Artículo de método

Establecimiento de un punto de vista clínico relevante

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DOI:

10.3791/52886

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5 de junio de 2015

 ,  ,  , 
1Pathology, Anatomy and Cell Biology, Thomas Jefferson University

En este artículo

Resumen

Aquí se describe el establecimiento de un modelo de cirugía de catarata simulada ex vivo clínicamente relevante que se puede utilizar para investigar los mecanismos de la respuesta a la lesión de los tejidos epiteliales dentro de su microambiente nativo.

Resumen

El principal impedimento para comprender cómo un tejido epitelial ejecuta la reparación de heridas es la disponibilidad limitada de modelos en los que es posible seguir y manipular la respuesta de la herida ex vivo en un entorno que imita de cerca el de la lesión del tejido epitelial in vivo. Este problema se abordó mediante la creación de un modelo de reparación de lesiones epitelial ex vivo clínicamente relevante basado en la cirugía de cataratas. En este modelo de cultivo, la respuesta del epitelio del cristalino a la herida se puede seguir en vivo en el microambiente nativo de las células, y los mediadores moleculares de la reparación de heridas se pueden manipular fácilmente durante el proceso de reparación. Para preparar los cultivos, se retiran los cristalinos del ojo y se hace una pequeña incisión en la parte anterior del cristalino de la que se extrae la masa interna de células de fibra del cristalino. Este procedimiento crea una herida circular en la cápsula posterior del cristalino, la gruesa membrana basal que rodea el cristalino. Esta área de la herida donde se unieron las células de fibra se encuentra justo adyacente a una monocapa continua de células epiteliales del cristalino que permanece unida a la cápsula del cristalino durante el procedimiento quirúrgico. El epitelio herido, el tipo de célula del que se derivan las células de fibra durante el desarrollo, responde a la lesión de la eliminación de células de fibra moviéndose colectivamente a través del área de la herida, liderada por una población de células de reparación ricas en vimentina cuyos progenitores mesenquimales son endógenosal cristalino. Estas propiedades son típicas de una respuesta normal de cicatrización de heridas epiteliales. En este modelo, al igual que in vivo, la reparación de heridas depende de las señales suministradas por el entorno endógeno que se mantiene de forma única en este sistema de cultivo ex vivo, lo que proporciona una oportunidad ideal para descubrir los mecanismos que regulan la reparación de un epitelio después de una herida.

Introducción

El, simulacro de cirugía de catarata clínicamente relevante, ex vivo modelo de curación de heridas epiteliales aquí descrito fue desarrollado para proporcionar una herramienta para la investigación de los mecanismos que regulan la reparación de los tejidos epiteliales en respuesta a una lesión. Las principales características que fueron destinadas para la creación de este modelo incluyen 1) proporcionar condiciones que replican de cerca la respuesta in vivo para herir en un entorno cultural, 2) la facilidad de la modulación de los elementos reguladores de la reparación, y 3) capacidad de la imagen del proceso de reparación, en su totalidad, en tiempo real. El reto, por lo tanto, era crear un modelo de cultivo en el que era posible estudiar y manipular, reparación de la herida epitelial en microambiente nativa de las células. La disponibilidad de este modelo de herida de reparación de abre nuevas posibilidades para la identificación de las señales de señalización endógenos de la matriz de proteínas, citocinas y quimiocinas que regulan el proceso de reparación. Además, el modelo es ideal para examinar cómo unn epitelio es capaz de moverse como una lámina colectiva para volver a epitelizar el área de la herida 2,3, y para determinar el linaje de células mesenquimales líder en el borde de la herida que funciona en la dirección de la migración colectiva del epitelio lesionado 4. Este modelo también ofrece una plataforma con la que identificar terapias que podrían promover la cicatrización efectiva y prevenir la reparación de heridas aberrante 5.

Ya hay una serie de modelos de heridas de reparación disponibles, tanto en la cultura como in vivo, que han proporcionado la mayor parte de lo que se conoce sobre el proceso de reparación de heridas hoy. En modelos de lesión de origen animal, tales como la córnea y la piel 6-12 13-17, hay la oportunidad de estudiar la respuesta del tejido a heridas en el contexto de todos los mediadores de reparación que podrían estar involucrados en el proceso, incluyendo las contribuciones de la vasculatura y el sistema nervioso. Sin embargo, hay limitaciones a la manipulación de la expericondiciones mentales en vivo, y aún no es posible llevar a cabo estudios de imagen de la respuesta de reparación in vivo, de forma continua en el tiempo. En contraste, la mayoría de los modelos de cultivo in vitro de reparación de la herida, tales como la herida de cero, pueden ser fácilmente manipulados y siguieron a lo largo del tiempo, pero carecen el contexto ambiental de estudiar la cicatrización de heridas en el tejido in vivo. Mientras que los modelos ex vivo ofrecen la ventaja de estudiar el proceso de reparación de la lesión continua en el tiempo en el contexto de microambiente de las células junto con la capacidad de modular los reguladores moleculares de reparación en cualquier punto en el proceso de tiempo, hay pocos modelos que se ajustan a estos parámetros.

Aquí se describe un procedimiento para generar altamente reproducible ex vivo epitelial herida culturas que reproducen la respuesta de un tejido epitelial a una herida fisiológico de curación. Uso de la lente de embrión de pollo como una fuente de tejido, un ex vivo mock se lleva a cabo la cirugía de catarata. La lente es un tejido ideal para utilizar para estos estudios ya que es auto-contenida dentro de una cápsula gruesa membrana basal, avascular, no inervado, y libre de cualquier estroma asociado 18,19. En la enfermedad humana, la cirugía de catarata se ocupa de la pérdida de la visión debido a la opacificación de la lente, y consiste en la extirpación de la masa celular de fibra de lente, que comprende el grueso de la lente. Después de la cirugía de cataratas visión se restaura mediante la inserción de una lente intraocular artificial. El procedimiento de la cirugía de cataratas, a través de la eliminación de las células de fibra, induce una respuesta lesión en el epitelio de la lente adyacente, que responde por la reepitelización de la zona posterior de la cápsula del cristalino que había sido ocupada por las células de fibra. En la cirugía de cataratas, como en la mayoría de las respuestas de reparación de la herida, hay a veces se produce un resultado fibrótica aberrante a la respuesta de cicatrización de heridas, asociado con la aparición de miofibroblastos, que en la lente que se conoce como Posterior Capsule opacificación 20-22. Para generar el modelo de cicatrización de heridas cirugía de cataratas, un procedimiento de cirugía de cataratas es imitado en lentes retira del ojo de embrión de pollo para producir una lesión fisiológica. Remoción microquirúrgica de las células resultados de fibra de la lente en un área de la herida circular muy consistente rodeado por las células epiteliales de la lente. Esta población de células permanece firmemente unido a la cápsula de la membrana basal de la lente y se lesiona por el procedimiento quirúrgico. Las células epiteliales migran a la zona denudada de la membrana basal endógena para sanar la herida, dirigido por una población de células mesenquimales vimentina ricos conocidos en el proceso de reparación como células líder 1. Con este modelo de la respuesta de un epitelio a la lesión puede ser visualizado y siguió con el tiempo en el contexto de microambiente de las células fácilmente. Las células son fácilmente accesibles a las modificaciones de la expresión o activación de moléculas espera que juegue un papel en la reparación de heridas. Una característica poderosa del XXes el modelo es la capacidad de aislar y estudiar los cambios a la migración específica en el marco de la cicatrización de heridas. La capacidad de preparar un gran número de cultivos in vivo de edad emparejados ex cicatrización de heridas para los estudios es otra ventaja de este modelo. De este modo, este modelo de sistema ofrece una oportunidad única de separar los mecanismos de reparación de la herida y la terapéutica de las pruebas para determinar su efecto sobre el proceso de cicatrización de la herida. Se espera que el modelo de la cirugía de cataratas ex vivo simulacro de tener una amplia aplicación, proporcionando un recurso crítico para el estudio de los mecanismos de reparación del daño.

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Protocolo

El siguiente protocolo cumple con las directrices de Animales Institucional de Cuidado y Uso Comité Thomas Jefferson University y con la Declaración de ARVO para el uso de animales en Vision Research.

1. Instalación y Preparación de lentes para la Cultura ex vivo de la herida

  1. Coloque tres platos de 100 mm de Petri en una campana de flujo laminar estéril. Llenar dos de los platos de Petri a medio camino con tampón Tris / Dextrosa (tampón TD; NaCl 140 mM, 5 mM KCl, 0,7 mM Na 2 PO 4, 5 mM D-glucosa, 8,25 mM Tris Base, pH a 7,4 con HCl) a TA , dejando la tercera vacío. Medios de cultivo Pre-caliente (Media suplementado con 199, 1% de L-glutamina y 1% de penicilina / estreptomicina) a 37 o C.
    Nota: El estándar de las heridas de curación medios de cultivo es libre de suero, como ocurre in vivo; sin embargo, los cultivos de reparación de la herida se pueden cultivar con éxito en condiciones de medios definidos que incluyen suero u otros factores.
  2. Retire fértil d embrionariaay 15 White Leghorn huevos de pollo de la incubadora (celebrada en 37,7 ° C con suave balanceo)
  3. Coloca el huevo seleccionado en la campana de flujo laminar y fuera de la cáscara limpia con etanol al 70% a partir de una botella de lavado. Llevar a cabo todos los procedimientos siguientes en condiciones asépticas en la campana de flujo laminar, el uso de soluciones e instrumentos estériles.
  4. Grieta de huevo y colocar contenido en el vacío de 100 mm placa de Petri. Decapitar embrión utilizando pinzas estándar y tijeras finas. Coloque la cabeza del embrión de pollo en una placa de Petri que contiene tampón TD y disponer adecuadamente del resto del embrión. Opcionalmente mantener las cabezas de embrión de pollo en tampón TD por un corto período de tiempo, no más de 15 min.
  5. Coloque la cabeza del embrión de pollo en una tapa de placa de Petri. Con unas pinzas de alta precisión, retire la lente junto con su humor vítreo adjunta del ojo en la siguiente secuencia. Apriete la parte posterior del ojo con las pinzas para crear una pequeña abertura en la parte posterior del ojo.
  6. Luego, sujete el humor vítreo wITH pinzas y tirar suavemente en el vítreo con un movimiento de balanceo, el vítreo con el objetivo puesto serán desalojados del ojo. Coloque la lente / vítreo en la placa de Petri restante contiene tampón TD. Permita que los lentes se mantengan en tampón TD durante no más de 30 min.
  7. Mover la lente a una nueva tapa de placa de petri bajo un microscopio de disección. Desde este punto de realizar todos los pasos bajo un microscopio de disección. Con unas pinzas de alta precisión cepillarse cuidadosamente cualquier cuerpo ciliar (células pigmentadas) que fueron desalojados con la lente usando el borde de la pinza, teniendo la precaución de no dañar el tejido objetivo.
    Nota: Extracción del cuerpo ciliar se asegura de que los tipos de células que no son endógenas a la lente no se incluyen en la cultura reparación de la herida.
  8. Separar la lente del humor vítreo con pinzas de alta precisión pellizcando fuera del cuerpo vítreo de su asociación con la cápsula posterior del cristalino.
  9. Uso de alta precisión fórceps transferir la lente en una pequeña gotade tampón TD (aproximadamente 200 l) en una placa de cultivo tisular de 35 mm.

2. Realización de Cirugía de Catarata Mock

  1. Oriente la lente en la gota de tampón TD en el plato 35 mm con el aspecto anterior de la lente hacia arriba.
    Nota: El anterior de la lente se identifica fácilmente por la presencia de un anillo denso en el tejido que toma nota de la frontera entre la parte anterior y la región ecuatorial del epitelio del cristalino. En contraste, hay una ausencia de marcas en la parte posterior de la cápsula de la lente a la que están unidos los células de fibra óptica.
  2. El uso de dos pinzas de alta precisión hacer una pequeña incisión (aproximadamente 850μm) en el centro de la cápsula anterior de la lente, la membrana basal gruesa que rodea el tejido del cristalino, y su epitelio anterior del cristalino asociada, agarrando el tejido con uno fórceps en cada mano y tirando suavemente en direcciones opuestas.
  3. Retire la masa celular de fibra, lo que constituye la mayor parte del tejido de la lente, dislodging desde sus archivos adjuntos al epitelio de la lente y que rodea la cápsula del cristalino por hidro-elución (un enfoque clásico utilizado en la cirugía de cataratas, modelada en la Figura 1A).
  4. Llene una jeringa de 1 ml con una punta de la aguja 27.5 G con 300 l de tampón TD. Inserte la punta de la aguja en la incisión hecha en la cápsula anterior del cristalino, y aproximadamente a mitad de camino en la lente.
  5. Presione suavemente la jeringa inyectar el tampón TD en la masa celular de fibra lente. Inyectar entre 50 y 200 TD l, y nunca más de 300 l. Observe la masa celular de fibra aflojando en sí de la cápsula epitelio y lente.
  6. Con unas pinzas de alta precisión, retire la masa celular de fibra aflojado desde la lente a través del sitio de la incisión anterior.
    Nota: Este procedimiento deja la cápsula posterior del cristalino membrana basal a la cual las células de fibra se habían unido despojada de las células, y un epitelio del cristalino lesionado justo al lado de este sitio.

3. preparing la lente Herido de Ex Vivo Cultura

  1. Acoplar la bolsa capsular de la lente que resulta de la cirugía de cataratas se ha descrito anteriormente en la placa de cultivo, con el lado de células hasta, al hacer cinco cortes en la cara anterior de la bolsa capsular.
  2. Cortar perpendicular a la zona de la incisión original a través del ecuador de la lente. Acoplar los resultantes cinco "flaps" de cápsula del cristalino con el epitelio adjunta en el lado de la cápsula placa de cultivo abajo, célula hacia arriba. Nota de la lente heridos ex vivo ahora debe asumir una estrella o la forma del flowerlike (véase la Figura 1B).
  3. Para asegurar la cápsula para el plato, presione suavemente hacia abajo con las pinzas en cada punto de la estrella. Esto hará una pequeña hendidura en los cinco consejos más exteriores del explante y el resultado en apego sostenido al plato.
    Nota: Es posible dañar la cápsula durante este procedimiento y por lo que es importante para asegurar la cápsula al plato tan cerca de la punta de la flaps como sea posible, así como para hacer la menor cantidad de puntos de sujeción como sea posible (generalmente dos, máximo de tres por FLAP).
  4. Retire el tampón TD desde el plato de 35 mm y reemplazarlo con 1,5 ml de medio de pre-calentado. Cubra el plato de 35 mm con su tapa y colocar en la incubadora (37 ° C, 5% de CO 2).

4. Separación de la Zona Central de Migración (CMZ), donde Re-epitelización de la zona de la herida de la Cápsula Posterior produce, desde el archivo adjunto original Zone (OAZ) de las células epiteliales de la lente, para el análisis cuantitativo.

Nota: Las células comienzan a moverse en la región CMZ inmediatamente en respuesta a una lesión. Por día uno en la cultura suficientes células están migrando a través de la CMZ para el análisis molecular y bioquímico, después de la separación de la CMZ y la OAZ por micro-disección 23. Este protocolo consiste en la extracción de una solapa (OAZ) a la vez desde la zona de la herida de la cápsula.

  1. Observar un Demarcatión, claramente visible bajo el microscopio de disección, entre el OAZ y CMZ (véase la figura 2A). El uso de dos pinzas de alta precisión, sujete con ambas pinzas en el borde de la línea de OAZ / CMZ, uno justo al lado de la otra, a cada lado de la línea (ver la Figura 2A, B, flecha).
  2. Con una mano / un fórceps en el lado CMZ siguen aferrarse a la cultura heridos, mientras que con la otra mano / pinzas, tire suavemente de la OAZ largo de la línea OAZ / CMZ. La CMZ separa fácilmente del OAZ largo de esta línea. Continuar por esta línea alrededor de toda la cultura hasta que las dos regiones están completamente separadas.
  3. Estudiar las Oaz y CMZ fracciones separadas para el análisis molecular, tales como 24 o bioquímica análisis de ARN-Seq como western blot o co-inmunoprecipitación 23,25.

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Resultados

Creado ex vivo modelo para estudiar el proceso de cicatrización de heridas en microambiente nativa de las células

Para investigar los mecanismos implicados en la regulación de la cicatrización de heridas de un epitelio dentro microambiente nativa de las células, se ha creado un modelo de la cirugía de catarata clínicamente relevante ex vivo simulacro. Este modelo se crea a partir de tejido de lente que ofrece muchas ventajas, debido a sus propiedades intrínsecas: 1) la lent...

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Discusión

Aquí se describe una técnica para preparar un modelo de cultivo de reparación de heridas que implica realizar una cirugía de cataratas ex vivo en lentes de embriones de pollo después de su extracción del ojo. El epitelio del cristalino responde a esta herida clínicamente relevante con un proceso de reparación que imita de cerca el que ocurre in vivo y comparte características con la reparación de heridas en otros tejidos epiteliales2,4. Si bien el protocolo es sencillo y fácil de seguir, real...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la subvención de los Institutos Nacionales de Salud a A.S.M. (EY021784).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cloruro de sodio (NaCl)Fisher ScientificS271-3Uso a 140 mM en tampón TD
Cloruro de potasio (KCl)Fisher ScientificP217-500Uso a 5 mM en tampón TD
Fosfato de sodio (Na2HPO4)SigmaS0876Uso a 0,7 mM en tampón TD
D-glucosa (Dextrosa)Fisher ScientificD16-500Uso a 0,5 mM en tampón TD
Tris BaseFisher ScientificBP152-1Uso a 8,25 mM en tampón TD
Ácido clorhídricoFisher ScientificA144-500Uso a pH Tampón TD a 7,4
Media 199GIBCO11150-059
L-glutaminaCorning/CellGro25-005-CIUso al 1% en Media199
Penicilina/estreptomicinaCorning/ CellGro30-002-CIUso al 1% en Media199
placas de Petri de 100 mmUnidad
StericupMilliporeSCGPU01REÚselo para filtrar y esterilizar
Pinzas de Media Dumont #5 (necesidad 2)Fine Science Tools11251-20
Plato de cultivo celular de 35 mmCorning430165
27 G 1 ml SlipTip con aguja deslizante de precisiónBD309623
tijeras finas Herramientas deciencia fina14058-11
Pinzas estándarHerramientas de ciencia fina91100-12
Otros artículos necesarios: Instrumentos generales de disección,  Huevos de gallina Leghorn blancos fértiles, Incubadora de huevos de verificación (humidificada, 37.7° C), campana de flujo laminar, microscopio
de filtro Fisher Scientific FB0875711Z de disección binocular por estereovisión

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