Aquí se describe el establecimiento de un modelo de cirugía de catarata simulada ex vivo clínicamente relevante que se puede utilizar para investigar los mecanismos de la respuesta a la lesión de los tejidos epiteliales dentro de su microambiente nativo.
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Artículo de método
Establecimiento de un punto de vista clínico relevante
En este artículo
Resumen
Resumen
El principal impedimento para comprender cómo un tejido epitelial ejecuta la reparación de heridas es la disponibilidad limitada de modelos en los que es posible seguir y manipular la respuesta de la herida ex vivo en un entorno que imita de cerca el de la lesión del tejido epitelial in vivo. Este problema se abordó mediante la creación de un modelo de reparación de lesiones epitelial ex vivo clínicamente relevante basado en la cirugía de cataratas. En este modelo de cultivo, la respuesta del epitelio del cristalino a la herida se puede seguir en vivo en el microambiente nativo de las células, y los mediadores moleculares de la reparación de heridas se pueden manipular fácilmente durante el proceso de reparación. Para preparar los cultivos, se retiran los cristalinos del ojo y se hace una pequeña incisión en la parte anterior del cristalino de la que se extrae la masa interna de células de fibra del cristalino. Este procedimiento crea una herida circular en la cápsula posterior del cristalino, la gruesa membrana basal que rodea el cristalino. Esta área de la herida donde se unieron las células de fibra se encuentra justo adyacente a una monocapa continua de células epiteliales del cristalino que permanece unida a la cápsula del cristalino durante el procedimiento quirúrgico. El epitelio herido, el tipo de célula del que se derivan las células de fibra durante el desarrollo, responde a la lesión de la eliminación de células de fibra moviéndose colectivamente a través del área de la herida, liderada por una población de células de reparación ricas en vimentina cuyos progenitores mesenquimales son endógenosal cristalino. Estas propiedades son típicas de una respuesta normal de cicatrización de heridas epiteliales. En este modelo, al igual que in vivo, la reparación de heridas depende de las señales suministradas por el entorno endógeno que se mantiene de forma única en este sistema de cultivo ex vivo, lo que proporciona una oportunidad ideal para descubrir los mecanismos que regulan la reparación de un epitelio después de una herida.
Introducción
El, simulacro de cirugía de catarata clínicamente relevante, ex vivo modelo de curación de heridas epiteliales aquí descrito fue desarrollado para proporcionar una herramienta para la investigación de los mecanismos que regulan la reparación de los tejidos epiteliales en respuesta a una lesión. Las principales características que fueron destinadas para la creación de este modelo incluyen 1) proporcionar condiciones que replican de cerca la respuesta in vivo para herir en un entorno cultural, 2) la facilidad de la modulación de los elementos reguladores de la reparación, y 3) capacidad de la imagen del proceso de reparación, en su totalidad, en tiemp....
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Protocolo
El siguiente protocolo cumple con las directrices de Animales Institucional de Cuidado y Uso Comité Thomas Jefferson University y con la Declaración de ARVO para el uso de animales en Vision Research.
1. Instalación y Preparación de lentes para la Cultura ex vivo de la herida
- Coloque tres platos de 100 mm de Petri en una campana de flujo laminar estéril. Llenar dos de los platos de Petri a medio camino con tampón Tris / Dextrosa (tampón TD; NaCl 140 mM, 5 mM KCl, 0,7 mM Na 2 PO 4, 5 mM D-glucosa, 8,25 mM Tris Base, pH a 7,4 con HCl) a TA , dejando la tercera vacío. Medios de cultivo Pre-caliente (....
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Resultados
Creado ex vivo modelo para estudiar el proceso de cicatrización de heridas en microambiente nativa de las células
Para investigar los mecanismos implicados en la regulación de la cicatrización de heridas de un epitelio dentro microambiente nativa de las células, se ha creado un modelo de la cirugía de catarata clínicamente relevante ex vivo simulacro. Este modelo se crea a partir de tejido de lente que ofrece muchas ventajas, debido a sus propiedades intrínsecas: 1) la lent.......
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Discusión
Aquí se describe una técnica para preparar un modelo de cultivo de reparación de heridas que implica realizar una cirugía de cataratas ex vivo en lentes de embriones de pollo después de su extracción del ojo. El epitelio del cristalino responde a esta herida clínicamente relevante con un proceso de reparación que imita de cerca el que ocurre in vivo y comparte características con la reparación de heridas en otros tejidos epiteliales2,4. Si bien el protocolo es sencillo y fácil de seguir, real.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la subvención de los Institutos Nacionales de Salud a A.S.M. (EY021784).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cloruro de sodio (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Uso a 140 mM en tampón TD |
| Cloruro de potasio (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Uso a 5 mM en tampón TD |
| Fosfato de sodio (Na2HPO4) | Sigma | S0876 | Uso a 0,7 mM en tampón TD |
| D-glucosa (Dextrosa) | Fisher Scientific | D16-500 | Uso a 0,5 mM en tampón TD |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | Uso a 8,25 mM en tampón TD |
| Ácido clorhídrico | Fisher Scientific | A144-500 | Uso a pH Tampón TD a 7,4 |
| Media 199 | GIBCO | 11150-059 | |
| L-glutamina | Corning/CellGro | 25-005-CI | Uso al 1% en Media199 |
| Penicilina/estreptomicina | Corning/ CellGro | 30-002-CI | Uso al 1% en Media199 |
| placas de Petri de 100 mm | Unidad | ||
| Stericup | Millipore | SCGPU01RE | Úselo para filtrar y esterilizar |
| Pinzas de Media Dumont #5 (necesidad 2) | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Plato de cultivo celular de 35 mm | Corning | 430165 | |
| 27 G 1 ml SlipTip con aguja deslizante de precisión | BD | 309623 | |
| tijeras finas Herramientas de | ciencia fina | 14058-11 | |
| Pinzas estándar | Herramientas de ciencia fina | 91100-12 | |
| Otros artículos necesarios: Instrumentos generales de disección, Huevos de gallina Leghorn blancos fértiles, Incubadora de huevos de verificación (humidificada, 37.7° C), campana de flujo laminar, microscopio |
Referencias
- Walker, J. L., et al. Unique precursors for the mesenchymal cells involved in injury response and fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 13730-13735 (2010).
- Friedl, P., Gilmour, D.
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Reimpresiones y permisos
