Artículo de método

Visualización inmunohistoquímico de hipocampo Neurona Actividad Después espacial aprendizaje en un modelo de ratón de los trastornos del desarrollo neurológico

DOI:

10.3791/52919

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12 de mayo de 2015

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1Centre for Integrative Biology (CIBIO), University of Trento, 2CNR Neuroscience Institute, Pisa, Italy

En este artículo

Resumen

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Se describe un protocolo de inmunohistoquímica para estudiar el perfil de activación de las neuronas del hipocampo tras la exposición a una tarea de aprendizaje espacial en un modelo de ratón que se caracteriza por déficits cognitivos de origen del desarrollo neurológico. Este protocolo se puede aplicar a ambos modelos genéticos o farmacológicos de ratón caracterizadas por déficits cognitivos.

Resumen

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La inducción de la quinasa extracelular regulada fosforilada (pERK) es una lectura fiable molecular de la activación neuronal de aprendizaje-dependiente. Aquí se describe un protocolo de inmunohistoquímica Perk para estudiar el perfil de la activación de las neuronas del hipocampo tras la exposición a una tarea de aprendizaje espacial en un modelo de ratón que se caracteriza por déficits cognitivos de origen del desarrollo neurológico. En concreto, se utilizó inmunotinción Perk para estudiar la activación neuronal tras laberinto acuático de Morris (MWM, una tarea de aprendizaje hipocampo-dependiente clásica) en Engrailed-2 knockout (En2 - / -) ratones, un modelo de trastornos del espectro autista (TEA). En comparación con el de tipo salvaje (WT) controles, En2 - / - ratones mostraron déficits de aprendizaje espacial significativas en el MWM. Después de MWM, se detectaron diferencias significativas en el número de neuronas Perk-positivas en los subcampos del hipocampo específicas de En2 - / - ratones, en comparación con los animales WT. Por lo tanto, nuestro protocolo puede detectar diferencias en robustamenteneuronas Perk-positivos asociados con el deterioro de aprendizaje hipocampo-dependiente en un modelo de ratón de los TEA. Más en general, nuestro protocolo se puede aplicar a investigar el perfil de activación de las neuronas del hipocampo en ambos modelos genéticos o farmacológicos de ratón caracterizadas por déficits cognitivos.

Introducción

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Trastornos del desarrollo neurológico incluyen un grupo amplio y heterogéneo de trastornos como el síndrome de Down, síndrome de cromosoma X frágil (FXS), el síndrome de Rett, neurofibromatosis, esclerosis tuberosa y ASD, en la que el desarrollo y maduración del sistema nervioso central (SNC) se altera temprana durante el período prenatal 1. Estas disfunciones del desarrollo cerebral pueden causar profundos efectos, toda la vida en la función motora, lenguaje, aprendizaje y proceso de la memoria. Una plétora de factores genéticos y ambientales han sido implicados en la patogénesis de los trastornos del neurodesarrollo durante los últimos años 2,3. Incluso si los mecanismos moleculares que subyacen al fenotipo clínico siguen siendo desconocidos, los hallazgos mencionados anteriormente han permitido el desarrollo de varios modelos de ratón de estos trastornos. Déficits de aprendizaje y memoria se han identificado en un número de estos modelos de ratón, tales como Tsc1 +/-, Tsc2 +/-,Nf1 +/- y En2 - / - ratones 2,4-7. Un reto importante en el campo de los trastornos del desarrollo neurológico es la identificación de los procesos celulares y moleculares que subyacen a la memoria y el aprendizaje de la disfunción. Vías de señalización activadas seleccionados durante el aprendizaje o la memoria pueden inducir la transcripción de genes específicos y en última instancia conducir a la síntesis de novo de proteínas. Genes tempranos inmediatos de activación y de proteínas dependientes (IEGs) modificaciones sinápticas son inducidos rápidamente en las neuronas del cerebro en respuesta a la actividad neuronal y la formación del comportamiento 8,9.

Las deficiencias en las vías de señalización que implican neurofibromina se han asociado con problemas de aprendizaje en los trastornos del desarrollo neurológico. Neurofibromin es el producto del gen NF1, cuya mutación causa neurofibromatosis tipo 1, un síndrome genético complejo caracteriza por tumores del sistema nervioso, de los retardos y de comportamiento de motor y cognitivo DISAbilidades 10. Ratones heterocigotos para eliminación Cf1 restringidas a las neuronas inhibitorias muestran déficits en la fase temprana de la potenciación a largo plazo (LTP), así como el aprendizaje espacial comprometido en MWM 5,11,12. Curiosamente, la deficiencia de NF1 este modelo de ratón conduce a una activación de Ras sobre-señalización en interneuronas inhibidoras durante el aprendizaje, lo que resulta en un aumento de la fosforilación de ERK y finalmente en una mejora anormal de la liberación de GABA a partir de estas neuronas 5.

Basándose en estos hallazgos, la visualización de la actividad neuronal después de tareas de comportamiento representa una manera de reconstruir circuitos específicos implicados en enfermedades del desarrollo neurológico. El protocolo de inmunohistoquímica descrito aquí tiene como objetivo evaluar y cuantificar los niveles de fosforilación de ERK hipocampo siguientes MWM en un modelo de ratón ASD con déficits cognitivos. MWM es ampliamente utilizado para investigar el aprendizaje espacial dependiente del hipocampo y la memoria en roedores 13,14 . Decidimos utilizar la fosforilación de ERK como lectura molecular del aprendizaje hipocampo tarea dependiente, ya que ERK ha demostrado tener un papel esencial en el aprendizaje y la memoria formación 15. Por otra parte, la vía ERK es necesario para dependiente de la experiencia plasticidad en la corteza visual en desarrollo 16. Finalmente, los ratones que carecen de una de las dos isoformas de ERK (ERK2) en el espectáculo CNS marcados anomalías en los comportamientos cognitivos, emocionales y sociales 17, lo que indica que la señalización de ERK podría desempeñar un papel crítico en la patogénesis de los trastornos del neurodesarrollo, tales como ASD.

Utilizamos Engrailed 2 nocaut (En2 - / -) ratones como modelo de trastornos del neurodesarrollo. En2 - / - ratones muestran características anatómicas y de comportamiento "ASD-like", incluyendo la pérdida de interneuronas del cerebro anterior 18, la reducción de la expresión de genes relacionados con el ASD 19, disminución de la sociabilidad, y deterioro de la flexibilidad cognitiva 6,7,20. Learni espacialng y defectos de memoria, como los detectados en MWM, son especialmente robusto en En2 - / - ratones 6,7 y podrían ser relevantes para los deterioros cognitivos observados en pacientes ASD 21. Por otra parte, hemos demostrado que el aprendizaje espacial deteriorada en MWM se asocia con la reducción de expresión neurofibromina y aumentó los niveles pERK en el hilio del En2 - / - ratones adultos 7. Aquí presentamos el protocolo detallado para la caracterización inmunohistoquímica de Perk siguiente MWM en este modelo de ratón TEA.

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Protocolo

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Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con la Directiva de la Comunidad Europea 2010/63 / UE y fueron aprobados por el Ministerio de Salud de Italia.

1. Cuidado de Animales, Vivienda y Tratamiento

  1. Realizar todos los protocolos experimentales con ratones de acuerdo con las directrices de la respectiva cuidado de los animales institucional.
  2. Mantener los animales en un 12 horas de luz / oscuridad ciclo con los alimentos y el agua ad libitum.
  3. Casa de los ratones en grupos de 2-4, en jaulas de policarbonato ratón de tamaño estándar con aserrín y material de cama con cambio semanal.
  4. Use la edad y el sexo, con ajuste ratones, porque la susceptibilidad a la enfermedad puede variar con la edad y el género en diferentes modelos de ratón de los trastornos del neurodesarrollo.
  5. Elija un número adecuado de animales para alcanzar significación estadística (un mínimo de 10 ratones por genotipo para el estudio del comportamiento y 4 ratones por genotipo para el experimento inmunohistoquímica).

2. laberinto acuático de Morris (MWM)

  1. Use un tanque circular (diámetro 100 cm, altura 50 cm).
    1. Coloca algunas señales visuales en los separadores de ambiente de todo el tanque.
    2. Coloque una plataforma de 10 cm de diámetro en el tanque en una ubicación fija en el centro de uno de los cuatro cuadrantes imaginarios. Mantenga la plataforma escondida en el mismo cuadrante para todos los ensayos en todas las sesiones de entrenamiento.
    3. Llenar la piscina con agua del grifo hasta que la plataforma se encuentra a 1 cm por encima de la superficie del agua. Equilibrar la temperatura del agua debe estar cerca de 22 ° C; este paso puede tardar varias horas. Añadir agua caliente para acortar el tiempo necesario para equilibrar la temperatura del agua.
    4. Añadir aproximadamente 1,5-2 L de blanco, la pintura no tóxica para hacer el agua opaca.
  2. Procedimiento Track Adquisición
    1. Configurar el sistema de seguimiento de MWM con cámaras CCD estándar y tarjetas de vídeo. Elegir un sistema de vídeo-seguimiento para monitorear y analizar diversas variables tales como longitud del camino, escalatencia pe, y el tiempo dedicado en cada cuadrante.
    2. Divida la arena en cuatro cuadrantes y ajustar la configuración de detección para garantizar un contraste óptimo entre los animales y el fondo para el seguimiento en directo.
    3. Especifique la región de la plataforma.
    4. Ajuste el tiempo de prueba máxima, 60 seg.
  3. Prueba MWM
    1. Antes de la prueba de comportamiento, permitirá a los ratones un período de adaptación de 20 a 25 min en una zona donde no pueden ver la piscina o claves espaciales.
    2. Capacitar a cada ratón durante 9 días (dos ensayos consecutivos al día, con intervalo de 20 a 30 minutos entre ellos).
    3. Encienda el ordenador y la cámara e iniciar el software del sistema de vídeo-seguimiento.
    4. Tome el ratón por la cola y colocarlo en el agua, con su cabeza apuntando hacia el lado de la piscina, a partir de una de las cuatro posiciones de inicio (norte, sur, este, oeste). Para cada ratón, la posición de inicio debe ser diferente y pseudorandomized entre los ensayos.
    5. Deje la natación del ratón y la búsqueda de la platform por un máximo de 60 segundos. Una vez que el animal llega a la plataforma, permitirá que se quede en la plataforma durante 20 segundos.
    6. Si el ratón no pudo localizar la plataforma dentro de ese tiempo, guiar suavemente el ratón a la plataforma, sujetándolo por la cola y dejar que se quede allí por 20 seg. Una vez que el animal ha completado todos los dos ensayos, secarlo con una toalla y lo puso de nuevo en la jaula.
    7. Cada día del período de entrenamiento, repita el mismo procedimiento (pasos 2.3.4-2.3.6).
    8. Realice la prueba de la sonda en el día 9 después de la última pista de entrenamiento.
    9. Retire la plataforma de la piscina.
    10. Deje la natación del ratón y la búsqueda de la plataforma para un máximo de 60 segundos.
    11. Periódicamente, verifique la temperatura del agua por lo que debe ser la misma (22 ° C) y limpiar la piscina.

3. Preparación de Secciones de perfundidos Animales

  1. Sacrificar a los ratones al final de MWM. Cuatro ratones por genotipo deben ser anestesiados antes de euthanización de acuerdo a las normativas locales e internacionales.
  2. Perfundir el animal transcardially (cortar la derecha auriclewith una tijera para permitir el sangrado e introducir una cánula de mariposa en el ventrículo izquierdo para perfundir) con tampón fosfato salino (PBS) durante 4-5 min, seguido de paraformaldehído al 4% en PBS durante 10-15 min 22.
  3. Diseccionar y post-fijar los cerebros en paraformaldehído al 4% a 4 ° C durante al menos 12 h.
  4. Coloca los cerebros de 50 ml tubos cónicos de poliestireno que contienen 15 ml de 0,02% azida sódica en PBS 0,1 M y se almacena a 4 ° C hasta que sea necesario para cortar.
  5. Corte y retire el cerebelo antes vibratome corte.
  6. Pegue el cerebro en posición vertical con el sitio de corte, utilizando pegamento, sobre la placa de soporte de la vibratome.
  7. Cortar el cerebro en 20-40 micras secciones coronales de espesor, con el fin de serie en todo el hipocampo dorsal, en vibratome apropiado.
  8. Recoger vibratome rebanadas con un pincel y transferir a un 24 placa de múltiples pocillos que contenía 1 ml de 0,1 M PBS para cada pocillo.
  9. Secciones para almacenaje de corto plazo en PBS o largo plazo en 0,02% azida sódica en PBS a 4 ºC (tejido pueden ser utilizados para un máximo de un año).

4. La inmunohistoquímica

  1. Transferencia 3-5 secciones del hipocampo dorsal de cada ratón, en 24 placa de múltiples pocillos que contenía 500 l de 0,1 M PBS para cada pocillo.
  2. Lávese las secciones contenidas en cada pocillo con 500 l de 0,1 M PBS (5 min, 3 veces con agitación suave).
  3. Apagar la actividad de la peroxidasa endógena, incubando secciones en 1% H 2 O 2 en PBS durante 20 min con agitación suave.
  4. Lavar las secciones en PBS 0,1 M con agitación suave (3 x 5 min).
  5. Permeabilización de tejido: incubar las secciones durante 5 min en 0,2% de Triton X-100 en PBS.
  6. Durante los pasos anteriores (4,4; 4,5), haga tampón de bloqueo suficiente (10% de suero de cabra y el 0,1% de Triton-X100 en PBS) durante todo el experimento (number de las secciones x 100 l x 3 pasos).
  7. Nota: El uso de suero de la misma especie en la que el Ab secundario (conjugado con biotina) se hizo.
  8. Evitar la unión no específica del anticuerpo, mediante la incubación de las secciones en tampón de bloqueo (100 l / sección) durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) con agitación suave.
  9. Incubar las secciones de Ab primario (pERK) diluido en tampón de bloqueo, durante la noche a 4 ° C, con agitación suave.
  10. Lavar las secciones en PBS 0,1 M con agitación suave (3 x 5 min).
  11. Incubar con el Ab secundario conjugado con biotina (1: 250) diluido en tampón de bloqueo (el mismo que se utiliza en el paso 4.6) durante 1 hora a RT con agitación suave.
  12. Preparar reactivo ABC, al mismo tiempo, debido a la avidina y biotina requieren por lo menos 30 min a temperatura ambiente a lo complejo.
  13. Preparar el volumen necesario de ABC reactivo de acuerdo con el protocolo de los fabricantes.
  14. Lavar las secciones en PBS 0,1 M con agitación suave (3 x 5 min).
  15. IncubatSecciones E para 45 min a TA con ABC de reactivo.
  16. Lavar las secciones en PBS 0,1 M con agitación suave (3 x 5 min).
  17. Preparar solución de trabajo de DAB, cada etapa que implica DAB debe hacerse en la campana de humos como DAB es carcinógeno y teratógeno.
  18. Transferir la solución de DAB a una nueva placa con una pipeta de transferencia de plástico.
  19. Coloque las secciones en la placa que contiene DAB solución y placa lentamente remolino de trabajo a mano, para permitir la máxima exposición a las secciones.
  20. Monitorear reacción DAB en el microscopio hasta que se desarrolla la señal adecuada (2-5 min).
  21. Detener la reacción con la intensidad de color deseada mediante el lavado del tejido en 0,1 M PBS (3 x 5 min).
  22. Utilice lejía para desactivar cualquier solución de sustrato DAB restante en la campana de humos durante la noche y disponer de él de acuerdo con las directivas de laboratorio.
  23. Mount secciones sobre gelatina recubiertas diapositivas flotando en PBS. Luego secar a temperatura ambiente al menos 3-4 horas.
  24. Deshidratar la secuencialmente secciones en 50%, 70%, 95%y etanol al 100% durante 2 min cada uno, y claro en 100% de xileno durante 5 min.
  25. Cubreobjetos utilizando medio de montaje y dejar en la campana de humos que se seque durante la noche.

Conde 5. celular

  1. Recuento de células Perk-positivos, de tres a cinco secciones a nivel del hipocampo dorsal deben ser analizados por animal.
  2. Adquirir varias imágenes de campo brillante de cada sección con una ampliación de 200X utilizando un microscopio adecuado, y luego ensamblarlos usando un software de procesamiento de imágenes.
  3. Realizar el recuento de células en las imágenes de mosaico tiff convertida utilizando el software libre ImageJ.
  4. Recuento de células Perk-manchado en la capa de células hilio y gránulos durante dos o tres cajas de conteo de 100 × 100 m cada uno.
  5. Las densidades celulares se expresaron como el número de células marcadas por ventana de recuento (100 × 100 micras).
  6. Realizar análisis estadístico para evaluar diferencias significativas entre genotipos. Esto se puede lograr con la t de Studentprueba o ANOVA seguido por el test post hoc apropiado utilizando softwares comerciales. Ajuste el nivel de significación estadística de p <0,05.

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Resultados

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El protocolo descrito aquí fue diseñado para visualizar, por inmunohistoquímica, la expresión de un marcador específico de la actividad de las neuronas del hipocampo después de MWM en un modelo de ratón de trastornos del neurodesarrollo. Todos los datos experimentales que se muestran en este documento se tomaron de nuestro reciente trabajo 7. Se utilizaron obtenidos de apareamientos heterocigotos; camada de la misma edad de adultos (peso = 25-35 g 3-5 meses de edad) - Hombres y mujeres WT y En2

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Discusión

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Aquí, ofrecemos un protocolo de inmunohistoquímica Perk por revelar la activación neuronal después de MWM en En2 - / - ratones, un modelo de ratón de los trastornos del desarrollo neurológico. Se detectaron niveles disminuidos de Perk en el subcampo CA3 del En2 - / - mutantes en comparación con WT. A diferencia de lo observado en el subcampo CA3, un aumento general de las neuronas Perk-positivo fue lugar detectarse tanto en hilio y GCL de En2 - / - ratones en comparación con WT. Una posi...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Queremos dar las gracias al personal administrativo del CIBIO (Universidad de Trento) y CNR Instituto de Neurociencias para obtener ayuda. Giovanni Provenzano es apoyado por una beca postdoctoral de la Fundación Veronesi (Milán, Italia). Este trabajo fue financiado por el Ministerio Italiano de Universidad e Investigación (PRIN 2008 subvención # 200894SYW2_002 y PRIN 2010-2011 subvención # 2010N8PBAA_002 a YB), Universidad de Trento (CIBIO subvención inicial a YB) y la Fundación Teletón (subvención # GGP13034 a YB).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
EthoVision XT 8Noldus Information TechnologyEsta plataforma de software no es un requisito – hay muchos otros softwares de comportamiento en el mercado.
Pintura al templeGiotto - EmpresaBlanco y líquido, no tóxico. Se utiliza para preparar agua opaca en el laberinto acuático de Morris.
VibratomeLeicaVT1200Se pueden utilizar modelos equivalentes de otras compañías.
Placa de 24 pocillosSigmaCLS3524
100% etanolFisher ScientificA406-20Se utiliza para hacer un gradiente de etanol para la deshidratación antes del montaje de la corredera.
XilenoVWR66004-950Tóxico - para usar bajo el capó. Cambie el xileno cada mes según el uso.
Azida de sodioSigma  S2002
PBSSigmaP3813-10PAK
ddH2O
Triton X-100Sigma T-8787
Peróxido de hidrógenoSigmaH1009-100ML
Suero de cabra normalAbcamG9023-10ML
kit ABC Vectastain Vector LaboratoriesPK-6100Añadir en un volumen de 5 ml de PBS 2 gotas de reactivo A, mezclar y luego añadir 2 gotas de reactivo B y mezclar.
Sustrato de peroxidasa DABVector LaboratoriesSK-4100Añadir en un volumen de 5 ml ddH2O: 2 gotas de solución de material tampón y mezclar; 4 gotas de DAB y mezclar; 2 gotas de H2O2 y mezclar.
[header]
de anticuerpos pERK 4370Dilución 1:500
Cabra Biotinilada Anticuerpo IgG Anti-ConejoLaboratorios VectoresBA-1000 Dilución 1:250
Toboganes SuperFrost Carl Roth1879
CubreobjetosFisher12-548-B
DPXSigma 317616Medio de montaje para correderas. Se puede utilizar un medio de montaje equivalente.
Microscopio  Zeiss puede utilizar un microscopio equivalentea Axio Imager.M2
Adobe PhotoshopAdobe Systems, San José, CAPara ensamblar imágenes.
ImageJ SoftwareNational Institute of HealthEl software gratuito se puede descargar en http://rsb.info.nih.gov/ij/
SigmaPlot 11.0Systat Software Inc. (EE. UU.)Se pueden utilizar softwares equivalentes para el análisis estadístico.
Prism 6GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, EE. UU.)Se pueden utilizar softwares equivalentes para el análisis estadístico.
del Grupo Fila Tecnologías de Señalización Celular Se .

Referencias

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