La aplicación de un sistema de expresión inducible para el Estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con Señalización Intracelular

Resumen

El método descrito aquí se utiliza para inducir la cascada de señalización apoptótica en pasos definidos con el fin de diseccionar la actividad de una proteína efectora bacteriana antiapoptótica. Este método también se puede utilizar para la expresión inducible de proteínas proapoptóticas o tóxicas, o para diseccionar la interferencia con otras vías de señalización.

Resumen

La técnica presentada aquí permite analizar en qué etapa una proteína diana, o, alternativamente, una molécula pequeña, interactúa con los componentes de una vía de señalización. El método se basa, por un lado, en la expresión inducible de una proteína específica para iniciar un evento de señalización en un paso definido y predeterminado en la cascada de señalización seleccionado. Expresión concomitante, por otro lado, del gen de interés, luego permite al investigador evaluar si la actividad de la proteína diana expresada se encuentra aguas arriba o aguas abajo del evento de señalización iniciada, dependiendo de la lectura de la vía de señalización que se obtiene. Aquí, la cascada apoptótica fue seleccionado como una vía de señalización definido para demostrar la funcionalidad de protocolo. Las bacterias patógenas, tales como Coxiella burnetii, translocación de proteínas efectoras que interfieren con la inducción de la muerte de la célula huésped en la célula huésped para asegurar la supervivencia bacteriana en la célula y para promover sudifusión en el organismo. El C. proteína efectora burnetii CAEB inhibe eficazmente la muerte de la célula huésped después de la inducción de la apoptosis con luz UV o con estaurosporina. Para reducir a la que paso CAEB interfiere con la propagación de la señal apoptótica, proteínas seleccionadas con actividad pro-apoptótica bien caracterizado se expresaron transitoriamente de una manera doxiciclina inducible. Si CAEB actúa aguas arriba de estas proteínas, la apoptosis se procederá sin obstáculos. Si CAEB actúa aguas abajo, se inhibirá la muerte celular. Las proteínas de prueba seleccionadas fueron Bax, que actúa a nivel de la mitocondria, y la caspasa 3, que es la principal proteasa ejecutor. CAEB interfiere con la muerte celular inducida por la expresión de Bax, pero no por la caspasa 3 expresión. CAEB, por lo tanto, interactúa con la cascada apoptótica entre estas dos proteínas.

Introducción

La virulencia de muchos patógenos Gram-negativas bacterias depende de sistemas de secreción especializados para secuestrar células huésped eucariotas. Las bacterias utilizan estos sistemas de secreción para inyectar proteínas de virulencia bacteriana (efectores) en la célula huésped para modular una variedad de actividades celulares y bioquímicos. El estudio de las proteínas efectoras no sólo ha proporcionado notable penetración en los aspectos fundamentales de huésped / patógeno, sino también en la biología básica de las células eucariotas ^1. La modulación de la apoptosis de las células huésped ha sido demostrado ser un mecanismo de virulencia importante ....

Protocolo

1. Generación de líneas celulares estables que expresan la proteína de interés

1. Preparar los medios de comunicación mediante la adición de FCS inactivado por calor y 1% de penicilina / estreptomicina al comercialmente disponible Dulbecco medio Eagle modificado (DMEM) suplementado con GlutaMAX-I, el piruvato, y 4,5 g / L de D-glucosa.
2. Cultivar las células HEK293 en medios a 37 ° C en 5% de CO _2. Sub-cultivar células cada tercer día. Retire los medios de comunicación y resuspender las células en 15 ml de medio fresco. Pipeta 1 ml en un nuevo 75 cm ² frasco de cultivo celular y añadir 14 ml de medio.
3. Analizar el número....

Resultados

En primer lugar, se establecieron líneas de células HEK293 que expresan establemente la proteína de interés (CAEB) como una proteína GFP-fusión. Como control, también se generaron líneas de células HEK293 que expresan establemente GFP. La expresión de GFP y GFP-CAEB se verificó mediante análisis de inmunotransferencia. El representante de inmunotransferencia (Figura 4A) demuestra la expresión estable y claramente detectable de GFP y GFP-CAEB. Sin embargo, este ensayo no puede determinar si todas las cél.......

Discusión

Muchas bacterias patógenas albergan sistemas de secreción para secretar o translocar proteínas efectoras bacterianas en la célula huésped. Estas proteínas efectoras tienen la capacidad de modular los procesos y vías en la célula huésped, permitiendo que las bacterias para sobrevivir y replicarse dentro de su respectivo nicho intracelular. La comprensión de las actividades bioquímicas y los mecanismos moleculares de las proteínas efectoras ayudará a una mejor comprensión de la patogenicidad y puede ayudar a desarrollar n.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tecnologías de vida DMEM		31966-021
FCS	Biochrom	S0115
Tecnologías de vida	de pluma/estreptococo	15140-122
vida	OptiMEM	51985
X-tremeGENE 9	Roche	6365752001
Geneticin	Roth	CP11.3
Polietilenimina	Polyscienes	23966
Doxiciclina	Sigma Aldrich	D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8000EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-Rad	170-3940
PageRuler Escalera de proteínas preteñida	Thermo Scientific	26616
Membrana	PVDFMillipore	IPVH00010
anti-GFP	life technologies	A6455
PARP anti-escisión	BD Bioscience	611038
anti-actina	Sigma Aldrich	A2066
IgG de ratón (H+L)-HRPO	Dianova	111-035-062
IgG de conejo (H+L)-HRPO	Dianova	111-035-045
ECL Sustrato de Western Blotting	Thermo Scientific	32106
Tampón de decapado Western Blot Restore Plus	Thermo Scientific	46428

Tecnologías de