Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos

Summary

Describimos un protocolo para la preparación de bicapas lipídicas soportadas y su caracterización utilizando microscopía de fuerza atómica y espectroscopía de fuerza.

Abstract

La microscopía de fuerza atómica (AFM) es una técnica de imagen versátil y de alta resolución que permite la visualización de membranas biológicas. Tiene suficiente aumento para examinar subestructuras de membrana e incluso moléculas individuales. AFM puede actuar como una sonda de fuerza para medir las interacciones y las propiedades mecánicas de las membranas. Las bicapas lipídicas soportadas se utilizan convencionalmente como modelos de membrana en estudios de AFM. En este protocolo, demostramos cómo preparar bicapas soportadas y caracterizar su estructura y propiedades mecánicas utilizando AFM. Estos incluyen el espesor de la bicapa y la fuerza de ruptura.

La información proporcionada por la imagen AFM y la espectroscopia de fuerza ayuda a definir las propiedades mecánicas y químicas de las membranas. Estas propiedades desempeñan un papel importante en los procesos celulares, como el mantenimiento de la hemostasia celular del estrés ambiental, la unión de las proteínas de membrana y la estabilización de los complejos proteicos.

Introduction

Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) genera una imagen de una superficie por la exploración a través de un área de la muestra utilizando un voladizo con una punta muy afilada ^1. El movimiento de la voladizo sondea la topología de la superficie de la muestra. AFM ha sido ampliamente aplicado a las moléculas biológicas - incluyendo proteínas, el ADN y las membranas, debido a su versatilidad en el análisis de muestras fijadas en el aire o estado casi nativo en líquido ^2-5.

Aparte de su capacidad de imagen de alta resolución en el rango nanométrico, el voladizo AFM actúa como un resorte para sondear fuerzas de interacción (adhesión) y la repulsión y las propiedades mecánicas de la muestra ^5,6. Esto se conoce como espectroscopia de fuerza. En este modo, la sonda se acerca primero la muestra y ejerce una fuerza sobre él, entonces se retrae hasta que se pierde el contacto con la muestra (Figura 1A). Las curvas generadas muestran la fuerza como una función de la distancia del voladizo, tanto para la aplicacióncucaracha y retracción. Varias propiedades, incluyendo el módulo elástico para medir la rigidez de un material, y fuerzas de adhesión se pueden derivar.

Bicapas lipídicas soportados son membranas modelo biológicas situadas en la parte superior de un soporte sólido - generalmente mica, vidrio de borosilicato, sílice fundida, o silicio ⁷ oxidado. Ellos se preparan utilizando diversas técnicas como la deposición de la vesícula, el método Langmuir-Blodgett y spin-coating ^8,9. Formación de imágenes AFM se ha utilizado para seguir la formación de estas bicapas soportadas ^10, y la sonda diferentes estructuras formadas por membranas de diferentes composiciones ^11-15.

Realización de espectroscopia de fuerza en bicapas soportadas resultados en un pico en la curva de enfoque. Este pico indica la fuerza necesaria para perforar la bicapa, y se llama fuerza de avance. El espesor bicapa también se puede medir usando la curva de fuerza ^6. La fuerza de avance típico de bicapasrango entre 1-50 nN ^6. Estas propiedades dependen de embalaje de lípidos (fase líquida o gel) y la estructura (longitud de la cadena acilo y el grado de insaturación) y alterado por agentes ^16-de membrana activa. La teoría detrás de la ruptura ha sido explicada ¹⁷ y otros parámetros experimentales tales como suavidad voladizo, radio de la punta y la velocidad de enfoque también afectará la fuerza avance ^15,16,18. Espectroscopia de fuerza se ha utilizado para analizar las propiedades de las diferentes fases de lípidos ^11,19, cambios en la composición dependiente de ^12,20, así como efectos de otras biomoléculas, como los péptidos, sobre la estabilidad de la membrana ^21.

La orientación plana de bicapas soportadas es ventajoso para la combinación de AFM con otros métodos tales como resonancia de plasmón superficial ²² y microscopía de fluorescencia ^11,19 para caracterizar mejor la estructura y propiedades de las membranas.

Esta detallada proto vídeocol está destinado a preparar a bicapas lipídicas apoyados mediante la deposición de vesículas y analizarlos con AFM y espectroscopia de fuerza. Mientras que las vesículas de varios tamaños se pueden usar para preparar bicapas, este protocolo se centra en pequeñas y grandes vesículas unilamelares. Bicapas soportadas que fase separada en líquido ordenado (L _o) y (L _d) fases desordenadas líquidos se caracterizaron ^11,15. La membrana se compone de di-oleoil-fosfatidilcolina (DOPC), esfingomielina (SM) y el colesterol (Chol) en 2: 2: 1. Esta composición modelos las balsas de lípidos, que se proponen a comportarse como plataformas importantes para el tráfico de proteínas y la clasificación, la señalización celular y otros procesos celulares ^23,24.

Protocol

1. Preparación de admitidos Bilayers lípidos (SLB) ^11,12,21

1. Preparación de mezcla de lípidos y vesículas multilamelares Suspensiones
   1. Prepare los siguientes tampones de antemano.
      1. Preparar tampón PBS en concentraciones de 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH ₂ PO _4, 8 mM Na ₂ HPO _4, y NaCl 137 mM, pH 7,2.
      2. Preparar SLB (bicapa lipídica apoyado) tampón a concentraciones de NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4.
      3. Preparar una solución de 1 M de _CaCl2.
   2. Disolver los siguientes lípidos en cloroformo a una concentración deseada: por ejemplo, di-oleoil-fosfatidilcolina (DOPC) a 25 mg / ml, esfingomielina (SM) a 25 mg / ml y colesterol (Chol) a 10 mg / ml.
   3. Tome 18,38 l de DOPC, 17,10 l de SM y 11,30 l de Chol para hacer una solución con 1 mg de lípidos totales en un 2: 2: 1 DOPC: relación molar Chol: SM. Varíe los volúmenes de acuerdo basado en el concentrations de los lípidos preparados en 1.1.2. Sin embargo, mantener la relación molar a 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol, como el cambio de la relación molar va a cambiar las características de fase de la membrana ^25.
   4. Mezclar la solución por completo mediante agitación. Añadir un colorante fluorescente lipídico en 0,05% en moles si se desea visualizar la bicapa por un microscopio de fluorescencia.
      Nota: La familia de dialkylcarbocyanines de cadena larga, como lo hizo, Dil y Dio abarcan una amplia gama de longitudes de onda y puede ser idealmente utilizan para etiquetar las membranas lipídicas. Alternativamente, los lípidos marcados con fluorescencia, como rodamina-fosfatidiletanolamina o BODIPY-colesterol pueden ser utilizados. En cualquier caso, la concentración del colorante debe ser optimizado de acuerdo con el ajuste de la microscopía, teniendo en cuenta que las altas concentraciones de fluoróforo unido al lípido puede cambiar el comportamiento de lípidos ^19.
   5. Seque el cloroformo utilizando gas _N2 (o cualquier gas inerte disponibles, tales como Ar y He).
   6. Además t secaque lipídico mezcla al vacío durante al menos 1 hora.
      Nota: Si va a guardar esta mezcla de lípidos, purgar el aire con gas inerte _(N2, Ar o He) y almacenar a -20 ° C. Alícuota exceso de lípidos-en-cloroformo en pequeños frascos marrones. Secar en una manera similar a la mezcla de lípidos, desplazar el aire con gas inerte (N _2, Ar o He) y almacenar a -20 ° C.
   7. Disolver los lípidos secos en tampón de PBS a una concentración de 10 mg / ml.
   8. Vortex la mezcla vigorosamente durante aproximadamente 20 segundos a 1 minuto para obtener una suspensión turbia, contiene vesículas multilamelares. Asegúrese de que el no hay películas lipídicas se pegan a los lados del vial.
   9. Distribuir esta suspensión en 10 alícuotas (1 mg de lípidos hace 10 alícuotas).
   10. Almacenar a -20 ° C hasta su uso posterior.
2. Preparación de vesículas unilamelares
   Nota: Los varios tamaños de vesículas unilamelares se pueden preparar utilizando el método de sonicación o el método de extrusión. Sonicación usa sound energía para agitar la mezcla y separar las capas de la suspensión multilamelares. Esto se indica en la limpieza de la suspensión turbia. Extrusión obliga a las vesículas multilamelares que pasar por un filtro de membrana con un tamaño de poro definido.
   1. Método Sonicación
      1. Tome los 10 l de suspensiones lipídicas multilamelares y añadir 150 l de tampón SLB.
      2. Transfiera la mezcla en pequeñas (2 ml) viales de vidrio tapados y sellar con Parafilm.
      3. Sonicar la mezcla a temperatura ambiente en un baño de ultrasonidos durante 10 min o hasta que se vuelve claro para producir pequeñas vesículas unilaminares (SUVs, por debajo de 50 nm de diámetro).
   2. Método de extrusión
      1. Tome los 10 l de suspensiones lipídicas multilamelares y añadir 150 l de tampón SLB.
      2. Transferir la suspensión a un tubo criogénico.
      3. Congelar la suspensión de lípidos sumergiendo el tubo criogénico durante unos segundos en nitrógeno líquido.
      4. Descongele lasuspensión de lípidos sumergiendo el tubo criogénico en un baño de agua a temperatura ambiente o 37 ° C durante unos minutos. Repita los pasos de congelación-descongelación por lo menos 10 veces.
      5. Con el fin de extruir la suspensión de lípidos, utilizar una membrana de policarbonato con tamaño de poro 200 nm (otros tamaños de poro están disponibles como, 100 nm o 400 nm) y un dispositivo de extrusión comercial ^26.
         Nota: Actualmente, hay dos dispositivos de extrusión comercialmente disponible: una extrusora manual está disponible para los pequeños volúmenes (200 l a unos pocos ml). En este caso, la muestra se extruye a través de la membrana empujando manualmente la suspensión de ida y vuelta entre dos jeringas. Dependiendo del fabricante, tendrían que combinarse para alcanzar el volumen mínimo de la puesta en marcha alícuotas de lípidos. Para volúmenes más grandes se utilizan dispositivos más sofisticados (hasta 50 ml) en el que la suspensión es forzado a través de la membrana de policarbonato mediante el uso de gas comprimido. Set-up y extrusión condiciones pueden cambiar de acuerdo con el Ministerio de Defensaeléct. Consulte las instrucciones del fabricante antes de usar. Este protocolo se refiere a la extrusora manual para pequeños volúmenes.
      6. Equilibrar la extrusora en agua haciendo pasar agua a través de la extrusora. Sumerja la membrana en agua.
      7. Coloque la membrana entre los dos pistones, montar el dispositivo y equilibrar en tampón, haciendo pasar el tampón a través de la extrusora, de una jeringa a la otra. Este paso permite, además, pruebas de la falta de estanqueidad del sistema. Si se filtra, desmontar y volver a montar de nuevo el cambio de la membrana.
      8. Tome la suspensión de lípidos usando una jeringa de la extrusora ('lado sucio').
      9. Conecte la jeringa que contiene la suspensión de lípidos en una de las cámaras y la jeringa vacía en la cámara opuesta.
      10. Empuje la jeringa en un extremo. Pasar la solución a través de la membrana y en la jeringa opuesta. Este es el paso 1 ^st.
      11. Pasar a través de la membrana para un total de 31 veces talesque la solución termina en la jeringuilla opuesta ('lado limpio').
          Nota: Consulte la membrana después de la extrusión. Si se rompe, entonces el proceso de extrusión no tuvo éxito y necesita ser repetido.
      12. Vacíe la jeringa en un pequeño tubo. Vesículas unilamelares grandes (LUV) son estables durante 1-2 días si se mantiene a 4 ° C.
3. Preparación de Mica y Cubreobjetos
   1. Wash cubreobjetos primero en agua y luego en etanol. Aire seco.
   2. Tome los discos de mica y retire la capa exterior con cinta adhesiva.
   3. Coloque el disco de mica en el cubreobjetos. Colas ópticas transparentes son óptimas para que se pueda comprobar las bicapas con un microscopio de fluorescencia.
   4. Adjuntar cilindros de plástico (diámetro 2,5 cm exterior, 2 cm de diámetro interior y 0,5 cm de altura) con óptica pegamento / grasa. Asegúrese de que todo está sellado y que no hay fugas. Utilice grasa cuando se quiere volver a utilizar los cilindros, ya que pueden ser fácilmente separados de THe cubreobjetos y se lavan. Las dimensiones de los cilindros de plástico dependen del tamaño del soporte voladizo AFM y se deben ajustar en consecuencia.
4. La deposición de vesículas unilamelares en soporte sólido
   1. Pipetear toda la solución de liposomas directamente sobre la mica. Añada más memoria intermedia SLB para llegar a un volumen de 300 l.
   2. Añadir 0,9 l de solución de cloruro de calcio 1 M para alcanzar una concentración final de 3 mM Ca ^2+.
   3. Incubar a 37 ° C durante 2 min y luego a 65 ° C durante al menos 10 min. Siempre cubra las bicapas con tampón. El contacto con las burbujas de aire y aire lo destruirá. Durante la incubación, añadir más tampón si es necesario, especialmente si la incubación a temperaturas más altas.
      Nota: Las temperaturas de incubación varían de acuerdo con las mezclas de lípidos y fases requeridas. Se necesita tiempo de incubación de al menos 10 min para formar bicapas soportadas, pero podría ser más largo, dependiendo de la temperatura y la composición.
   4. Lavarla bicapa con agua caliente (65 ° C) tampón SLB 15-20 veces para eliminar el calcio y las vesículas no fusionadas. Tenga mucho cuidado durante las etapas de lavado para mantener la bicapa bajo tampón y pipetear suavemente la solución de lavado para evitar la destrucción de la bicapa.
   5. Bicapas frescos soportados a temperatura ambiente antes de mediciones de AFM. Esto es necesario para formar las diferentes fases de la membrana, así como minimizar la deriva térmica en el instrumento.

2. Microscopía de Fuerza Atómica Medidas ^11,12

1. Imaging
   Nota: Realice las imágenes de microscopía de fuerza atómica en el modo de contacto o el modo tapping. De imagen soportados bicapas en solución; no permita que la solución se evapore por completo ya que esto va a destruir las bicapas. Como era de estar trabajando con tampón, se deben observar las medidas de seguridad para asegurarse de que cualquier parte AFM está protegido contra derrames de líquidos.
   1. Seleccionar un voladizo suave (abajo se recomienda 0,2 N / m constante del resorte) y montarlo en tél AFM. La elección de la rigidez en voladizo es más crítico para la espectroscopia de fuerza (y esto se discutirá más adelante).
   2. Montar la muestra en el escenario AFM y asegurarse de que todos los módulos de aislamiento de vibraciones están encendidos. Espere al menos 15 minutos para equilibrar y reducir la deriva térmica del sistema. Dependiendo de la AFM configuración, especificaciones de ajuste y de imagen pueden variar. Consulte el manual del fabricante.
   3. Acérquese a la muestra con la punta del AFM hasta que el contacto.
   4. Desde bicapas lipídicas son generalmente 4 nm de altura, utilice el Z-rango del instrumento que le dará la mayor z-resolución (por ejemplo 1,5 micras).
   5. Seleccione una región de la imagen. Para tener una visión general de la bicapa lipídica, un 50 micras x 50 micras o 25 micras x 25 micras región será un buen punto de partida para la imagen. Si aparecen las características más pequeñas, la imagen de un bote en áreas más pequeñas (10 m x 10 m, o 2 m x 2 m). La elección de la superficie de imágenes también depende de la r de trabajoange del escáner piezoeléctrico. Por favor consulte el manual del instrumento para ello.
   6. Como bicapas son muy frágiles, ajustar el punto de la punta del AFM conjunto durante la exploración para mantener la fuerza, como mínimo, y corregir la deriva térmica, manteniendo contacto con la muestra. En el modo de contacto, minimizar el punto de ajuste. En el modo de grabación, maximizar el punto de ajuste.
   7. Imágenes de proceso de ajuste de cada línea de exploración de las funciones polinómicas de nivelación. Efectuar la eliminación de línea para las exploraciones que pierden contacto con la membrana utilizando el software propietario de la empresa de fabricación de AFM.
2. Fuerza Espectroscopia
   1. Calibrar el voladizo siguiendo las instrucciones según el protocolo del fabricante. La calibración permite la conversión de la señal eléctrica de los fotodiodos a la fuerza (Figura 1B).
      1. Calibrar sensibilidad de la punta para medir la deflexión como el movimiento z-piezo (en unidades de longitud) en lugar de la señal eléctrica en voltios.
         Nota: AFM detecta cambios en la deflexión del voladizo utilizando un láser reflejados en la parte posterior de la voladizo. El láser alcanza un fotodiodo que puede detectar espacialmente la posición del punto láser. Un cambio en la deflexión del voladizo como se dobla al contacto con la muestra se detecta por este fotodiodo como "deflexión vertical", y esto es en las unidades de tensión. Dado que el voladizo se mueve por el piezo-z, la deflexión vertical está relacionado con el movimiento en el z-piezo. La relación entre la deflexión vertical y z-movimiento se llama sensibilidad y convierte el voltaje a distancia.
      2. Calcular la constante de resorte en voladizo utilizando el método de frecuencia de ruido térmico, generalmente incorporado en el software AFM. En este método, representar gráficamente la amplitud de la vibración del ruido con respecto a la frecuencia de oscilación, la creación de un gráfico de densidad espectral de potencia. Esta parcela se mostrará un pico alrededor de la frecuencia de resonancia. La frecuencia donde el i amplituds la mayor es la frecuencia de resonancia. Montar una función Lorentzian alrededor del pico para calcular automáticamente la constante del resorte por el software. Algunos recursos útiles para la teoría del método ruido térmico se dan en las referencias ^27-30.
   2. Después de la formación de imágenes un área de la bicapa, seleccione una región x 5 m 5 m en la bicapa para realizar espectroscopia de fuerza.
   3. Configure el AFM para que tome las curvas de fuerza en una cuadrícula de esa región de 16 x 16. Esto se traduce en 256 curvas de fuerza por región. El espacio entre dos puntos vecinos debería ser suficiente para evitar que el área de la membrana se sondeó por un punto coincidiría con el siguiente punto. Esto depende de la radio de la punta. Una distancia 100 nm entre dos puntos sería ideal. Divida el 5 micras x 5 región micras en 16 x 16 cuadrícula. Dependiendo del tamaño de la fase, se puede seleccionar una región más pequeña o más grande, y luego ajustar el tamaño de la cuadrícula en consecuencia.
   4. Ajuste de desplazamiento z-piezo a400 nm. Esto determina el rango máximo de movimiento de la z-piezo. Debe ser lo suficientemente grande para asegurarse de que el voladizo ha completamente retraída lejos de la muestra en entre mediciones.
   5. Ajuste la velocidad de aproximación a 800 nm / seg y retraer la velocidad a 200 nm / seg. Utilice una velocidad de aproximación entre 400 a 6.000 nm / seg dependiendo de la composición bicapa y fase lipídica a ser estudiados ^6,16.
   6. Después de configurar todos los parámetros, adquirir curvas de fuerza, pulsando el botón "Ejecutar" del software AFM.
   7. Guardar curvas de fuerza como la fuerza contra curvas de altura (una medida del movimiento z-piezo). Esto no toma en cuenta la flexión del voladizo cuando está en contacto con la muestra. Durante la etapa de procesamiento de datos, el software AFM permite la corrección de flexión en voladizo para obtener fuerza frente a curvas de separación punta-muestra (Figura 1C), lo que dará valores adecuados para el espesor bicapa. Los valores de corrección se incorporan normalmente en la Calibración, que se guarda con cada curva de fuerza. Calcular la separación punta-muestra restando la desviación vertical del movimiento piezo en un punto dado.
      Nota: El pico en la curva de fuerza enfoque (el valor de la fuerza va hacia abajo, incluso si el movimiento en voladizo está todavía en el ciclo de aproximación) es la fuerza de avance de la membrana, mientras que la diferencia entre la posición de este pico y la posición del punto donde la fuerza comienza a aumentar de nuevo proporciona el espesor de la membrana.
   8. Adquirir al menos 500 curvas de fuerza para cada condición para obtener buenas estadísticas. Trazar un histograma de los valores utilizando programas como Origen o MatLab, y encajar los histogramas para una distribución gaussiana para obtener el pico y la anchura de la distribución.

Results

Bicapas soportadas lípidos compuestos por DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) se obtuvieron imágenes de AFM (Figura 2 AC). Debido a la composición lipídica, se observaron SM / Chol-rica _o L y DOPC-ricos fases L _d. El perfil de la altura de la imagen AFM puede proporcionar información importante sobre la estructura de la membrana. Al observar el perfil de altura, el espesor de la bicapa se puede medir en presencia de defectos en la membrana (Figura 2B), o la diferencia de altu...

Discussion

SLBS compuestas de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) se formaron en mica después de la adsorción de vesículas y la ruptura inducida por cloruro de calcio. Esta composición lipídica separa en L _d y L _o fases. La fase L _o se enriquece en la esfingomielina y colesterol, y es menos fluido / más viscoso (Figura 1A) que la fase L ¹¹ _d. La separación de L _o de la fase L _d manifiesta como estructuras circulares elevadas por encima de los alrede...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina	Avanti Polar Lipids, Inc.	850375P	Se presenta en forma de polvo liofilizado en viales sellados. Disuelva todo el polvo en cloroformo al abrirlo. Almacene el extra en forma de películas lipídicas secas, en atmósfera inerte, a -20   °C. Visite aquí para obtener más información sobre el almacenamiento y la manipulación.
Esfingomielina (Cerebro, Porcino)	Avanti Polar Lipids, Inc.	860062P	Se presenta en forma de polvo liofilizado en grandes recipientes de plástico sellados. Disuelva la punta de una espátula de polvo en cloroformo al abrir. Almacene el extra en forma de películas lipídicas secas, en atmósfera inerte, a -20   °C. Visita aquí para obtener más información sobre el almacenamiento y la manipulación.
Colesterol	Avanti Lípidos Polares, Inc.	700000P	Se presenta en forma de polvo liofilizado en grandes recipientes de plástico sellados. Disuelva la punta de una espátula de polvo en cloroformo al abrir. Almacene el extra en forma de películas lipídicas secas, en atmósfera inerte, a -20   °C. Visita aquí para obtener más información sobre el almacenamiento y la manipulación.
Cloruro de sodio (NaCl), 99,8%	Carl Roth GmbH + Co. KG	9265.1
Cloruro de potasio (KCl), 88%	Sigma	P9541
Hidrogenofosfato de sodio (Na2HPO4), >99%	AppliChem GmbH	A1046
Dihidrogenofosfato de potasio (KH2PO4), 99%	Carl Roth GmbH + Co. KG	3904.1
Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2), grado de biología molecular	AppliChem GmbH	A4689
HEPES, grado de biología molecular	AppliChem GmbH	A3724
Cubreobjetos de vidrio, 24  x  60  milímetros, 1  mm de espesor	Duran Group	2355036
Juego de punzones y troqueles	Precision Brand Products, Inc	40105
Adhesivo óptico	Norland Products, Inc.	NOA 88	Adhesivo líquido que se endurece cuando se cura bajo luz UV de longitud de onda larga.
[header]
Mica bloquea NSC	Mica Exports Ltd.		Se trata de piezas de mica de al menos 1 pulgada cuadrada de área y grosor que van desde 0,006 pulgadas hasta 0,016 pulgadas. Son cortados a un tamaño específico por la empresa para su envío. Los pequeños discos de mica se pueden perforar a partir de los bloques de mica con el juego de punzones y troqueles. Manipule siempre la mica con guantes o pinzas.
Equipo de laboratorio	Barrenador de grasa Chemie AG	Glisseal N
Extrusora de liposomas	Avestin	LiposoFast-Basic	Como alternativa, también se pueden consultar las ofertas de Northern Lipids, Inc.
Cinta adhesiva	3M	Scotch(R) Magic (TM) Cinta 810 (1 pulgada)
Sonicador de baño	Bandelin Sonorex Digitec	DT-31	Sin calentamiento, Frecuencia: 35 kHz, Potencia máxima ultrasónica: 160 W, Potencia HF: 40 W. (Hoja de datos)
Nitruro de silicio AFM Cantilever	Sondas Bruker AFM	DNP-10	Cada voladizo tiene cuatro puntas y su radio nominal de punta es de 20 nm (con un máximo posible de 60  nm). Según las especificaciones, utilizamos la punta D con una frecuencia de resonancia de 18 kHz y una constante de resorte nominal de 0,06 N/m.
AFM	JPK	JPK Nanowizard II montado en Zeiss Axiovert 200