filtro rojo delante de la fuente de luz del microscopio).
    1. Tire de los ojos mediante el uso de pinzas y los puso en los medios de comunicación. Coloque un ojo a la vez en un pequeño pedazo de papel (por ejemplo, un poco de papel de filtro regular) y hacer comoiluminado aproximadamente en el nivel de ora serrata mientras sostiene el ojo con unas pinzas (esto se hace fuera de la solución aquí).
  4. Corte a lo largo de la ora serrata (o más cerca del ecuador del ojo) con micro tijeras y retire la córnea y el cristalino. Coloque el ocular en los medios de frío en la gran placa de Petri y repita el mismo procedimiento con el otro ojo.
  5. Cortar una pequeña incisión de la parte superior de la copa para el ojo hacia el nervio óptico manteniendo las tijeras entre la retina y la esclerótica con el fin de mantener la retina tan intacto como sea posible. Grip la esclerótica de ambos lados de la incisión mediante el uso de dos pinzas y tire de las pinzas de distancia el uno del otro para separar la retina.
    1. Cortar el nervio óptico y tratar de aislar a la retina con una mínima cantidad de contacto físico con la superficie distal. RPE será principalmente separar automáticamente de la retina durante el proceso de disección. Es más importante para evitar la perturbación mecánica de la retina que para realizar ladisección rápidamente, generalmente retinas se puede incubar al menos 30 min en la solución sin efectos significativos sobre las propiedades de respuesta.
  6. Montar las retinas de las cúpulas del portamuestras (Figura 1C). Sumergir la parte inferior del portamuestras en la placa de Petri con las retinas disecadas. Deslizar la retina, lado fotorreceptor (la superficie convexa de la retina aislada) hacia arriba, por encima de la cúpula y levantar el soporte de la muestra de modo que la retina se fija en el papel de filtro. Repita el procedimiento para el otro retina.
  7. Secar la placa de soporte con cuidado para evitar la diafonía eléctrica entre las retinas así como el ruido y la señal de derivación. Portamuestras tiene juntas tóricas alrededor de la parte inferior cúpulas para evitar derrame de solución entre la parte inferior y superior del soporte, así como para ayudar a la separación galvánica de los fotorreceptores y células ganglionares lados de las retinas individuales. Coloque la parte superior del soporte con los cuatro tornillos (véase la Figura 1B) y llenar los canales de perfusión con solución de perfusión utilizando una jeringa y una aguja.
  8. Transferir el portamuestras junto al bloque intercambiador de calor y conectar las líneas de entrada y salida de perfusión en el soporte de la muestra (Figura 1D). Conectar los electrodos al amplificador ERG (electrodos superiores conectan al suelo / menos pasador en el amplificador) y adjuntar la unidad estimulador / control en el soporte de la muestra mediante el uso de un adaptador o deslice la almohadilla eléctrica en la unidad estimulador dependiendo de la in vivo se utiliza el sistema ERG.

3. Grabaciones

  1. Configure los ajustes del amplificador y de estímulo mediante el uso de software del sistema en vivo. Ajuste la frecuencia de adquisición a un valor entre 1 y 10 kHz y de paso bajo filtrando a 300 Hz. No utilizar el filtrado de paso alto. Utilice 60 Hz (o 50 Hz en Europa) muesca filtro si es necesario.
  2. La línea de base de registro y sin estimulación de la luz y el ingenioh tenue estimulación (por ejemplo., luz verde de -35 dB o 0,3 mCd sm -2) para probar la buena conexión eléctrica entre los electrodos y muestra de retina. Espere 10 a 20 min antes de iniciar la recogida de datos de manera que la temperatura y la función de la retina llegan a un estado estable.
    1. Elija los parámetros de estímulo de acuerdo con cualquier experimento específico y comenzar la recolección de datos. Por ejemplo, utilice la luz verde de -40 hasta 0 dB o de 0,1 hasta 1000 mCd sm -2 para una familia respuesta escotópica. Utilice cerca de 2 a 3 log-unidades más brillantes destellos en grabaciones fotópicas donde las barras tienen que ser suprimida por la luz de fondo (3-30 Cdm -2) o un flash de la sonda (aproximadamente 1,3 Cd sm -2 = 1 dB, ver Figura 3).
    2. Sin embargo, recuerde que los valores de intensidad de luz exactas podrían ser algo dependiente de la calibración del sistema y de las condiciones experimentales. Como regla general, las intensidades de escala hacia abajo por 5 a 10 veces en comparación con in vivo grabaciones cuando se utiliza luz verde 17. Una cubierta de negro con aberturas por encima de las retinas (incluidos en el sistema de adaptador comercial) se puede utilizar para reducir la dispersión de luz en el soporte de la muestra y facilitar la estimulación homogénea e igualitaria de ambas retinas por la esfera Ganzfeld del comercial en vivo sistemas.
      NOTA: Para grabaciones de retina adaptada a la oscuridad, las intensidades de destellos de prueba utilizados en un experimento típico blanqueador sólo una fracción insignificante del pigmento de modo que la falta de regeneración RPE-impulsado no es un problema. Además, se ha demostrado previamente que la regeneración pigmento cono todavía puede tener lugar en la retina aislado a través del ciclo celular Müller visual 20.
  3. Como experimentos duran típicamente de 30 min hasta varias horas, controlar la deriva de la línea de base, nivel de ruido y la estabilidad de respuesta durante el experimento como cambios en estos podrían indicar problemas técnicos.
    NOTA: El aumento o disminución de ruidoamplitudes de respuesta d pueden indicar burbujas de aire en los canales de perfusión o electrodos, demasiado baja o alta temperatura, solución de fugas / derrames o desplazamiento de la retina.

4. Limpieza

  1. Separe el soporte de la muestra de las líneas de perfusión, abrirla y vaciar las retinas del papel de filtro. Retire los electrodos y enjuague con agua destilada (no utilizar etanol). Limpiar el soporte de la muestra (incluyendo los canales de perfusión) con etanol y / o agua destilada. Tubo de perfusión Flush cuidadosamente etanol con> 70%.
  2. Enjuague la botella de perfusión con agua destilada (no usar detergentes). El etanol puede ser también utilizado para limpiar la botella.

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Resultados

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Se registraron las respuestas de flash de tipo salvaje adaptada a la oscuridad (WT) C57BL / 6 retinas de ratones siguiendo los protocolos experimentales descritos anteriormente e ilustrados en la Figura 1 mediante el uso de diferentes soluciones de perfusión estándar (Figura 2). Las formas de onda y la cinética de respuesta, así como la sensibilidad de los fotorreceptores de varilla parecían similares en Ames y los medios de Locke (Figura 2A y B). Por o...

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Discusión

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Estamos aquí demostrar los pasos críticos para la obtención de alta calidad ex grabaciones ERG vivo simultáneamente desde dos retinas de ratones aislados mediante el uso de componentes en vivo del sistema ERG, junto con un adaptador ex vivo ERG. En este estudio se perfundidos ambas retinas del animal con la misma solución (ya sea Ames ', Locke o de Ringer), pero también es posible para perfundir cada retina con una solución diferente, por ejemplo, para fines de prue...

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Divulgaciones

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Universidad de Washington en St. Louis tiene un acuerdo de licencia con Xenotec, Inc. y puede recibir una regalía por la venta del adaptador ex vivo.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones EY019312 y EY021126 (VJK), EY002687 al Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales de la Universidad de Washington, y por la investigación para prevenir la ceguera.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
In vivo sistema ERGOcuScienceHMsERGwww.ocuscience.us/id77.html
>In vivo sistema ERGLKC TechnologiesUTAS-E 3000www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex vivo adaptadorOcuScienceEx VIVO ERG adaptadorwww.ocuscience.us/id107.html
Microscopio de disecciónNorth Central InstrumentsLeica M80Puede usar cualquier emisor
>IRde marca Opto Diode Corp.OD-50Lwww.optodiode.com
Prowler Visores de visión nocturnaB.E. Meyers Electro OpticsD4300-IProducto de grado militar.
Filtro rojoRosco LaboratoriesRoscolux #27 Medium RedSe puede utilizar en lugar del sistema IR
Luz de cabeza rojaOcuScienceERGX011www.ocuscience.us/catalog/i29.html
MicroscissorsWPI, Inc.500086www.wpiinc.com/
Pinzas Dumont #5WPI, Inc.14101
Hojas de afeitarElectrónica Microscopy Sciences72000www.emsdiasum.com
ScaleMetler ToledoAB54-S/FACTa href="http://www.sigmaaldrich.com/">Puede utilizar cualquier marca
Medidor de pH y electrodoBeckman CoulterpHI 350Puede utilizar cualquier marca
NaClSigma-AldrichS7653Puede utilizar cualquier marca
KClSigma-Aldrich60129Puede utilizar cualquier marca
MgCl2Sigma-Aldrich630201.0 M
solución CaCl2Sigma-Aldrich211141.0 M solución
EDTASigma-Aldrich431788Puede usar cualquier marca
HEPESSigma-AldrichH3375Puede usar cualquier marca
Bicarbonato de sodioSigma-AldrichS6297Puede usar cualquier marca
Ames mediumSigma-AldrichA1420Puede usar cualquier marca
BaCl2Sigma-AldrichB0750Puede usar cualquier marca
DL-AP4Tocris Bioscience101Puede usar cualquier marca
Sal disódica de ácido succínicoSigma-Aldrich224731Puede usar cualquier marca
Ácido L-glutámicoSigma-AldrichG2834Puede usar cualquier marca
D-(+)-GlucosaSigma-AldrichG7528Puede usar cualquier marca
Leibovitz medio de cultivo L-15Sigma-AldrichL4386Puede utilizar cualquier marca
MEM vitaminasSigma-AldrichM6895
MEM aminoácidosSigma-AldrichM5550
CarbogenAirgasUN31565% CO2
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Referencias

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  1. Armington, J. C. The Electroretinogram. , Elsevier Science & Technology Books. (1974).
  2. Einthoven, W., Jolly, W. A. The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities. Q J Exp Physiol. 1, 43(1908).
  3. Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. J. Physiol. 77, 207-239 (1933).
  4. Penn, R. D., Hagins, W. A. Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave. Nature. 223, 201-204 (1969).
  5. Stockton, R. A., Slaughter, M. M. B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity. J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).
  6. Robson, J. G., Frishman, L. J. Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram. Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).
  7. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).
  8. Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave. Nature. 227, 728-730 (1970).
  9. Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature. Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).
  10. Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
  11. Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).
  12. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).
  13. Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. J. Physiol. 167, 156-168 (1963).
  14. Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).
  15. Bastian, B. L., Fain, G. L. Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium. J. Physiol. 297, 493-520 (1979).
  16. Arden, G. B. Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina. J. Physiol. 256, 333-360 (1976).
  17. Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Res. 101, 108-117 (2014).
  18. Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
  19. Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
  20. Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
  21. Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
  22. Newman, E. A. Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells. Brain Res. 498, 308-314 (1989).
  23. Oakley, B. 2nd, Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina. Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).
  24. Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).
  25. Walter, P., Luke, C., Sickel, W. Antibiotics and light responses in superfused bovine retina. Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).
  26. Luke, M., et al. The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).
  27. Januschowski, K., et al. Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model. Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).
  28. Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses. J Vis Exp. , (2012).
  29. Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina. Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).
  30. Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments. J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).
  31. Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG. Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).
  32. Azevedo, A. W., Rieke, F. Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold. J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).
  33. Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy. J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).
  34. Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors. Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).
  35. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).
  36. Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics. J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).
  37. Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling. J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).
  38. Gouras, P., MacKay, C. J. Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).
  39. Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation. Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).

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