La aplicación de un sistema de expresión inducible para el Estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con Señalización Intracelular

La virulencia de muchos patógenos Gram-negativas bacterias depende de sistemas de secreción especializados para secuestrar células huésped eucariotas. Las bacterias utilizan estos sistemas de secreción para inyectar proteínas de virulencia bacteriana (efectores) en la célula huésped para modular una variedad de actividades celulares y bioquímicos. El estudio de las proteínas efectoras no sólo ha proporcionado notable penetración en los aspectos fundamentales de huésped / patógeno, sino también en la biología básica de las células eucariotas ^1. La modulación de la apoptosis de las células huésped ha sido demostrado ser un mecanismo de virulencia importante para muchos patógenos intracelulares, y una serie de proteínas efectoras que modulan la apoptosis se han identificado ^2-9. Sin embargo, sus mecanismos moleculares precisos de actividad sigue siendo difícil en muchos casos.

Apoptosis, una forma de muerte celular programada, juega un papel importante en la respuesta inmune a la infección ^10. Dos vías principales que conducen a la apoptosis tienenhan identificado: la orientación de la mitocondria (apoptosis intrínseca) o transducción directa de la señal a través de receptores de muerte celular en la membrana plasmática (apoptosis extrínseca). La vía de la muerte celular intrínseca o mediada por mitocondrias se activa por señales intracelulares e implica la activación de Bax y Bak, dos miembros pro-apoptóticos de la familia Bcl-2. Esta familia se compone de proteínas reguladoras pro-y anti-apoptóticos que controlan la muerte celular ^11-14. La activación de la apoptosis conduce a la oligomerización de Bax y Bak seguidos por subsiguiente permeabilización de la membrana externa mitocondrial, lo que resulta en la liberación del citocromo C en el citoplasma. La liberación del citocromo C inicia la activación de las caspasas efectoras 3 y 7 a través de la activación de la caspasa 9 en el apoptosome ^15. Esto conduce a la proteolisis de sustratos seleccionados que, entre otros, los resultados en la exposición de fosfatidilserina en la superficie celular ¹⁶ y libera una DNasa dedicado que fragmenta chromatin ^17,18.

Con el fin de determinar dónde dentro de la cascada apoptótica una proteína efectora individuo interfiere, un sistema de expresión inducible se empleó ^19. Los sistemas de regulación para la expresión condicional de transgenes han sido una herramienta muy valiosa en el análisis de la función de una proteína dentro de la célula o su importancia para el tejido, órgano y desarrollo del organismo, así como durante la iniciación, progresión y mantenimiento de la enfermedad ^20-23. Típicamente, los sistemas de control inducibles, tales como el sistema Tet ²⁴ empleado aquí, forman una unidad de transcripción artificial (véase la Figura 1). Uno de los componentes es un factor de transcripción diseñados artificialmente llamada tTA (activador de la transcripción dependiente de tetraciclina), formado por la fusión del represor de la transcripción bacteriana TetR ²⁵ a un dominio de proteína de mamífero que media la activación transcripcional o silenciar ^24,26. El segundo componente es un híbridopromotor, denominado TRE (elemento sensible a la tetraciclina), que consiste en un promotor mínimo eucariota, que contiene al menos una caja TATA y un sitio de iniciación de la transcripción, unido a múltiples repeticiones del sitio de unión al ADN cognado para TetR, tetO ^24,25. El tercer componente es el ligando natural de TetR, tetraciclina o uno de sus derivados, tales como anhidrotetraciclina o doxiciclina ^25. Después de la adición de ligando al medio de cultivo, TetR pierde su afinidad por tetO y se disocia de la TRE. Como resultado, la transcripción del gen diana es abolida. La expresión del transgen puede, por lo tanto, ser estrechamente controlada de una manera tiempo y dependiente de la dosis, tanto en cultivos celulares y en animales ^20,23,24. Con tTA, la expresión del transgen se produce constitutivamente, excepto en la presencia de una tetraciclina. Esto puede ser una desventaja en el estudio de proteínas citotóxicas o oncogénicos porque tetraciclina tiene primero que ser eliminado del sistema, antes de expressio transgénn se produce y los efectos de la proteína diana en la célula puede ser monitoreado. Esto puede llevar mucho tiempo y no siempre es completa, especialmente en animales transgénicos ^27. Para abordar esta limitación, se usó un mutante TetR con una respuesta inversa a la presencia de doxiciclina para generar un nuevo factor de transcripción, rtTA (inversa tTA) ^28. Sólo se une a la TRE y, concomitantemente, activa la transcripción en presencia de doxiciclina. Leakiness residual del sistema, es decir., La expresión del transgen en ausencia de factor de transcripción unido a la TRE, originando ya sea (i) a partir de los efectos de posición en un sitio de integración genómica, (ii) de la propia TRE ^29, o (iii) de la no específico de unión de tTA / rtTA ^28, fue abordado mediante la introducción de un silenciador transcripcional adicional, denominado TTS (silenciador transcripcional dependiente de tetraciclina) ³⁰ al sistema. Se forma una red regulador dual junto con rtTA (véase la Figura 1).En ausencia de doxiciclina, TTS se une a TRE y activamente apaga cualquier transcripción restante. En presencia de doxiciclina, TTS se disocia de TRE y ata el rtTA inducir simultáneamente la expresión del gen diana. Esta capa adicional de rigor es a menudo necesario para expresar proteínas citotóxicas altamente activos ^31-34.

Usando este sistema de doble regulador estrechamente controlada, la cascada apoptótica puede iniciarse en una etapa definida que permite el análisis de si la proteína efectora dado puede interferir con la inducción de apoptosis. Este método no sólo se puede utilizar para estudiar la actividad anti-apoptótica de proteínas efectoras bacterianas sino también para la expresión inducible de proteínas pro-apoptóticas o tóxicos, o para la disección de la interferencia con otras vías de señalización.

1. Generación de líneas celulares estables que expresan la proteína de interés

1. Preparar los medios de comunicación mediante la adición de FCS inactivado por calor y 1% de penicilina / estreptomicina al comercialmente disponible Dulbecco medio Eagle modificado (DMEM) suplementado con GlutaMAX-I, el piruvato, y 4,5 g / L de D-glucosa.
2. Cultivar las células HEK293 en medios a 37 ° C en 5% de CO _2. Sub-cultivar células cada tercer día. Retire los medios de comunicación y resuspender las células en 15 ml de medio fresco. Pipeta 1 ml en un nuevo 75 cm ² frasco de cultivo celular y añadir 14 ml de medio.
3. Analizar el número de células utilizando un hemocitómetro.
4. Semilla células HEK293 en una placa de 6 pocillos a una densidad de 2 x 10 ⁵ células por pocillo y se incuban durante 24 horas.
5. Para la transfección utilizar el protocolo proporcionado por el fabricante del reactivo de transfección. Transfectar células con pEGFP-C2 o pEGFP-C2-CAEB utilizando el reactivo de transfección. Antes de su uso, calentar el reag transfecciónent y los medios necesarios para RT. Utilice una proporción de 3: 1 de reactivo de transfección con el ADN.
   1. En detalle, pipeta 1,5 l de reactivo de transfección directamente en 50 l de medio DMEM libre de suero. Para la formación del complejo, una pipeta 0,5 g de ADN que codifica GFP o GFP-CAEB a la mezcla que contiene el reactivo de la transfección y se incuba durante 15 min a TA.
   2. Transfectar células mediante la adición de la mezcla de reacción de una manera gota a gota y se incuba a 37 ° C en 5% de CO ₂ durante 24 horas.
6. Añadir 1 mg / ml de geneticina para la selección de clones GFP-positivas a 37 ° C en 5% de CO _2.
7. Después de 6 días, aislar células individuales mediante citometría de flujo de clasificación en una placa de 96 pocillos que alberga medio y HEK293 sobrenadante en una relación 1: 1. Generar HEK293 sobrenadante de las células HEK293 confluentes cultivadas que se centrifugaron durante 15 min a 4966 x g.
8. Al día siguiente, reemplazar medio de cultivo con medio que contiene 1,50; mg / ml de geneticina. Cambie los medios una vez por semana. Si las células forman una monocapa confluente, transferirlos a una placa de 24 pocillos. Sub-cultivar las células dos veces a la semana en una proporción de 1: 5 en medio que contenía 1,5 mg / ml de geneticina. Por último, analizar el porcentaje de células positivas para GFP mediante análisis de inmunotransferencia y citometría de flujo.

2. Análisis de líneas celulares estables mediante análisis de inmunotransferencia

1. Eliminar el sobrenadante y lavar las células adheridas una vez con PBS caliente. Resuspender las células en 100 l de tampón de muestra 2x Laemmli, el calor durante 5 minutos a 95 ° C y se almacena a -20 ° C.
2. Cargar aproximadamente 4 x 10 ⁴ células por muestra en un gel de SDS-PAGE 12%. Además, la carga de 6 l de una escalera proteína comercial como un marcador de peso molecular. Ejecutar geles en un sistema de electroforesis en gel en un voltaje constante de 180 V durante 45-60 min con tampón de Laemmli 1x.
3. Proteínas Blot a membranas de PVDF (tamaño de poro de 0.45 m) a un voltaje constante de 16 V durante 60 min utilizando una célula de transferencia Semi-Dry Trans-Blot SD.
4. Membranas bloque en 10 ml de leche en polvo desnatada al 5% en PBS / 0,05% de Tween 20 (MPT) para 1 hr a RT.
5. Diluir 4 l de anticuerpo anti-GFP en 4 ml de MPT e incubar las membranas O / N a 4 ° C.
6. Realizar tres etapas de lavado 10 min con 10 ml de PBS / 0,05% de Tween 20.
7. Incubar membranas con 0,8 l de conjugados con peroxidasa de rábano picante anticuerpos secundarios en 4 ml de MPT.
8. Después de 1 h de incubación a TA, lavar las membranas tres veces con PBS / 0,05% de Tween 20 (como se describe en 2.6) y detectar la actividad de peroxidasa de rábano picante con un kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante. Aplicar equipo estándar para el desarrollo de la película para visualizar las bandas de proteínas.

3. Analizar las células utilizando un citómetro de flujo.

1. Resuspender las células en PBS. Utilice células HEK293 como control negativo para ajustar hacia adelante scatter (FSC) y dispersión lateral (SSC), de modo que las células están en escala. Dibuja una puerta en las células vivas mediante la exclusión de dobletes de células, agregados y restos celulares.
2. Ajuste el tubo fotomultiplicador (PMT) de ganancia para que las células no teñidas están en el extremo izquierdo del histograma para el canal FL1 (láser de argón de 488 nm).
3. Para analizar la intensidad de fluorescencia de las células HEK293-GFP y HEK293-GFP-CAEB abrir el histograma del canal FL1 y adquirir 10.000 eventos en la población cerrada.
4. Analizar los datos mediante FACS comerciales de software de análisis.

4. La transfección de la línea celular estable con el sistema de vector de expresión inducible

1. Células de semillas HEK293 que expresan establemente GFP o GFP-CAEB en una placa de 12 pocillos a una densidad de 1 x 10 ⁵ células / pocillo.
2. 19 horas después de la siembra, co-transfectar las células con plásmido regulador y plásmido respuesta sea que codifica Bax o caspasa 3 activada.
   1. Co-transfectar las células HEK293 establescon 100 ng de plásmido regulador pWHE125-P (Figura 2) y 100 ng de los plásmidos de respuesta pWHE655-hBax o pWHE655-revCasp3 (Figura 3) y 0,4 l de polietilenimina.
   2. Preparar el ADN y reactivo de transfección polietilenimina cada uno en 75 l de medio Opti-MEM e incubar durante exactamente 5 min a TA. Para la formación del complejo, incubar ambas mezclas juntos durante 15 min a TA.
3. Añadir la solución de polietilenimina / DNA gota a gota a las células y se incuba a 37 ° C en 5% de CO _2.

5. inducción de la apoptosis

1. 5 horas después de la transfección, inducir la expresión de las proteínas pro-apoptóticas mediante la adición de 1 mg / ml de doxiciclina al medio de cultivo. Se incuban las células durante 18 horas a 37 ° C en 5% de CO _2.

6. Análisis de Host Cell Apoptosis por análisis de inmunotransferencia

1. Inspeccione las células antes de harvesting bajo el microscopio óptico para comprobar la inducción de muerte celular. Las células apoptóticas son detectable por la presencia de cuerpos apoptóticos que rodea la célula moribunda.
2. Eliminar el sobrenadante y lavar las células adheridas una vez con PBS caliente. Resuspender las células en 100 l de tampón de muestra 2x Laemmli, el calor durante 5 minutos a 95 ° C y se almacena a -20 ° C.
3. Cargar aproximadamente 4 x 10 ⁴ células por muestra en un gel de SDS-PAGE 12%. Además, la carga de 6 l de una escalera proteína comercial como un marcador de peso molecular. Ejecutar geles en un sistema de electroforesis en gel en un voltaje constante de 180 V durante 45-60 min con tampón de Laemmli 1x.
4. Proteínas Blot a membranas de PVDF (tamaño de poro de 0,45 micras) en una tensión constante de 16 V durante 60 minutos usando una célula de transferencia semi-seco Trans-Blot SD.
5. Membranas bloque en 10 ml de leche en polvo desnatada al 5% en PBS / 0,05% de Tween 20 (MPT) para 1 hr a RT.
6. Diluir 4 μl de poli anticuerpo anti-escindido ADP-ribosa polimerasa (PARP) en 4 ml de MPT e incubar O / N a 4 ° C.
7. Realizar tres etapas de lavado 10 min con 10 ml de PBS / 0,05% de Tween 20.
8. Incubar membranas con 0,8 rábano anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa mu l diluido en 4 ml MPT.
9. Después de 1 h de incubación a TA, lavar las membranas tres veces con PBS / 0,05% de Tween 20 (como se describe en 6.7) y detectar la actividad de peroxidasa de rábano picante con un kit comercial según el protocolo del fabricante. Aplicar equipo estándar para el desarrollo de la película para visualizar las bandas de proteínas.
10. Retire anticuerpos unidos por 30 minutos de incubación a temperatura ambiente con 7 ml Western Blot Stripping Buffer.
11. Después de tres lavados con PBS / 0,05% de Tween 20 (como se describe en 6.7), sondear las membranas con 4 l de anticuerpo anti-actina en 4 ml de MPT O / N a 4 ° C.
12. Después de tres etapas de lavado con MPT (como se describe en 6.7), se incuban las membranas con 0,8 l de hoanticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa rseradish diluidas en 4 ml de MPT.
13. Después de 1 h de incubación a TA, lavar las membranas tres veces con PBS / 0,05% de Tween 20 (como se describe en 6.7 y detectar la actividad de peroxidasa de rábano picante con un kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante. Aplicar equipo estándar para desarrollo de la película para visualizar las bandas de proteínas.
    Nota: Todas las etapas de incubación se realizaron en un agitador de placas durante el tiempo indicado y la temperatura.

En primer lugar, se establecieron líneas de células HEK293 que expresan establemente la proteína de interés (CAEB) como una proteína GFP-fusión. Como control, también se generaron líneas de células HEK293 que expresan establemente GFP. La expresión de GFP y GFP-CAEB se verificó mediante análisis de inmunotransferencia. El representante de inmunotransferencia (Figura 4A) demuestra la expresión estable y claramente detectable de GFP y GFP-CAEB. Sin embargo, este ensayo no puede determinar si todas las células expresan GFP o GFP-CAEB. Por lo tanto, las líneas de células HEK293 transfectadas de forma estable también se analizaron por citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 4B, más del 90% de las células en las dos líneas celulares expresó GFP. Por lo tanto, estas líneas celulares estables pueden utilizarse para analizar más a fondo la función de CAEB. En el siguiente paso, la actividad anti-apoptótica de CAEB se ensayó por análisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo contra PARP escindida. La escisión proteolítica de PARP nuclear inactiva la actividad de reparación del ADN y es un marcador típico de la termietapas finales de la apoptosis. La escisión de PARP no se detecta en células HEK293-GFP-CAEB HEK293-GFP o, lo que demuestra que ni la expresión de GFP, ni de GFP-CAEB es tóxico para las células. Sin embargo, cuando las células fueron tratadas con estaurosporina, un potente inductor de la apoptosis intrínseca, la escisión de PARP se detectó (Figura 5). Es importante destacar que, las células HEK293-GFP-CAEB exhiben reducen la escisión de PARP, lo que indica la actividad anti-apoptótica de la burnetii tipo IV proteína efectora sistema de secreción de Coxiella CAEB 7.

Para analizar en qué etapa CAEB interfiere con la vía apoptótica, se empleó el sistema Tet-On. En detalle, las células HEK293-GFP o HEK293-GFP-CAEB fueron transfectadas con un plásmido que expresa constitutivamente un regulador dual represor configuración doxiciclina controlado / activador (Figura 2) y un plásmido que codifica respuesta pTRE ya sea de longitud completa Bax humano o la forma activada de caspasa 3 humana, denominado revCasp 3 (La Figura 3). Este sistema está estrechamente regulada, como se demuestra por la falta de escisión de PARP en condiciones no inducir condiciones (Figura 6). La adición de doxiciclina a las células transfectadas dio como resultado la expresión de Bax o revCasp 3. Si CAEB interfiere con la vía apoptótica aguas abajo de Bax, entonces la señal apoptótica generada por la expresión y la posterior activación de Bax debe ser bloqueado por la expresión CAEB. De hecho, las células HEK293 que expresan establemente GFP-CAEB inhibe profundamente la inducción de apoptosis por Bax expresión doxiciclina controlado, mientras que las células HEK293-GFP muestran PARP división obvia. Este resultado indica que CAEB bloquea la inducción de apoptosis aguas abajo de la activación de Bax. A continuación, se analizó si CAEB puede interferir con la activación de la caspasa 3 - un evento tardío en la vía apoptótica. Células HEK293-GFP, así como células HEK293-GFP-CAEB, escisión de PARP exposición (Figura 6), lo que indica que una vez que la caspasa efectora 3 se Activado, CAEB no puede prevenir la apoptosis que se produzcan. Tomados juntos, estos datos demuestran que CAEB actúa entre Bax y caspasa 3 de activación.

Figura 1. Esquema general del sistema regulatorio de tetraciclina. El sistema Tet-On se compone de dos plásmidos diferentes, los plásmidos de regulación y de respuesta. El plásmido regulador codifica la transsilencer Tet-sensible (TTS; círculo relleno) y el transactivador inverso Tet-sensible (rtTA, círculo abierto). Ambas proteínas se expresan constitutivamente bajo el control de la, constitutiva factor de elongación 1 alfa-promotor fuerte (P EF-1a). TTS y rtTA son factores de transcripción quiméricas que consisten en un dominio regulador transcripcional eucariota (silenciador o activador, respectivamente) y un represor de tetraciclina bacteriano (TetR). TetR media la unión del ADN a siete tet (tetO) secuencias en el plásmido respuesta. TetO está situado aguas arriba del promotor de citomegalovirus mínimo inducible (P CMV), formando el elemento Tet-sensible (TRE). En condiciones no inducir, TTS es obligado a TRE prevención de expresión. Después de la adición de doxiciclina (Dox, diamante lleno), rtTA interactúa con Dox conduce a cambios conformacionales y activación. Activado rtTA reemplaza TTS en el plásmido de respuesta, lo que permite la transcripción de los genes diana respectiva Bax y caspasa 3, lo que conduce a la inducción de la apoptosis y muerte celular. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. visión general esquemática del plásmido pWHE125 reguladora. Elementos esenciales para la propagación en el CCBteria, incluyendo un origen de replicación (ori pBR) y un casete de resistencia a los antibióticos contra la ampicilina (Amp R), y para la expresión de los Tet-transregulators, tales como la fuerte, constitutiva inmediata promotor / potenciador temprano del citomegalovirus humano (P / E CMVh), un sitio de unión al ribosoma interno de la polio-virus (PV-IRES) y un poli-sitio desde Simian virus 40 (SV40 poliA) se muestran. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Vista esquemática del plásmido respuesta. Elementos esenciales para la propagación en bacterias, incluyendo un origen de replicación (ori pBR) y un casete de resistencia a los antibióticos (Amp R), y para la expresión inducible en eucariotas, tales como la expressi transgénen casete con el promotor Tet-dependiente mínimo TREtight (P TREtight), el gen de interés humano Bax (hBax) y un sitio poliA de virus Simian 40 (SV40 polyA), se representan. El casete de expresión del transgen está flanqueado por repeticiones directas en tándem de dos copias de la secuencia núcleo aislante HS4 de pollo (núcleo HS4). Además, un casete de resistencia a G418 que consiste en un murino fosfoglicerato quinasa 1 promotor (P mPGK), un gen de resistencia a la neomicina (G418 R) y un sitio de poli timidina quinasa humana (TK poli A) está presente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. HEK293-GFP y HEK293-GFP-CAEB expresan establemente proteínas fluorescentes verdes. (A) lisados ​​de células enteras de HEK293-GFP yCélulas HEK293-GFP-CAEB se inmunotransfirieron para GFP para mostrar la expresión estable. (B) citometría de flujo Representante (FACS) el análisis de las células HEK293-GFP-CAEB HEK293-GFP y se muestra para demostrar la intensidad de la expresión de GFP. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Efectos de la expresión de GFP-CAEB en células HEK293-GFP-CAEB apoptosis inducida por estaurosporina. HEK293-GFP y se trataron con 4 M estaurosporina durante 6 horas para inducir la apoptosis intrínseca. La apoptosis se analizó mediante análisis de inmunotransferencia PARP escindido. PARP división se redujo en células HEK293-GFP-CAEB en comparación con las células HEK293-GFP. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grandede esta cifra.

Figura 6. Uso del sistema de Teton a reducir el punto de acción de CAEB. (A) La apoptosis fue inducida por la expresión de Bax en células HEK293-GFP-CAEB HEK293-GFP y. La apoptosis se analizó mediante análisis de inmunotransferencia PARP escindido. De escisión de PARP se redujo en células HEK293-GFP-CAEB en comparación con las células HEK293-GFP. (B) La apoptosis fue inducida por la expresión de revCasp 3 en células HEK293-GFP-CAEB HEK293-GFP y. La apoptosis se analizó mediante análisis de inmunotransferencia PARP escindido. PARP división fue comparable en células HEK293-GFP-CAEB y HEK293-GFP. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.